酵母DV10發酵低醇度椰子水的動力學研究

張觀飛 陳衛軍 陳文學 陳榮豪 陳樸森 陳海明

摘 要 用酵母DV10發酵成熟椰子水并研究發酵過程中菌體濃度、底物濃度和產物濃度等變量隨發酵時間的變化規律。應用Logistic方程和Leudeking-Piret方程建立了低醇度椰子水發酵過程中菌體生長、底物消耗和產物生成動力學模型，并對動力學擬合方程一階求導，求出其發酵過程中菌種增長速率、酒精生成速率和底物消耗速率。方差分析結果表明：3個模型的擬合度分別為0.994、0.997、0.997，理論值和實驗值的誤差平均值分別為4.75%、4.36%和4.42%。因此，3個模型均可很好地闡明酵母DV10發酵低醇度椰子水過程的動態變化。

關鍵詞 低醇度椰子水；發酵；動力學模型；非線性擬合；發酵速率

中圖分類號 S667.4 文獻標識碼 A

Fermentation Kinetics of Low Alcoholic Coconut Water

ZHANG Guanfei， CHEN Weijun， CHEN Wenxue， CHEN Ronghao，

CHEN Pusen， CHEN Haiming*

College of Food Science and Technology， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract In this paper， coconut water was fermented by the yeast strain DV10 to study the changing law between concentrations of cell， substrate and production and fermentation time. The kinetic models of yeast growth， alcohol production and sugar consumption were established on the basis of Logistic and Leudeking-Piret equations， and the rates of them were calculated by solving the first derivative of their corresponding equations. According to the results of variance analysis， the fitting degree between the predictive value of kinetic models and experimental data were high（0.994， 0.997， and 0.997， respectively）， and average errors were less than 5%（4.75%， 4.36%， and 4.42%， respectively）， indicating that these models can clarify the dynamic changes of fermentation processes well.

Key words Low alcoholic coconut water； fermentation； kinetic model； non-linear fitting； fermentation rate

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.026

椰子水（Coconut water，CW）是存在于椰子果實腔內的一種天然果汁，富含糖類、氨基酸、維他命和礦物質等多種營養成分，口感清涼，具有解渴降暑、消腫利尿、調節體內電介質平衡等多種功效，深受消費者的喜愛[1-5]。然而，椰子加工主要以椰肉為原料，作為副產物的椰子水常被當作廢棄物丟棄，不僅造成了大量的資源浪費，還嚴重污染了環境，據不完全統計，我國椰子加工業每年可產生副產物椰子水近8億升，泰國每年高達20萬噸的椰子水被浪費，全球范圍內，每年產生的椰子水副產物高達250億升[6-9]。且隨著椰子肉需求量逐漸增大，尤其是椰子汁產業的快速發展，椰子水的浪費量也在逐年遞增。

發酵動力學是研究發酵過程中微生物生長代謝與各環境因子之間的相互作用，并隨時間變化規律的一門學科。微生物發酵是由多種物質參與的復雜代謝過程的綜合作用結果，微生物反應的動力學方程必須由數學模擬得到。目前，經過微生物生理學家和生化工程學家的大量模擬試驗和反復的驗證修正，提出了許多數學模型。根據培養液中的細胞濃度在特定環境條件下的最大值，常用Logistic方程[10]描述菌體生長動力學；根據酵母的酒精生成與自身生長部分偶聯型關系，常選擇Luedeking-Piret方程[11]描述酒精生成動力學；根據底物消耗速率主要取決于細胞生長速率、酒精生成速率和底物維持能耗的速率，常選擇Luedeking-Piret方程描述底物消耗動力學。

發酵飲料是近年來的研究熱點，具有降低膽固醇、抑菌和抗癌等功效[12-15]，通過發酵的方式改善椰子水品質也是拓寬椰子水應用范圍的一個途徑。發酵過程中的動力學研究可以直觀反映菌體生長、底物消耗和產物生成的動態變化過程，且酵母發酵的動力學研究方法成熟、體系完整。因此，本文選用發酵能力較強的釀酒酵母DV10對成熟的椰子水進行發酵，在發酵條件優化的基礎上應用Logistic方程和Leudeking-Piret方程建立了低醇度椰子水發酵過程中菌體生長、底物消耗和產物生成動力學模型，旨在為優質低醇度椰子水飲料研究和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 活性干酵母 釀酒酵母DV10購自拉曼公司。使用前用5%蔗糖水在42 ℃活化30 min。

1.1.2 椰子水 成熟椰子取自海南泰豐源公司。

1.1.3 試劑 葡萄糖，蒽酮，偏重亞硫酸氫鈉均為分析純。

1.1.4 儀器 紫外可見分光光度計（北京普析TU1810，中國），超高速離心機（賽默飛世爾 Fresco 17，美國），手持折光儀（愛拓 PAL-1，日本），pH計（梅特勒-托利多FE20，中國），酒精計（京都電子DA-130N，日本）。

1.2 方法

1.2.1 低醇度椰子水飲料發酵工藝流程 選取新鮮的椰子破殼后短時間內取出椰子水（測得其糖度為4.4 °Brix，pH值為5.53），用濾布和硅藻土分別過濾得到澄清的椰子水。用蔗糖調節糖度至約10 °Brix，在90 ℃水浴殺菌10 min，冷卻后添加0.02%偏重亞硫酸氫鈉，分別取2 L椰子水裝入已滅菌的3個3 L的發酵罐中。按體積分數5%的接種量將活化的酵母接種到發酵液中。接種后置于25 ℃恒溫培養箱中靜止發酵，每隔24 h取樣測定發酵液中的細胞干重、酒精度和總糖含量。

1.2.2 椰子水減重 采用干重法測定，具體方法為：取發酵液置入離心管，12 000 r/min離心10 min，移去上清液，用無菌水清洗，離心；重復3次；干燥，稱重。

1.2.3 酒精度的測定 采用蒸餾法測定，即將發酵液蒸餾后用酒精計測定酒精度。

1.2.4 殘糖量的測定 蒽酮比色法[16]。

1.3 數據分析方法

所有結果均使用SPSS 22.0數據分析軟件進行方差分析，結果以平均值±標準差表示。應用Origin 8.0 Pro對菌體生長、酒精生成和底物消耗動力學模型方程進行非線性回歸模擬和動力學模型參數的求解并繪圖。

2 結果與分析

在微生物的培養或發酵過程中，底物的消耗和產物的生成受到微生物的生長狀態及代謝途徑的制約。底物經微生物發酵主要去向包括：一是用于維持細胞正常的生命活動，二是通過代謝途徑最終轉化為產物，三是用于細胞增值。因此，要進行發酵動力學模型研究，應對菌體細胞數量、代謝產物生成和底物消耗3個狀態變量進行數學描述[17]。

2.1 椰子水發酵過程中物質的變化

椰子水發酵過程菌體量、酒精產量和殘糖量隨發酵時間的變化如圖1所示。發酵1～3 d時間內，酵母DV10的菌體量和酒精產量迅速增加，底物被快速消耗，說明酵母DV10能進入增殖階段迅速，發酵滯后期不明顯，適應環境能力較強。發酵時間第4天之后，酒精產量和椰子水消耗量幾乎保持不變，菌體增加不明顯，殘糖量下降速度變緩，發酵進入穩定期。經過10 d發酵，菌體量為3.1 g/L，酒精產量為5.2% vol，殘糖量為1.69 g/L。

2.2 發酵動力學模型建立

2.2.1 菌種生長動力學 椰子水發酵過程中酵母生長曲線是典型的“S”形方程，因此可利用Logistic方程描述菌體生長的變化規律，該方程能夠較好地反映發酵過程中由于細胞濃度增加對其自身生長繁殖所產生的抑制效應[18]。即

式（2）中，xt為酵母菌濃度，g/L；μm為酵母最大的比生長速，h-1；t為發酵時間，h；xm為最大的酵母菌濃度，g/L。

用Origin Pro 8.0對發酵過程中的菌體量和發酵時間擬合，可得菌體生長的動力學模型參數見表1。

將發酵時間t代入式（2）可得到酵母DV10菌種生長擬合方程：

xt=3.02/[1+exp（3.46-1.91t）] （3）

如圖2所示，酵母DV10接種后稍有延遲，即進入快速增長階段，第4天進入穩定期，至第10天發酵結束酵母菌體量基本維持不變。相關系數R2=0.994，說明擬合度好。

2.2.2 酒精生成動力學模型 酒精產量的實驗結果見圖1，根據產物生成速率與細胞生長速率之間的關系，酒精生成與菌體自身生長并非完全同步，而是有一定的滯后性，因此符合部分生長偶聯型，選擇Luedeking-Piret方程進行描述[19]。即

如圖3所示，酵母DV10接種后即進入酒精產量快速增長的對數期階段。進入穩定期后，酒精含量幾乎保持不變并維持至發酵結束。實測值與擬合值各點較為接近，相關系數R2=0.997，說明擬合度好。

椰子水發酵過程中的酒精生成主要由菌種數量、底物含量以及體系中酒精的濃度決定。只有在底物充足且酵母達到一定數量之后，酒精的產量才能快速提高，但是當酒精濃度達到一定值后，酵母產酒精的活性則會受到抑制而使得發酵液中酒精的濃度穩定在一定范圍內。

2.2.3 底物消耗動力學模型 發酵殘糖量的實驗結果如圖1所示。在發酵過程中，碳源和能源主要用于：（a）形成細胞物質即酵母生長，（b）產生供細胞維持生命的能量即維持酵母代謝，（c）生成產物如酒精和一些副產物。因此，底物消耗速率主要取決于細胞生長速率、酒精生成速率和底物維持能耗的速率。底物消耗動力學模型的表達式根據Luedeking-Piret方程可以推導為：

如圖4所示，酵母DV10接種后，殘糖量開始下降，對數期幾乎保持勻速快速下降狀態，穩定期糖降解速度緩慢；實測值與擬合值各點均較為接近。酵母DV10相關系數R2為0.997，說明擬合較好。

糖是發酵過程中的主要碳源，被酵母菌所分泌的酶系不斷分解、轉化，發酵過程中不但產生酒精，而且還產生CO2、醇、醛、酯、酸等其他代謝物。糖源不斷被消耗，這些代謝產物的濃度則不斷增加，主發酵結束之后，殘糖會被繼續分解，進而得到干酒。

2.3 椰子水發酵速率

以時間t分別對3種酵母發酵過程中菌體生長擬合曲線Xt、酒精生成擬合曲線Pt和底物消耗擬合曲線St求一階導數得到以下3個方程：

酵母DV10菌體生長速率方程：

dx/dt=5.76×exp（3.46-1.91t）/[1+exp（3.46-1.91t）]2

酵母DV10酒精生成速率方程：

dp/dt=10.466×exp（3.46-1.91t）/[1+exp（3.46-1.91t）]2

酵母DV10底物消耗速率方程：

ds/dt=-159.89×exp（3.46-1.91t）/[1+exp（3.46-1.91t）]2-0.051×exp（1.91t）/{1-0.093[1-exp（1.91t）]}

如圖5-A所示，由酵母菌體生長速率曲線可知，接種后酵母數量開始增長，生長速率不斷提高。第2天達到速率最高值，之后開始下降，第5天增速幾乎接近于0，此時酵母數量最高。酒精生成速率曲線圖如圖5-B所示，初始階段酒精生成速率不斷增加，并在第2天達到最高值，之后開始下降，第5天酒精生成速率接近于0，此時酒精積累量最大。發酵降糖速率曲線如圖5-C所示，發酵開始后，降糖速率一直增加，第2天出現最大速率值，之后開始下降。

2.4 模型驗證

由表4可知，3個模型的理論值和實驗值的誤差大部分小于10%，3個模型理論值和實驗值的誤差的平均值分別為4.75%、4.36%、4.42%，說明模型擬合較好。

3 討論

應用Logistic和Leudeking-Piret方程建立了包括菌體生長動力學模型、底物消耗動力學模型和產物生成動力學模型3個發酵動力學模型。擬合結果顯示，酵母DV10的模擬預測值與實際實測值之間的擬合度較好（0.994、0.997、0.997），且3個模型的理論值和實驗值的誤差大部分小于10%，3個模型理論值和實驗值的誤差的平均值分別為4.75%、4.36%、4.42%，因此可以很好地預測發酵過程的動態變化。通過對發酵動力學擬合方程一階求導，得到低醇度椰子水發酵過程中菌種增長速率、酒精生成速率和底物消耗速率，從而能更清晰地認識椰子水發酵過程。

本研究的動力學模型主要參考張良[17]的研究，且動力學模型擬合度與之相近，其建立的藍莓酒發酵過程中菌體生長、酒精生成以及糖消耗的動力學模型的決定系數分別為R2=0.991、0.985、0.979。在本研究中發現發酵過程中酒體中的椰子水風味變淡而酒精風味過重，因此可以參考楊勁松等[20]的方法，用高度酒浸漬椰肉再兌發酵椰子水，可以較好地豐富發酵椰子水中風味。

本研究選擇實驗室用3 L發酵罐進行椰子水發酵動力學研究，與全自動發酵罐中的放大培養有些區別。全自動發酵罐中帶有攪拌操作且容積更大，罐內菌體生長和代謝會有所改變，仍需進一步分析各種發酵參數之間的聯系，以構建全自動發酵罐中發酵動力學模型，為今后發酵過程計算機控制和自動化操作創造條件。

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