火龍果莖多糖的超高壓提取及抗氧化活性研究

郭淼　宋江峰　王傳凱

摘 要 為研究火龍果莖多糖的超高壓提取工藝及抗氧化活性。在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken設計和響應面分析方法，確定超高壓提取的最優工藝，并從清除ABTS自由基和DPPH自由基能力方面來評價火龍果莖多糖的體外抗氧化能力。結果表明，火龍果莖多糖的超高壓提取的最佳工藝條件為：液固比10 ∶ 1（mL ∶ g）、超高壓壓力300 MPa、超高壓時間4 min。在此工藝條件下多糖得率為（2.83±0.02）%。火龍果莖對ABTS自由基和DPPH自由基具有清除作用，對ABTS自由基和DPPH自由基的清除率IC50分別為濃度為4.3 mg/mL和5.5 mg/mL時。

關鍵詞 火龍果莖；多糖；超高壓；抗氧化

中圖分類號 TS201.1 文獻標識碼 A

Abstract To study the technology of ultra high pressure extraction and analysis its antioxidannt activity of polysaccharides from pulp pitaya stem， on the basis of single factor experiments， the optimal processing conditions were determined by means of response surface analysis and Box-Behnken design. The results showed that the optimum extraction conditions of the polysaccharides from pulp pitaya stem were as follows： liquid to solid ratio10 ∶ 1（mL/g）， pressure 300 MPa and extraction time 4min. Under the conditions， the extraction yield of the polysaccharides from pulp pitaya stem reached（2.83±0.02）%. The polysaccharides from pulp pitaya stem had the ABTS and DPPH scavenging activity. The mass concentration of IC50 was 4.3 mg/mL and 5.5 mg/mL， respectively. This study could provide useful references for the development and exploitation of the polysaccharides from pulp pitaya stem.

Key words pulp pitaya stem； polysaccharides； ultra high pressure； antioxidant

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.030

火龍果（Hylocerus undatus），為仙人掌科量天尺屬植物，其營養豐富，含有多糖、黃酮、皂苷、植物甾醇、黃酮等活性成分[1-3]，近年來，在我國南部區域海南省、廣西自治區等大量栽種。火龍果采摘后的莖桿為火龍果莖，富含多糖等活性成分[4-6]，目前往往作為廢棄物丟棄，不僅污染環境，還造成資源浪費。因此，對火龍果莖多糖進行提取利用，可提高火龍果種植的經濟效益，對火龍果的開發利用具有重要意義。

目前，火龍果莖多糖的提取方法為熱水浸提法，其提取時間長，提取溫度高，得率低；何聰芬等[7]采用熱水浸提法提取火龍果莖多糖，提取得率僅為0.96%。近年來，一些研究者研究強化多糖提取的方法。超高壓提取作為一種新型的提取方法，在多糖的提取上得到研究，王新新等[8]采用超高壓提取瓜蔞多糖，Bai等[9]采用超高壓提取龍眼多糖，但采用超高壓提取火龍果莖多糖尚未見報道，對其抗氧化活性也缺乏研究。因此，本實驗在單因素試驗基礎上，采用響應面法優化超高壓提取火龍果莖多糖的最佳工藝參數，同時對其進行抗氧化活性研究，以期為火龍果莖的開發利用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為‘黔果2號火龍果莖，2015年11月采自海口市郊，采摘后清洗、置冰箱中冷藏備用；D-葡萄糖、苯酚、濃硫酸來自北京譜析科技有限公司；DPPH、ABTS來自美國sigma公司，以上試劑均為分析純。

751-GD紫外可見光分光光度計（上海分析儀器總廠）、RE-52AA型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）、UHP900×2-Z超高壓處理裝置（包頭科發公司）。

1.2 方法

1.2.1 超高壓提取火龍果莖多糖 稱取一定量的火龍果莖，切碎，加入不同體積純水，裝入聚乙烯塑料袋，混合均勻后真空封口，將包裝后的塑料袋放入超高壓裝置的工作介質中，在設定壓力下超高壓處理一定時間后，取出，提取液在4 000 r/min離心20 min，上清液真空濃縮后，加入無水乙醇，使乙醇濃度達到85%，然后放在4 ℃的冰箱中過夜，移去上層上清液，將下層沉淀冷凍干燥，即為火龍果莖粗多糖。

1.2.2 多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[10-11]。

1.2.3 超高壓提取火龍果莖多糖工藝條件的優化

以多糖的得率為指標，采用單因素法，以液固比（5 ∶ 1、10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1）（mL ∶ g）、超高壓壓力（100、200、300、400 MPa）（0.1 MPa作為對照）、和超高壓處理時間（2、3、4、5、6 min）為影響因素，考察其對多糖得率的影響。在單因素實驗基礎上，采用Box-Behnken設計，選擇液固比、超高壓壓力和超高壓處理時間為自變量，以多糖的得率為響應值，利用Design-Expert 8.0.5b軟件進行響應曲面分析，優化提取條件，因素與水平表見表1。

1.2.4 清除ABTS自由基能力測定 采用WANG等方法并進行適當調整[12]，將7 mmol/L的ABTS與2.45 mmol/L的過硫酸鉀混合，放在暗處16 h，得到ABTS自由基離子；在734 nm下將離子溶液的吸光值調整為0.700±0.02，30 ℃下平衡30 min；然后將2.0 mL ABTS離子液和0.2 mL待測樣品在室溫混合均勻，反應20 min后，于734 nm處測定吸光值，ABTS自由基清除能力C1為：

1.2.5 DPPH自由基清除活性 采用WANG等方法并進行適當調整[12]，將3 mL 0.1 mmol/L DPPH（95%乙醇配成），加入2 mL待測樣品，在室溫下避光保持30 min后，采用517 nm測定吸光值。按下式計算DPPH自由基清除率C2（%）。

1.2.6 數據處理 所有實驗重復3次，實驗數據表示為mean±S，采用SPSS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 液固比對火龍果莖多糖得率的影響 不同液固比對火龍果莖多糖得率的影響結果如圖1所示，液固比在5 ∶ 1～15 ∶ 1之間時，多糖得率隨溶劑用量的增加而迅速提高，液料比達到15 ∶ 1后，得率變化不顯著（p>0.05）。因此液固比以15 ∶ 1（mL ∶ g）為宜。

2.1.2 超高壓壓力對火龍果莖多糖得率的影響

不同超高壓壓力對火龍果莖多糖得率的影響結果如圖2所示，隨著超高壓壓力的增加，超高壓壓力對細胞壁的破碎作用增強，火龍果莖多糖溶出速率增大，得率逐漸增加，超高壓壓力過300 MPa時，得率變化不顯著（p>0.05）。可能是該壓力已經將細胞完全破壞。因此超高壓壓力以300 MPa為宜。

2.1.3 不同超高壓時間對火龍果莖多糖得率的影響

不同超高壓時間對火龍果莖多糖得率的影響如圖3所示，在2～4 min時，多糖得率隨著時間的增加而迅速提高，達到4 min后，得率隨后有所下降。其原因可能是隨著超高壓時間的增加，超高壓下細胞破碎度逐漸增大，過多碎片阻礙多糖溶出，導致得率下降。

2.2 響應面優化超高壓提取工藝

2.2.1 響應面實驗設計與結果 在單因素實驗的基礎上，以火龍果莖多糖得率為指標，液固比（A）、超高壓壓力（B）和超高壓時間（C）為因素，進行三因素三水平17個實驗點的響應面試驗，實驗設計及結果見表2。

運用Design Expert 8.0.5b數軟件對表2實驗結果進行多元回歸擬合，得火龍果莖多糖得率與各因素的二次多項式回歸模型為：Y=2.84+0.048A+0.026B-0.079C-0.075AC+0.017BC-0.16A2-0.39B2-0.13C2回歸模型進行方差分析和回歸系數顯著性檢驗結果見表3，從表3可以看出，該二次回歸方程模型極顯著（p<0.000 1），模型的相關系數R2=0.928 6，表明該模型可以解釋92.86%的響應值Y的變化。回歸方程的相關系數（R2=0.928 6， Adj-R2=0.968 7，Pred-R2=0.824 6）及變異系數CV（2.71%）均表明模型方程能夠較好地反映真實的試驗值。 該方程與實際情況擬合很好，較好地反映了多糖得率與液料比、超高壓壓力300 MPa、超高壓時間的關系；模型一次項B對響應值Y影響顯著（p<0.05），二次項對響應值Y影響都極顯著（p<0.01），說明分析結果可靠；模型交互作用不顯著。根據F值大小，可知各因素對火龍果莖多糖得率影響的程度依次是超高壓時間>液料比>超高壓壓力。

響應曲面圖見圖4。從圖中可以看出，2個參數之間的相互作用對得率影響的響應面分析圖為山丘曲面時，特征值為正值，均有極大值存在；而等高線均為橢圓形，表示兩兩相互作用顯著。

2.2.2 驗證實驗 運用Design Expert 8.0.5b軟件對實驗結果進行優化分析，確定最佳提取條件為：液固比10 ∶ 1（mL ∶ g）、超高壓壓力300 MPa、超高壓時間4 min，在該提取條件下，預測火龍果莖多糖得率可達到2.84%。采用上述優化條件進行3次驗證實驗，火龍果莖多糖得率實測值為（2.83±0.02）%，表明實測值與預測值基本吻合，該模型能較好的預測超高壓提取火龍果莖多糖得率。

2.2.3 與傳統熱水浸提法的對比 按文獻報道的傳統熱水浸提法進行提取火龍果莖多糖[6]，火龍果莖多糖的工藝條件為：液料比20 ∶ 1、溫度80 ℃、提取時間4 h，提取3次，在此條件下，火龍果莖多糖得率為 1.02%。在本研究所得最佳的工藝條件下，火龍果莖多糖得率為 2.84%，不僅比傳統熱水浸提法得率提高2.8倍，且提取時間由4 h減少為4 min。說明該方法不僅得率高，且提取時間短，可有效地應用火龍果莖多糖的提取。

2.3 超高壓提取火龍果莖多糖抗氧化實驗

2.3.1 ABTS自由基清除率 火龍果莖多糖對ABTS自由基清除率的測定結果見圖5。由圖5可知，超高壓提取和常規熱水提取的火龍果莖多糖對ABTS自由基的清除率隨樣品濃度升高而增大；但相對于同濃度的Vc溶液相對較弱，超高壓提取的火龍果莖多糖對ABTS自由基清除率IC50的濃度為4.3 mg/mL，常規熱水提取的火龍果莖多糖對ABTS自由基清除率IC50的濃度為4.4 mg/mL。二者相差不顯著。

2.3.2 DPPH自由基清除率 火龍果莖多糖對 DPPH自由基清除率的測定結果見圖6。由圖6可知，超高壓提取和常規熱水提取的火龍果莖多糖對DPPH自由基的清除率隨樣品濃度升高而增大；但相對于同濃度的Vc溶液相對較弱，火龍果莖多糖對DPPH自由基清除率IC50的濃度為5.5 mg/mL。常規熱水提取的火龍果莖多糖對DPPH自由基清除率IC50的濃度為5.9 mg/mL，二者相差不顯著。

3 討論

目前，傳統火龍果莖多糖采用傳統熱水浸提法，提取溫度80 ℃、提取時間需要4 h，火龍果莖多糖得率僅為1.02%。而本研究采用超高壓提取工藝提取火龍果莖多糖，提取溶劑仍為水，但采用超高壓處理強化提取過程，不僅提取得率高，而且時間短，通過單因素和響應面優化結果得到多糖提取的優化條件為液料比10 ∶ 1（mL ∶ g）、超高壓壓力300 MPa、超高壓時間4 min。在此工藝條件下多糖得率為（2.83±0.02）%。超高壓提取之所以具有較高的提取得率和較短的提取時間，是因為在超高壓下，火龍果莖中的細胞被高壓作用后導致細胞快速破裂，破裂的細胞中的多糖得以容易釋放。壓力越高，細胞越容易破壞，但當壓力達到300 MPa后，細胞已經破壞完全，因此，繼續增加壓力，細胞也不再破裂，導致得率不再增加[13-14]；在相同的壓力下，壓力維持時間越長，細胞越容易破壞，但當時間達到一定數值后，細胞已經破壞完全，因此，繼續增加時間，細胞也不再破裂，得率不再增加。此外，根據傳質理論，加壓處理能夠細胞的滲透性增加，同時，根據相變理論，生物活性成分的溶解度隨著壓力增加而增加，因此超高壓處理加快了傳質過程[15]。

許多植物多糖均具有較強的抗氧化活性，本研究發現火龍果莖對ABTS自由基和DPPH自由基具有清除作用，對ABTS自由基和DPPH自由基的清除率IC50分別為濃度為4.3 mg/mL和5.5 mg/mL時。表明火龍果莖多糖也具有抗氧化作用。但目前對于火龍果莖多糖的研究尚處于初級階段，后續需要對其結構鑒定和藥理性質進行進一步研究，為龍果莖多糖開發提供技術支持。

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