基于轉錄組的荔枝ARF基因家族的鑒定及表達分析

董晨 魏永贊 王弋 鄭雪文 李偉才

摘 要 生長素反應因子（Auxin Response Factors，ARFs）是調節生長素表達的轉錄因子響應基因，ARF基因在植物中大多由多基因家族組成。基于轉錄組數據，通過生物信息學方法對荔枝ARF基因進行鑒定，并分析其理化性質、亞細胞定位、保守基序、系統進化以及基因的表達模式。在荔枝中鑒定出21個ARF基因，其編碼的蛋白質含有53～1 117個氨基酸，分子量約為6.112～123.872 ku，等電點為4.21～9.45。亞細胞定位預測結果顯示21個ARF均定位于細胞核。LcARFs基因家族具有相對保守的結構，即包含1個保守的B3 DNA結構域、ARF結構域和Aux/IAA結構域。進化樹分析表明荔枝ARF蛋白分為5個亞家族。21個荔枝ARF基因在花穗發育過程中有明顯不同的表達規律。該結果為進一步深入研究荔枝ARF基因家族的功能奠定了基礎。

關鍵詞 荔枝；生長素反應因子；基因家族；生物信息分析；表達分析

中圖分類號 S667.1 文獻標識碼 A

Transcriptome-wide Identification and Expression Profiling of the Auxin Response Factor（ARF）Gene Family in Litchi chinensis Sonn.

DONG Chen， WEI Yongzan， WANG Yi， ZHENG Xuewen， LI Weicai*

Institute of South Subtropical Corp Research， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory

of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract Auxin Response Factors（ARFs）are the transcription factors that regulate the expression of auxin responsive genes. The ARF genes are composed by a large multigene family in plants. The study was based on the data of litchi transcriptome data， the basic physical and chemical characters， subcellular location， protein conserved domain， evolutionary relationship and expression patterns of litchi ARF genes family were analyzed by the bioinformatics methods. Twenty-one ARF genes were identified in litchi. The predicted litchi ARF gene family members encode proteins ranged from 53 to 1 117 amino acid residues （aa）in length， and relative molecular weight varied from 6.112 to 123.872 ku， isoelectric point（pI）in the range of 4.21 to 9.45.In addition， subcellular localization analysis showed that all of the LcARF proteins were located in the nucleus. Sequence analysis based on the sequence of litchi ARF indicates that it contains 3 relatively conservative domains（B3 domain， Auxin-resp domain and Aux-IAA domain）. Phylogenetic analysis revealed that LcARF gene family was divided into five groups（group I～group V）. The expression patterns of ARF gene were different in different developmental stages. The results laid a foundation for further study of the function of the litchi ARF gene family.

Key words Litchi chinensis Sonn.； ARF； gene family； bioinformation analysis； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.018

生長素在植物的生長發育過程中發揮著重要的作用，例如側根形成、頂端優勢、向性反應、植物葉芽和果實發育[1]。生長素反應因子（Auxin response factor， ARF）是生長素信號通路中的重要轉錄因子，通過直接與生長素反應元件（AuxRE，TGTCTC）直接結合來調節生長素反應基因的轉錄。通常ARF 蛋白包含3個獨特的保守結構域：保守的N-末端的B3 DNA結合結構域（B3 domain），可變中間結構域為激活結構域（AD）或抑制結構域（RD），C-末端是二聚作用結構域CTD[2]。N-末端的B3 DNA結合結構域可以特異性地靶向生長素反應基因的啟動子中的AuxRE元件，可變中間結構域基于其氨基酸殘基的組成，決定ARF是發揮轉錄激活作用還是抑制作用，C-末端結構域參與蛋白質-蛋白質相互作用，介導ARFs之間的同二聚化及ARF和Aux/IAA之間的蛋白的異二聚化。ARF基因家族參與調節植物生長發育以及植物對多重信號的反應轉導通路，在葉片的衰老、維管組織形成、子葉發育、花發育及果實成熟等植物生長發育過程中具有重要作用。自從第1個ARF（AtARF1）基因從擬南芥中克隆以來，近年來越來越多的ARF基因在多種不同的植物中被預測或鑒定出來，包括擬南芥[3]、水稻[4]、玉米[5]、谷子[6]、大豆[7]、番茄[8]、黃瓜[9]、菜心[10]、香蕉[11]、葡萄[12]、甜橙[13]、苜蓿[14]、毛果楊[15]、巨桉[16]等。但目前關于荔枝ARF研究鮮見報道，劉興地等[17]成功克隆了1個與無核荔枝胚珠敗育相關的生長素反應因子基因（ARF），而在轉錄組層面分析荔枝ARF基因家族則未見報道。

本研究基于課題組妃子笑荔枝不同花穗發育時期的轉錄組測序數據，在轉錄組水平上對ARF基因家族進行鑒定和生物信息學分析，分析烯效唑處理花穗和對照花穗21個LcARF在花穗發育不同時期的表達規律，為日后進一步研究荔枝ARF基因功能提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

妃子笑荔枝種植于中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所荔枝龍眼示范果園，選擇樹齡及長勢相近的妃子笑6株，在花穗長18 cm時用50 μg/mL的5%烯效唑處理花穗，CK不做任何處理，3個生物學重復，分別在初花期、盛花期、謝花期采集對照和處理的妃子笑花穗，用于轉錄組測序。

1.2 方法

1.2.1 數據來源、基因鑒定與分析 荔枝轉錄組數據由本課題組測序獲得（數據未發表），在對照和烯效唑處理不同花穗發育時期共拼接組裝了48 844個unigenes。模式植物擬南芥、水稻的ARF基因序列下載于植物轉錄因子數據庫（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn）和Phytozome11基因組數據庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html），將其作為探針序列，利用本地Blast軟件在荔枝轉錄組數據中進行blast搜索比對。同時，利用關鍵詞“auxin response factor”和“ARF”進行直接檢索。去除重復序列后，利用SMART對序列保守結構域進行鑒定，并刪除不含ARF基因家族特征結構域的基因。

1.2.2 基本理化性質及保守結構域分析 利用在線軟件ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析預測荔枝ARF的蛋白序列的分子量、等電點、不穩定系數、脂肪指數和疏水性等基本的理化性質。利用在線軟件Plant-mPLoc Server（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）分析荔枝ARF蛋白亞細胞定位。

利用MEME4.0（http：//meme.nbcr.net/meme/）分析荔枝ARF家族蛋白的保守基序， 基序的大數目設置為20， 基序長度設為6～200個氨基酸。運用在線軟件SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對得到的保守基序進行功能注釋，并且參照擬南芥和水稻的命名模式進行命名。

1.2.3 系統進化關系分析 利用多重序列比對軟件Clustal X 1.83對荔枝、擬南芥和水稻的所有ARF蛋白序列進行序列比對計算，比對結果進一步通過 MEGA6.0軟件構建系統進化樹，系統發育進化樹生成采用鄰接法（neighbor joining，NJ），參數設置： 使用neighbor-joining法則的P-距離（P-distance）模型構建， 選擇了成對刪除（pairwise deletion）空位（gap）的選項，Bootstrap method取值1 000。

1.2.4 基因家族在花穗調控下的表達特征分析

利用荔枝轉錄組測序數據分析ARF基因的表達特征。轉錄組數據包含妃子笑荔枝烯效唑處理和對照花穗發育過程中的3個時期（初花期，盛花期，謝花期）的基因表達數據。以FPKM值表示轉錄本豐度，通過對數據均一化處理，利用Heml工具做熱圖。

2 結果與分析

2.1 荔枝ARF基因家族的鑒定

通過對轉錄組數據庫的本地blast比對檢索和關鍵詞搜素，共獲得40條ARF序列，通過SMART對保守結構域的篩選最終得到21條荔枝ARF蛋白序列。為了方便研究，按照轉錄組中的基因ID大小前后順序統一為荔枝ARF編號（LcARF1～21），見表1。可以看出從轉錄組分離的到的21個ARF基因大小從162 bp（LcARF21）～3 354 bp（LcARF1），對應所編碼的氨基酸數分布在53～1 117 aa。預測的理論分子量大小范圍在6.112～123.871 ku之間；等電點大小范圍在4.21～9.45之間，其中15個LcARF等電點小于7，顯酸性，6個LcARF等電點大于7，顯堿性，LcARF蛋白平均等電點小于7，表明ARF為弱酸性，在酸性的亞細胞環境中發揮作用。不穩定指數分析發現3個LcARF蛋白（7， 19，21）不穩定指數小于40，為穩定蛋白，其余均為不穩定蛋白。亞細胞定位分析表明所有的LcARF蛋白均定位于細胞核。以上結果分析ARF蛋白的基本理化特性可見LcARF蛋白無論從氨基酸序列的長度還是蛋白的特性變化都有很大的差異，表明ARF基因家族蛋白具有不同特性。

利用SMART軟件對LcARF基因家族B3 domain、Auxin-resp domain、AUX-IAA domain進行分析，結果發現，LcARF基因家族中LcARF1/2/10/14/15/16/17/20同時含有3個結構域，占基因家族總數的38.1%；LcARF3/4/5/6/11/12/18含有B3 domain、Auxin-resp domain 2個結構域，占基因家族總數的33.3%；而LcARF7/9/10僅含有B3 domain，LcARF19僅含有AUX-IAA domain（圖1）。荔枝ARF基因家族不同保守結構域的位置信息見表1。

2.2 LcARF蛋白的保守基序分析

通過在線軟件MEME分析LcARF蛋白中的保守基序，結果如圖2、3所示。LcARF基因家族中預測含有20個保守基序，ARF基因家族成員之間所包含的保守基序數目及種類存在一定的差異。除了AtARF23、LcARF7/8/19/21不含保守Motif 1外，其他均含有motif 1。相比Motif 1，Motif 2在LcARF基因家族中有8個成員不含該基序，Motif 3在LcARF基因家族中有5個成員不含該基序。Motif 4 出現15次，motif 5 17次；motif 6 16次；motif 7 17次；motif 8 16次；motif 9 11次；motif 10 12次；motif 11 14次；motif 12 9次；motif 13 15次；motif 14 12次；motif 15 1次；motif 16 1次；motif 17 10次；motif 18 4次；motif 19 8次；motif 20 4次。結果表明出現頻率較高的motif為ARF結構域中非常重要的保守基序。對于出現頻率較低的motif保守基序，通過Smart在線分析關于其功能的相關信息目前未知，有待日后進一步深入研究。

2.3 ARF蛋白的進化關系分析

為了進一步了解荔枝ARF基因家族各成員之間的進化關系以及生物學功能的相關性，對鑒定的21個荔枝ARF基因家族成員及模式植物擬南芥、水稻ARF基因家族成員構建系統發育樹（圖4）。系統發育分析結果表明：21個荔枝ARF可以劃分為5個亞家族，其中GroupⅠ含有LcARF基因家族成員6個，占基因家族總數的28.57%；GroupⅡ含有LcARF基因家族成員10個，占基因家族總數的47.62%；GroupⅢ～Ⅴ分別含有1、2、2個。進化關系較進的LcARF在氨基酸長度和蛋白結構組成相似，如LcARF2和LcARF10。荔枝ARF和擬南芥ARF在進化上親緣較關系較近，和水稻關系較遠。

2.4 荔枝ARF基因家族的表達分析

利用妃子笑荔枝（對照和烯效唑處理花穗發育的不同時期）的RNA-Seq轉錄組數據庫（數據未發表），找到候選的21個ARF基因對應轉錄本的RPKM值，通過對RPKM值取對數值轉換，利用Heml熱圖軟件作熱圖（圖5）。結果顯示，在對照和處理花穗中至少在花期的某1個檢測到21個LcARF基因的表達，但表達豐度不同；其中LcARF2和LcARF10在對照及處理花穗不同發育時期表達量均較強，而LcARF6、LcARF7、LcARF13、LcARF19和LcARF21表達量較低。進化關系較近的例如LcARF2和LcARF10以及LcARF19和LcARF21表達量也相似，表明這些基因間具有相似的生物學功能。在花穗發育的不同階段，LcARF基因在對照和處理中大部分表達量下調，其中對照LcARF有9個基因下調（LcARF1/2/3/4/9/10/13/14/20），烯效唑處理有14個基因下調（LcARF1/2/3/4/7/8/9/10/11/14/15/16/18/20），對照下調的基因在烯效唑處理后表達量也下調。對照和處理中LcARF17表達特征為升-降的趨勢，在第2個階段盛花期表達量較高，推測在盛花期發揮重要作用。花穗發育的3個不同時期大多數LcARFs表達趨勢為逐漸下調，與前人研究荔枝花期內源激素IAA含量逐漸下降一致。其中LcARF2和LcARF10表達量較高，推測其在生長素合成途徑中發揮重要的生物學作用。

3 討論

荔枝是起源于我國南方的亞熱帶名貴水果，我國荔枝栽培歷史悠久，種質資源極其豐富，栽培面積和產量均居世界首位。‘妃子笑具有花穗長、花量大、花期長的特點，導致因花穗發育和開放消耗大量營養而導致坐果率低甚至不結實的問題。荔枝花穗發育與內源激素關系密切，生長素作為最早發現的植物激素，其生理作用廣泛，影響細胞的分裂、伸長和分化。

近年來，隨著測序技術的飛速發展，越來越多物種全基因組測序完成。目前ARF轉錄因子已在多個物種的基因組水平上得以鑒定，ARF基因家族成員在不同的物種中存在很大的差異。其中，大豆中ARF基因家族成員最多， 為51個[7]；香蕉[11]、毛果楊[15]、玉米[5]、菜心[10]、水稻[4]、蒺藜苜蓿[14]、擬南芥[3]、番茄[8]、葡萄[18]、甜橙[13]、黃瓜[9]和巨桉[16]基因家族成員分別為47、39、31、31、25、24、23、21、19、19、18和17個。本研究基于荔枝轉錄組數據，共鑒定了21個ARF基因。通過分析荔枝ARF基因家族蛋白保守結構域發現，荔枝ARF基因家族包含典型的保守結構域B3 domain、Auxin-resp domain、AUX-IAA domain，這與擬南芥[3]、水稻[4]、玉米[5]、香蕉[11]等ARF基因家族關于蛋白保守結構域的研究結果相似。通過對荔枝ARF基因家族的系統進化分析發現，LcARF基因家族的21個家族成員劃分為5個不同的亞家族，進化分組與前人對ARF家族分組的研究結果一致[3，19]。同一亞家族中，不同ARF蛋白成員間在氨基酸序列的大小相似、蛋白結構相近、表達趨勢也相似；說明進化關系較進的具有相似的生物學功能。

本研究基于妃子笑荔枝花穗不同發育時期轉錄組數據庫鑒定分析了LcARF基因家族，并對其蛋白的基本理化性質、亞細胞定位、蛋白保守結構域、保守基序、系統進化，以及轉錄組基因表達特征進行了全面的分析，為進一步研究荔枝ARF的生物學功能奠定堅實的基礎。

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