防治木薯細菌性枯萎病的生防菌株篩選和防效測定

鄭麗 張海鵬 陳陽 劉孟浩 宋艷培 江紹鋒 林江 高賽超 何時雨 覃新導

摘 要 從木薯8個不同生境分離到298株細菌，測定其產酶、次生代謝物和頡頏活性，結果表明，產蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶和生長素的菌株和比例分別為160（53.69%）、57（19.13%）、11（3.69%）和150（50.34%），產嗜鐵素菌株最多203個，比例達68.12%；產幾丁質酶的菌株最少7株，比例僅為2.35%；其中，9株菌株對木薯細菌性枯萎病菌具有頡頏活性，比例為3.02%。通過賦值選擇88個得分較高的菌株，對其16S rRNA測序及ARDRA-PCR和BOX-PCR聚類分析，發現可分成21個簇，且每個簇的種群豐度較高。優選11個菌株進行日光溫室大棚盆栽防效測定，其中，HWY-3-1防效為100%，防效在60%以上的菌株有DBS-5（85.96%）、HS-4-3（82.88%）、DHWP-1（79.37%）、HWYT-3-2（77.88%）、HWS-4-3（77.84%）、DHNS-3-5（65.34%）、DHWR-5-1（61.83%），和對照防效相比，差異顯著；進一步選擇5個防效較好的潛力菌株測定其田間防效，結果顯示，HWY-3-1（Bacillus pumilus）平均防效為38.11%，與對照的防效存在顯著差異。試驗篩選策略可行，初步找到1株對CBB防效較穩定的生防菌株Bacillus pumilus。

關鍵詞 木薯細菌性枯萎病；分離和篩選；頡頏；聚類分析；生防效果

中圖分類號 S436.421.1 文獻標識碼 A

Selection and Identification of Biocontrol Agents Against

Cassava Blight Bacteria

ZHENG Li1，2， ZHANG Haipeng2， CHEN Yang4，LIU Menghao3， SONG Yanpei3，

JIANG Shaofeng2， LIN Jiang4， GAO Saichao4， HE Shiyu1， QIN Xindao1 *

1 Guangzhou Experimental， Station Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510140， China

2 College of Agriculture， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642， China

3 College of Materials and Energy， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642， China

4 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract 298 bacterial isolates were recovered from eight different microenvironments of field-grown cassava plants. of that， 160（53.69%）expressed protease， 57（19.13%）produced cellulase， 7（2.35%）expressed chitinase， and 203（68.12%）secreted siderophores； 11（3.69%）produced glucanase， 150（50.34%）expressed IAA， and only 9（3.02%）representative isolates were for in vitro antagonism. ARDRA and identification of antagonistic bacteria identified 21 distinct groups（G1-21）with the similarity coefficient of 50% among the 298 isolates， BOX-PCR fingerprint analysis revealed that isolates in different ARDRA groups had dissimilar genotypes. Eleven representative isolates were evaluated for their efficacy against cassava blight bacterial mildew caused by Xanthomonas axonopodis pv. Manihotis in the greenhouse， the isolates showed biocontrol efficacy ranging from 44.14% to 100%. Eight of them（HWY-3-1（100%）， DBS-5（85.96%）， HS-4-3（82.88%）， DHWP-1（79.37%）， HWYT-3-2（77.88%）， HWS-4-3（77.84%）， DHNS-3-5（65.34%）， DHWR-5-1（61.83%）attained the efficacy over 60%. HWYT-3-2 and HNR-3-7 significantly suppressed the disease at 30 dpt， and HWYT-3-2 provided significant disease protection from 30-40 dpt， the average bio control efficiency was 38.11%. The strategy of the study was feasible， and found one strains HWYT-3-2 Bacillus pumilus of BCAs against CBB control.

Key words Cassava bacterial blight； selection and identification； antagonism activity； cluster analyse； bicontrol efficiency

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.023

木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科木薯屬灌木狀多年生作物，是我國熱區重要的經濟作物，其塊根被廣泛應用于食品加工、變性淀粉和生物能源等產業之中。近年來，我國木薯栽培面積一直保持在40萬hm2以上，年產鮮薯900萬t左右[1]。

由地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis，簡稱Xam）引起的木薯細菌性枯萎病（Cassava bacterial blight，簡稱CBB）是一種毀滅性病害[2]，廣泛發生于亞洲、非洲和美洲的木薯產區。在非洲和南美洲，病害發生后所造成的木薯產量損失為12%～90%，嚴重時可導致毀種絕收[3]。在我國，該病最先在臺灣地區發生流行，造成產量損失達30%，淀粉出粉率減少40%左右。2007～2009年，中國熱帶農業科學院對我國木薯主產區病害普查結果表明，該病在我國海南、云南和廣西、廣東等省份普遍發生，是當前木薯生產中的主要病害，嚴重影響相關產業的發展[4]。

目前，學者就木薯細菌性枯萎病抗病植株篩選和化學防控已開展了廣泛的研究[5-8]，但防治效果的持續性和穩定性問題依然突出。生物防治因其綠色、健康以及與原生態的相容性已成為CBB防治研究的熱點。而關于如何能獲得防效穩定的生防菌株，則顯得至關重要。本研究重點在從木薯不同生境分離到頡頏細菌，采取相關策略進行賦值評估，初步尋找到有效生防菌株，開展溫室、大田防效測定，獲得優質生防菌株，為后續研究其生防機理等內容奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

取樣地點：樣本于2014年8月份采集于廣東省湛江遂溪某木薯園。

病原菌來源：本研究室保存的病原菌，于2013年采集于廣東湛江遂溪某木薯地，分離于木薯發病葉片和莖稈，純化、保存，通過比對菌落形態、16s RNA測序分析，鑒定為地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis，簡稱Xam）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和菌株分離 樣本采集：CBB發病地塊和非發病地塊。每塊地分成4個小區，每個小區至少有250 m2，每個小區的樣本由5個重復混合而成。土壤取樣時，深度為0～15 cm，面積約1 m2。采用五點采樣法，每點間隔至少10 m。每點3株健康植株連同根圍土一并收集。采集后的樣品迅速裝入寫好編號的塑料袋中帶回實驗室進行分離。參考Morris等[9]的方法取樣：A. 無病害地塊的健康植株；B. 無病害地塊的健康植株根圍土；C. 無病害地塊的根際土；D. 病害地塊的健康植株；E. 病害地塊的病株（病株上的健康部位葉片）；F. 病害地塊健康植株的根圍土；G. 病害地塊染病植株的根圍土；H. 病害地塊的根際土。以及另一地塊（吳川唐綴，新地，第一年種植木薯）的健康葉片及其莖稈的中空部分。

外生細菌分離[10]：取3 g樣品，放入滅菌的三角瓶中，加27 mL無菌的0.85% NaCl和滅菌玻璃珠，于搖床上150 r/min振蕩30 min后，靜置5 min，得到10-1稀釋液，依次制備成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液。分別取10-4、10-5、10-6三個梯度的稀釋液100 μL涂在R2A培養基（R2A培養基（1 L）：酵母粉0.5 g，酪蛋白胨0.25 g，肉蛋白胨0.25 g，水解酪蛋白0.5 g，葡萄糖0.5 g，淀粉0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g，磷酸氫二鉀0.3 g，水合硫酸鎂0.024 g，瓊脂15 g，pH=7.2）上，每個梯度3個重復，30 ℃培養48 h。

內生細菌分離[10]：分別取樣品若干，用1%的次氯酸鈉浸泡5 min，70%酒精浸泡1～2 min，無菌水清洗3次（取最后1次清洗的溶液100 μL涂于R2A平板上，若48 h后無菌生長則認為表面消毒干凈，無菌）。其他同外生菌的分離方法。

選菌落數在30～300個的平板，計數，挑取平板上不同大小、形態的菌落分離、純化，40%甘油保存于-70 ℃超低溫冰箱中，備用。

1.2.2 產酶和代謝產物活性測定

（1）蛋白酶活性測定。參照Yang等[10]的方法，挑取處于生長旺盛期的菌株接種于蛋白培養基平板上（A：脫脂奶粉6.4 g，溶于240 mL水中，121 ℃滅菌1 min；B：瓊脂6.4 g，定容至240 mL，121 ℃滅菌20 min，A與B分別滅菌后混合），30 ℃培養3 d，觀察透明圈且測量內徑和外徑，4個技術重復，3次試驗平行重復，下同。

（2）幾丁質酶活性測定。參照Roberts等[11]的方法，制備好膠體狀幾丁質，將頡頏細菌接種在以膠體狀幾丁質為唯一碳源的Chi-Ayers培養基平板（NH4H2PO4 1.0 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，膠體狀幾丁質1%（w/V）定容至1 000 mL，pH=7.0，瓊脂20 g），30 ℃培養3 d，觀察透明圈且測量內徑和外徑。

（3）β-1，3-葡聚糖酶活性的檢測。參照楊威[12]的方法，將頡頏細菌接種在葡聚糖平板上（β-1，3-葡聚糖0.1 g，TSB 0.4 g，瓊脂1.6 g，4 g/L的剛果紅1 mL，定容至100 mL），30 ℃培養48 h，觀察透明圈且測量內徑和外徑。

（4）纖維素酶活性的檢測。參照Ghose[13]的方法，把準備好的菌株接到纖維素酶活性測定平板（蛋白胨10 g，酵母粉10 g，羧甲基纖維素鈉10 g，氯化鈉5 g，磷酸二氫鉀1 g，瓊脂18 g，定容至1 000 mL，pH=7.0），30 ℃培養48 h后，用1 g/L的剛果紅染1 h后，倒掉染液后，用1 mol/L的NaCl浸泡1 h。觀察透明圈的有無且測量其內徑和外徑。

（5）產嗜鐵素活性的檢測。參照Shin等[14]的方法，將A，B液混合倒平板，并將準備好的菌株接于該平板上[A：1，60.5 mg CAS（鉻天青S）溶于50 mL去離子水；2，10 mL三價鐵溶液（1 mmol/L FeCl3·6H2O，10 mmol/L鹽酸為溶劑）；3，72.9 mg HDTMA溶于40 mL去離子水。上述3個溶液混合定容至100 mL，pH調至中性，121 ℃滅菌20 min。B：30.24 g Pipes加入900 mL Waker agar培養基，12 g 50%（w/V）的NaOH溶液將培養基pH調至6.8，121 ℃滅菌20 min]，30 ℃培養3 d，觀察透明圈且測量內徑和外徑。

（6）產吲哚乙酸測定。參照Sawar等[15]的方法，取二甲氨基苯甲醛8 g溶于760 mL 95%酒精和160 mL濃鹽酸中，制得埃利希氏試劑。以1%胰蛋白胨水（pH=7.2～7.6）為培養液，2 d后將培養好的菌液加入3～5 mL埃利希氏試劑，觀察液面是否變紅。

1.2.3 平板頡頏活性測定 參照楊威[12]的方法，將病原菌接種到LB培養液中，28 ℃、200 r/min、22 h震蕩培養，制成種子液，以5%的接種量接種到LB液中，28 ℃，200 r/min，24 h培養成發酵液。隨后將病原菌發酵液以5%的比例接種到LB固體培養基中（待LB固體培養基冷卻至37～45 ℃加入此比例的病原菌菌液），制成含病原菌的平板，每皿加入15 mL。

隨后將預先培養好的細菌培養液分別吸取8 μL于滅菌濾紙片（直徑為5 mm）上，以LB培養液和滅菌水為空白對照。28 ℃培養48～72 h，觀察并測量抑菌圈大小。每個處理4個技術重復，3個試驗重復。

1.2.4 賦值評估 本賦值系統包括如下指標：平板頡頏活性、蛋白酶活性、幾丁質酶活性、纖維素酶活性、葡聚糖酶活性以及產嗜鐵素、吲哚乙酸活性。其中賦值方法如下[16]：平板頡頏活性根據頡頏圈（頡頏圈外徑與內徑之差）的大小分為四級：0，無頡頏活性；1，頡頏圈在1～3 mm之間（含3 mm）；2，頡頏圈在3～6 mm之間（含6 mm）；3，頡頏圈大于6 mm。賦予的值分別為0、1、2、3。水解酶和產生嗜鐵素賦值方法：0，無水解圈；1，水解圈在1～3 mm之間（含3 mm）；2，水解圈在3～6 mm之間（含6 mm）；3，水解圈大于6 mm，依次賦值對應為0、1、2、3。吲哚乙酸活性根據液面顏色變化賦值如下：0，不變色；1，淺紅色；2，紅色；3，深紅色。

1.2.5 指紋圖譜和16S rRNA測序和聚類分析

利用細菌基因組試劑盒（Shanghai SBS Genetech Co. Ltd）提取細菌基因DNA后，參考楊明明等[17]的方法，分別進行擴增核糖體DNA限制性酶切分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis， ARDRA）和BOX-PCR擴增。利用軟件對所得圖譜進行聚類分析。

試劑盒（賽百盛公司）提取細菌基因組后，參考Yang等[10]的方法從基因組中擴增出16S rRNA基因片段的PCR擴增。所得產物在華大基因測序分析，并將相關序列在NCBI上進行比對。

1.2.6 防效測定 （1）溫室試驗測定。試驗品種為“南植199”。本試驗設置12個處理：A. 108 CFU/mL菌劑（11個）發酵液10倍稀釋液；B. 對照：同等稀釋倍數的LB溶液。每處理設4個重復，每個重復3棵苗。菌劑和對照處理組每株苗噴施30 mL，對照組用等量LB和滅菌水以相同方法噴霧；以上各處理組在噴霧時均加入終濃度為0.01%的表面活性劑Tween-20。噴施5 d后以剪葉的方式接種濃度為107 CFU/mL的病原菌[18]。接種病原菌21、23、25、28 d分別，調查病害嚴重度并計算生防效果。

病害調查方法：0級為葉片無病斑；1級為病斑占葉面積1/10以下；3級為病斑占葉面積 1/10～1/4；5級為病斑占葉面積1/4～1/2；7級為病斑占葉面積1/2～3/4；9 級為病斑占葉面積 3/4以上。

病情指數和生防效果統計計算方法：病情指數=[∑（病級數×該病級植株數）/（最高病級×總植株數）]×100；生防效果=[（對照病情指數-處理組病情指數）/對照病害嚴重度]×100。

（2）田間防效試驗測定。試驗品種為“南植199”。本試驗設置6個處理：A. 108 CFU/mL菌劑（5個）發酵液稀釋10倍；B. 對照：同等稀釋倍數的LB溶液。每處理設4個重復，每個重復3棵苗。菌劑、病原菌接種、調查方法、統計病害方法同溫室大棚盆栽防效測定相同。接種病原菌25、29、31、35 d分別，調查病害嚴重度并計算生防效果。采用隨機區組設計。

1.3 數據處理

在Microsoft Excel中對平板的抑菌圈、酶活、病害嚴重度、防效等數據進行基礎處理。用分析軟件DPS v7.05進行數據分析，實驗結果為平均值±SD，通過One-Way ANOVA Analysis、LSD Test（p<0.05）進行方差和顯著水平分析。

2 結果與分析

2.1 各生境細菌的分離結果

本實驗樣品主要來自木薯幾個不同生境，針對每個生境植物組織的根莖葉進行樣本的分析處理，如表1。隨后對這些生境處理中細菌種群密度和數量進行分析，發現存在差異；種群密度最高的為DDWR（病害地塊的病株上健康部位-根-外生菌），達1.2×107 CFU/g FW；最低的為DHNY（病害地塊的病株上健康部位-葉-內生菌），為1×104 CFU/g FW；從HWR（無病害地塊的健康植株-根-外生菌）中分離到細菌的比例最高，為7.72%，DHNY（病害地塊的健康植株-葉-內生菌）和HNYT（吳川唐綴健株葉片-內生葉）中則分離菌株數量較少，分別為1.34%和0.34%（表1）。總趨勢為，外圍細菌的種群密度和數量均高于內生菌株；根圍菌株的高于葉片和莖部；而土壤中分離菌株的豐度則高于植株（葉、莖、根）。

2.2 細菌產水解酶、次生代謝物及頡頏活性結果

將分離的298株細菌就其產酶活性和產次生代謝產物進行分析，結果顯示，其中160株具蛋白酶活性，7株具幾丁質酶活性，203株產嗜鐵素，57株產纖維素酶，11株產葡聚糖酶，150株細菌能產生長素。其中產嗜鐵素的菌株最多，占總菌株數的68.12%，產幾丁質酶的菌株最少，僅為2.35%，產蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶和生長素的細菌比例分別為53.69%、19.13%、3.69%和50.34%（表2）。

頡頏活性測定結果表明，9株細菌具有頡頏活性，占總菌株數的3.02%，這些菌株分別來自HWS、HWY、HWR、DHW和SHNR五種生境，其中來自HWS的分離菌株中具有頡頏活性的菌株比例最高，達18.8%，其次為HWY中分離得到的頡頏菌株，占14.3%。在HWR、DHW和SHNR生境中則分別為8.7%、7.1%和7.7%（表2）。

對298株生防潛力菌株（BCAs，Biological Control Agents）的酶活性、次生代謝物和平板頡頏活性進行賦值，根據得分及菌株分離生境等綜合因素，選擇其中88株BCAs進行16s RNA測序和指紋圖譜分析。

2.3 聚類分析和賦值評估

測序和ARDRA、BOX-PCR圖譜分析，88個菌株分別來自以下21個簇（屬）：G1葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）、G2微球菌屬（Micrococcus sp.）、G3泛菌屬（Pantoea sp.）、G4黃單孢菌屬（Xanthomonas sp.）、G5假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、G6不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）、G7埃希氏菌屬（Escherichia sp.）、G8短桿菌屬（Brevibacterium sp.）、G9克洛諾斯氏菌屬（Cronobacte sp.）、G10芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、G11類諾卡氏菌屬（Nocardioidaceae sp.）、G12類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）、G13微小桿菌屬（Exiguobacterium sp.）、G14蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）、G15短小桿菌屬（Curtobacterium sp.）、G16金黃桿菌屬（Chryseobacterium sp.）、G17肺炎桿菌屬（Klebsiella sp.）、G18腸桿菌屬（Enterobacteria sp.）、G19伯克霍爾德菌屬（Burkholderia sp.）、G20小細菌屬（Microbacterium sp.）、G21叢毛單胞菌屬（Comamonas sp.）。進一步分析，發現21個屬（簇）的細菌所占比例存在差異（圖1），其中以以G10芽孢桿菌屬的豐度最好，所占比例為26.14%，其次是G18和19（9.09%），G20、G16和G17（7.95%），最低的為G1＼2＼7＼8＼9＼11＼12＼13＼14（1.14%）。

對88株頡頏細菌進行綜合賦值評估，結果見表3，得分范圍為1～13分，得分最高菌株為HNR3-7和HYW3-9，得分分別分布如下：1分（16個，18.18%），2分（6個，6.82%），3分（7個，7.95%），4分（7個，7.95%），5分（15個，13.64%），6分（12個，13.64%），7分（8個，9.09%），8分（1個，1.14%），9分（3個，3.41%），10分（7個，7.95%），11分（3個，3.41%），12分（1個，1.14%），13分（2個，2.27%）。大多菌株得分分布在5～7分。

結合以上綜合數據，選擇其中11個菌株進行溫室盆栽防效測定。這11個菌株得分情況分別如下（表3），得分最高為HNR-3-7，可產生纖維素酶、蛋白酶，具有較好的嗜鐵素分解能力，且有平板頡頏作用；得分中等且有較好頡頏作用的菌株有HWY-3-1、HWS-4-3；這3個菌株還來自同一個屬（G10），經菌株鑒定分析，它們均屬于Bacillus sp.。來自另一簇的菌株HWYT-3-2，得分最低，為2，僅產生嗜鐵素，鑒定為Brevibacterium sp.

可見，選擇的這11個待開展溫室盆栽防效測定的菌株，種類較為豐富，且產酶種類存在差異，平板頡頏效果亦不相同。

2.4 防效測定

溫室接種病原菌后21～28 d調查病害情況（表4），發現防效較好菌株為HWY-3-1、HWYT-3-2、DBS-5，防效在100%～64.40%間。對21～28 d的防效進行平均系數分析，結果顯示，HWY-3-1防效為100%，植株并沒發病，和對照相比，差異顯著；防效在60%以上的菌株有DBS-5（85.96%）、HS-4-3（82.88%）、DHWP-1（79.37%）、HWYT-3-2（77.88%）、HWS-4-3（77.84%）、DHNS-3-5（65.34%）、DHWR-5-1（61.83%），和對照的防效相比，差異也顯著；防效較差的菌株為HNR-3-7（0.17%）和HNR-4-3（44.14%），均為Bacillus amyloliquefaciens，它們和對照間防效的差異不也顯著。

根據溫室防效結果，選擇其中5株細菌測定其田間防效作用（表5），來自不同生境，分別為HWY-3-1（Bacillus pumilus）、HNR-3-7（Bacillus amyloliquefaciens）、DHNS-3-5（Curtobacterium citreum）、HS-4-3（Enterobacter sp.）、DBS-5（Microbacterium arborescens），其中HNR-3-7的盆栽防效較差，但因其具有較好的纖維素降解和糖化水平[19]，故也作為田間防效的測試菌株。

在田間，接種病原菌后25 d調查，結果顯示，防效較好菌株為HWY-3-1、HNR-3-7和DBS-5，防效在74.20%～36.42%。對25～35 d的防效進行平均系數分析，結果顯示，HWY-3-1平均防效為38.11%，與對照的防效存在顯著差異；HNR-3-7（25.31%）、DBS-5（7.90%）和HS-4-3（19.73%）防效和對照存在差異，但不顯著。

3 討論

木薯細菌性枯萎病對木薯產業具有毀滅性危害，嚴重威脅木薯的產量及品質，尋找有效防治該病害的措施尤為重要。生物防治中以菌防菌，成為一種發展趨勢，對我國農業可持續發展具有巨大意義[20-21]。其中利用有益微生物調控植物病害具有可持續性且對環境友好[22-23]。生物防治首要任務是優質的潛在生防菌株分離、篩選。目前，大部分篩選策略多是基于離體條件下菌株對病原菌的頡頏活性開展[24]。但平板具有較好頡頏活性的菌株，大約1%的菌株能在溫室實驗中表現生防效果，而這個比例到了田間會更少[10]。因此，篩選策略是生物防治面臨的難點。

生防菌株對病害的控制一般是多種機理綜合作用的結果，如營養競爭，主要是鐵離子的競爭；生態位的競爭，主要是定殖效應影響微生態群落多樣性；產生抑菌物質；誘導植物抗病體系。在篩選過程中，一般首先測定菌株頡頏活性，再測定頡頏活性較好菌株酶活性，必然會忽略很多無頡頏活性但可能具有較好酶活性的潛力菌株，而它們可能可誘導植物抗性。此外，由于分離方法的局限性，分離中不可避免存在重復菌株。通過ARDRA和BOX指紋圖譜分析并結合16s RNA測序分析，從遺傳學角度上進一步優化分析分離菌株，盡可能有效去除重復菌株[12]。本研究中，我們建立一套針對CBB生防菌株篩選系統，統籌頡頏和酶活性以及指紋圖譜分析數據，采取賦值評估，優選潛在生防菌株，測定生防效果。通過溫室盆栽和田間防效結果證明了我們假設的這套篩選系統的可行性。來自3個不同簇的菌株HWY-3-1（G10）、HS-4-3（G18）和 DBS-5（G20），溫室防效依次為100%、82.88%和 85.96%；賦值得分依次為7、3、6，其中HWY-3-1可產生嗜鐵素和蛋白酶以及具有平板頡頏活性；HS-4-3則可產生葡聚糖酶和IAA，DBS-5可產生嗜鐵素、蛋白酶和纖維素酶活性。來自同一簇G10的菌株HWY-3-1、HWS-4-3、HNR-3-7、HS-4-7、DHWP-1，賦值分別為7、10、13、10、6，防效依次為100%、77.84%、61.83%、82.88% 和79.37%，可產生嗜鐵素和蛋白酶。在此基礎上，從同一簇菌株中優選還具有頡頏活性的HWY-3-1測定田間防效，表現穩定防效。田間測試的5個菌株，3個菌株無平板頡頏活性，田間防效表現一般，但防效低于有頡頏活性的菌株HWY-3-1和 HNR-3-7。在溫室防效測試中，還具有頡頏活性菌株HWY-3-1（100%）和HWS-4-3（77.84%），其防效和無頡頏活性菌株防效HS-4-3（82.88%）和DBS-5（85.96%），差異不顯著。由此可見，頡頏活性和酶活性在生防潛力菌株篩選中，同等重要。

芽孢桿菌和假單胞類細菌是生防細菌的最大家族，而前者更是防治真菌、細菌病害的優選對象。生防細菌發揮抗菌作用的機理主要包括產生抗生物質、產生胞外酶如幾丁質酶、纖維素酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶等來抑制病原物的生長、與病原物競爭營養如產生嗜鐵素、與病原物競爭空間位點、誘導植物產生抗病性[25-28]。本研究從木薯多個生境分離到298株頡頏細菌，豐度較好，可分為21個簇；經過測序分析，芽孢桿菌所占比例較大，有Bacillus pumilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus subtilis等。298個菌株產生水解酶活性比例不同，其中以產生蛋白酶活性的菌株比例最高，為53.69%；產生嗜鐵素和生長素IAA的菌株比例分別高達68.12%和50.34%。對298個菌株的平板頡頏效能、產酶活性和代謝能力進行賦值，每個生境選擇出至少1個菌株，從中篩選得分較高的88株細菌進行聚類分析和測序分析，挑選11個綜合賦值評估較高效的菌株開展溫室盆栽防效實驗，發現其中賦值得分較高的菌株溫室防效較高；優選5株不同種的細菌，測定其田間防效，平均防效均高于對照組，但低于溫室盆栽防效。導致這種結果出現的重要原因之一可能是因為在田間使用菌劑過程中菌劑的生態環境遠遠復雜于理想的溫室條件；但本研究的有效生防菌HWY-3-1仍表現出38.11%的平均防效，在CBB發病起初，該菌株防效達到74.20%；該菌株具有較好的平板頡頏效果以及產生嗜鐵素和蛋白酶的活性，后期還發現該菌株可在木薯葉片較好定殖，能影響葉片的微生物群落結構多樣性（Zheng et al，unpublished）。

也有相關研究表明，從根圍土中分離的生防潛力菌株其防效可能更持久和穩定，鄭麗等[29]在研究黃瓜霜霉病的生物防控中發現，篩選的PGPR菌來自健康或發病植株的根圍土或者葉圍，推測根圍土和葉圍可能是生防菌分離的優選。在本研究中，從不同生境分離生防潛力菌株，如健康或發病植株的根圍土、根、莖、葉的內生菌和外生菌；酶活性、頡頏和防效數據表明，葉圍（HWY-3-1）和根圍土（HS-4-3）是生防菌分離較好的來源（表2～5）。產生蛋白酶活性比例最高的生境為根內（HNR，84.60%），幾丁質酶的為莖內（DDNS，14.30%）、嗜鐵素的為莖圍（DHWS，92.90），纖維素酶的莖內（DHNS，62.50%），β-1，3-葡聚糖酶的為根圍土（HS，42.90），IAA的為根圍（DDWR，88.90%）；9株具有頡頏活性菌株分離的生境為葉圍（HWY，14.3%）、莖圍（HWS，8.8%）、根圍（HWR，8.7%），土壤（DHWS，7.1%）、根內（HNR，7.7%）。可見，生防潛力細菌的多樣性，也為獲得優質生防菌提供了重要的基礎。

目前，報道防治CBB的藥劑有治農菌和中生菌素，防效分別為71.39%和64.32%；其次是高營鏈霉素和大生，校正防效分別為57.41%和52.83%；殺毒礬和春雷霉素的防效分別是35.77%和29.37%[18]，其中，陳奕鵬報道有內生生防菌株類芽孢桿菌屬[30]，與研究中發現的生防細菌HWY-3-1（Bacillus pumilus）防效相似。其中DHNS-3-5（Curtobacterium citreum）、HS-4-3（Enterobacter sp.）、DBS-5（Microbacterium arborescens）也可作為后期聯合混配生防菌劑的材料。

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