光甘草定對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響

趙偉 宋歌

摘要：本試驗對金葡菌進行培養并加入藥物觀察來測定影響因子。分光光度計的測定數據表明，不同濃度的光甘草定對金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；生物被膜；光甘草定；分光光度計

中圖分類號：S859.2 文獻標識碼：B 文章編號：2096-3637（2017）07-0006-03

和很多的致病菌一樣，金黃色葡萄球菌也可以在其表面形成一層生物被膜，金黃色葡萄球菌的生物被膜形成以后，其形態特征，以及生理變化都會發生很復雜的變化，生物被膜由很多大分子物質組成，它能使包裹在內部的細菌免受外界不良環境的干擾和破壞，從而對細菌起到保護作用[1]。所以，要想防治或者治療金黃色葡萄球菌的感染，就要先從生物被膜入手。

1金葡菌生物膜系統簡介

金黃色葡萄球菌之所以難以防治，難以治療，是因為在感染金黃色葡萄球菌以后，病菌會形成一個復雜細菌生物被膜。細菌生物被膜是一層包裹在細菌外面的極其復雜和嚴密的膜[2]。實驗數據表明，在生物膜的形成起始階段，細菌與細菌的粘附是生物膜形成的關鍵，這個階段很大程度上受到胞外DNA（eDNA）作用和影響。在聚集階段發揮作用的是多糖PIA[3]。PIA不僅能夠誘導細菌之間相互依附粘連，還能促進細菌的分化增值，有此形成多層的細胞團塊，進而形成生物被膜[4]。

基因ica操縱子是細胞間多糖粘附素合成的基礎。它有五個基因串聯組成，分別是icaA，icaD，icaB，icaC，icaR。其中發揮最重要作用的是icaA[5]。胞外DNA能夠促進生物被膜的形成，細胞質水解酶可以通過裂解細菌將胞外DNA釋放到細菌外界加強生物被膜的形成。并且細胞質水解酶受cidA的調控，所以cidA間接的對生物被膜的形成發揮重要的作用。然而如果cidA基因缺失，就會降低細菌的裂解，進而減少胞外DNA的釋放，間接的對生物被膜的形成起到抑制作用。由此可見，胞外DNA是否能夠釋放，很大程度上取決于cidA的調節。從另一方面來說，基因cid操縱子和ica操縱子都受到agr和sar兩個調節系統的影響[6]。由此，agr和sar是金葡菌研究中最重要的研究系統。實驗表明，agr和sar系統可以通過影響cid的表達來控制細菌自溶，通過調控ica來影響生物膜的形成。

要想控制或抑制生物被膜，首先要做的是對生物被膜形成的研究和分析。近年對于生物被膜的研究，大多是通過改變不同環境或藥物對生物被膜的作用，然后對生物被膜進行測定，通過得到的數據進行結果分析討論，從而得出對生物被膜形成影響最大的因素，進而探測生物被膜形成的機理。在金黃色葡萄球菌生物被膜研究的實驗中，通過甲基葡萄糖的研究[7]說明生物被膜的主要組成是多糖PIA，而且PIA的合成，受細菌總糖量的影響。對于金黃的葡萄球菌的治療和防治，要從生物被膜開發，尋求的藥物也需要以對PIA和eDNA有影響為基本要素。在近年的實驗進程中，甘草系列的研究發展迅速，并且可能滿足影響的條件，本實驗旨在檢驗光甘草定對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響[8]。

2研究的目的和意義

本實驗將光甘草定等樣品溶于PBS溶液制成液體藥物，加入到具有相同狀態金黃色葡萄細菌的96孔細胞培養板內，制備成不同終濃度（有空白對照）的液體進行孵育作用，作用結束后用結晶紫染色，用分光光度計測出各孔的吸光度，從數據的不同反映出藥物對金黃色葡萄球菌生物膜的影響。進一步探索光甘草定在治療藥物研發上的應用，為人類身體健康和食品安全方面的發展做出貢獻。

3材料與方法

3.1材料

3.1.1材料來源

金黃色葡萄球菌和光甘草定樣品。

3.1.2試驗所用器材及儀器

96孔細胞培養板、火柴、平皿若干、1.5mlEP管若干、10ul槍頭若干、200ul槍頭若干、1ml槍頭若干、1.5mlEP管架若干、細菌培養瓶若干、大小瓶塞若干、酒精燈、電磁爐、剪刀、鑷子、接種環、錐形瓶若干、量筒、250ml試劑瓶若干、100ml試劑瓶若干、數碼鼓風干燥箱（GZX-9070MBE上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、醫用凈化工作臺（蘇州凈化設備公司）、CO2培養箱（青島龍杰儀器公司）、數碼電熱恒溫培養箱（HPX-9082ME上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、恒溫搖床、高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、微量移液器一套（規格：0.5～10?l、20～200?l、100～1000?l，購自大龍醫療設備有限公司）、電子天平（購于北京賽多利斯天平有限公司）、離心機、酶標儀、離心管、一次性手套，-20℃冰箱、4℃冰箱、醫用膠帶、脫脂棉、封口薄膜等。

3.1.3試驗所用試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）（購自美國BD公司）、瓊脂粉（北京雙旋微生物培養基制品廠）、革蘭氏染色劑（草酸銨結晶紫，碘液，95%酒精，石碳酸復紅）、香柏油、二甲苯、蒸餾水、自來水、75%醫用酒精、新潔爾滅消毒液、無水乙醇、PBS液（河南科技大學實驗室制備）、苯酚、結晶紫溶液、氯仿、TEN緩沖液、異戊醇LB、EDTA、醋酸鈉、液體培養基（河南科技大學制備）等。

3.2主要試劑的配制液

3.2.1 10mg/ml光甘草定溶液：PBS液3ml，加0.03g光甘草定震蕩溶解。

3.2.2 LB培養液：LB液100ml，蛋白胨1g，酵母0.5g，Nacl1g。

3.2.3結晶紫溶液：結晶紫0.04g，蒸餾水10ml震蕩溶解。

3.2.4 EDTA。

3.2.5 TEN緩沖液。

3.3實驗設計

3.3.1檢測eDNA的方法

按上述方法培養生物膜，用酶標儀檢測OD600下細菌濃度，按Rice等人（2007）的方法提取并檢測eDNA。加入0.5MEDTA預冷1h；用700μl50mMTEN緩沖液（Tris-HCl，10mMEDTA，500mMNaCl）重懸生物膜，轉入預冷的離心管中，4℃，18000rpm離心5min；將上清轉入新的離心管，加入300μlTE緩沖液，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）；4℃，12000rpm離心10min，取上清，用氯仿∶異戊醇（24∶1）再次萃取；取水相，加入3倍體積的冷乙醇和1/10體積的醋酸鈉，混勻后-20℃過夜；4℃，18000rpm離心20min，去上清，用70%冷乙醇洗滌，空氣中風干后，加入20μlTE緩沖液溶解；用NanoDrop2000分光光度計檢測A260/A280的吸光度比，eDNA的相對表達量用單位生物膜內eDNA的含量表示。

3.3.2甘草測定的方法

①用PBS將光甘草定配制成濃度為10mg/ml。

②將金黃色葡萄球菌接種與LB培養基37℃震蕩過夜第二天取培養液用LB培養液稀釋10稀釋后，取200μL稀釋后的菌液加入96孔細胞培養板，放于CO2培養箱培養48h。

③往96孔細胞培養板加入光甘草定終濃度為10μL/ml，20μL/ml，50μL/ml，100μL/ml，200μL/ml同時做空白對照孔，每孔重復2次，分別作用，2h，4h，6h和8h后用PBS洗去浮游菌，洗3次，加入0.04%結晶紫染色30min，用自來水洗去浮色，待膜干后，每孔用200μL乙醇溶解，于570～590nm波長下檢測。

3.3.3病菌接種

把超凈工作臺的紫外燈打開放入試管，菌（液體）、LB液體培養基，消毒滅菌20～30min、然后，點燃酒精燈，在酒精燈旁完成實驗，消毒灼燒空試管口，消毒培養液瓶口、到入1/3左右，打開裝菌種的離心管、用接種環灼燒消毒，沾菌、加入試管、灼燒用過的接菌環、試管蓋上紙蓋子封口，用報紙包好，放入THZ-92C氣浴恒溫震蕩器過夜（37℃12h），整理超凈工作臺。

3.3.4細菌的稀釋

將復蘇好的細菌從恒溫搖床培養箱內取出，觀察小試管內的細菌的情況，細菌的形態，色澤，透明度等，在凈化操作臺中，取錐形瓶加入3ml菌液。再加入27mlLB培養液，用200μL移液器加入到96孔細胞培養板內，培養48h。

3.3.5封口保藏

將加入了200μL稀釋菌液的96孔板，用保鮮膜纏繞，確保96孔板上下兩個半殼之間的空隙被密封，在底部放置濕潤的毛巾，置于特定的容器內，放在二氧化碳培養箱內，培養48h。

4結果及分析

4.1 eDNA測定的結果

將作用2h的實驗板經過實驗處理，然后測定其數據取平均值和標準差，并做出最溶度增大的數據柱狀圖，作圖如下：

4.2甘草作用的結果

將生物膜用結晶紫試劑染色以后，對樣本進行處理完成，放入分光光度計中進行測定，測定后，求相同時間同一濃度數據的平均值和標準差，作出柱狀圖如下：

4.3分析

4.3.1 eDNA的測定

eDNA的相對表達量就是對金黃色葡萄球菌生物被膜形成多少的直接反映。所以從圖（1）的變化可以看出，數據逐漸減小，說明同一作用時間，隨著作用濃度的增大，光甘草定對金葡菌的抑制作用也在增強。

4.3.2光甘草定圖（2）

光甘草定實驗板的測定數據有明顯的浮動和變化，說明隨著光甘草定的濃度的不同，實驗數據明顯在減小，柱狀圖也在平穩的下降，實驗表明光甘草定對金黃色葡萄球菌的形成有明顯的抑制作用，并且隨著光甘草定的濃度的增大，金黃色葡萄球菌受抑制的作用就更加明顯。隨著時間的延長，抑制效果也在增強。光甘草定歲生物被膜的影響機理可能是光甘草定的抗菌抗癌作用。柱狀圖越來越低是因為隨著濃度的增加細菌受到的影響作用也越來越大，生物被膜的形成越來越少。因此實驗表明，光甘草定對金黃色葡萄球菌的形成有明顯的抑制作用。

5討論

甘草是一種有益的中草藥，味甘，性緩。用于很多疾病的防治和治療。而且分布廣泛。在我國分布在新疆寧夏等地區。甘草是天然活性物質，能夠增強人體免疫力，對炎癥，腫瘤等疾病具有不同程度的防治和治療效果。在修復自身免疫方面和抗病毒方面也有一定的效果。

經過實驗，任何實驗濃度的光甘草定均表現出的是對金黃色葡萄球菌生物膜的抑制作用。通過數據的平穩降低和曲線的持續下降，表明光甘草定對生物被膜有持續的影響作用，并且還隨著濃度的增加，抑制作用還越來越強。進過近年的實驗研究成果觀察，抑制的機理可能是影響可細菌的生長。有實驗證明[9]，光甘草定對酪氨酸酶的活性有一定的影響作用。因此有可能是在細菌的新陳代謝階段，某一種或者某幾種酶活性受到干擾，導致細菌生長受阻，因此生物被膜的形成被影響。也有可能是的結構到破壞。導致細菌無法完成特定的生理過程，因此無法完成正常的生物被膜的構建。也有很多實驗證明光甘草定具有一定程度的抗菌和抗癌作用。因此光甘草定可能還有其他的影響生物被膜形成的機理。

6結論

光甘草定，10～200μL/ml濃度梯度的光甘草定，隨著濃度的增加對金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用增強。隨著作用時間延長，抑制作用增強。

參考文獻

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[2]段韻涵，韓北忠，楊葆華等，培養條件對金黃色葡萄球菌生物被膜生長的影響[J]，中國釀造，2003（3）：17-20.

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[9]馬海樂，樊金玲.光甘草定檢測提取純化及其抑制酪氨酸酶活性的研究，河南科技大學，河南，2011，5：1-2.