基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征驗證

黃靜 賈瑞宗 孔華 郭靜遠 王緒朋 郭安平

摘 要 根據RNAi原理構建的抗海南番木瓜環斑病毒（PRSV）植物表達載體pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS，通過基因槍法將載體導入番木瓜的愈傷組織中，經卡那霉素抗性篩選后再分化成為植株。描述轉化植株的分子特征同時進行抗病毒試驗分析其抗病性。實驗結果顯示：轉基因株系474為單拷貝插入的雜合子，插入位點在第7號染色體supercontig_61的717 141位置；抗病毒試驗中，在接種病毒后28 d內非轉基因株系1280有高濃度的病毒積累并很快表現出明顯的病癥，而轉基因株系474基本無病毒積累且無發病癥狀。表明轉基因株系474具有較好的PRSV抗性，有待于進一步田間試驗。

關鍵詞 番木瓜環斑病毒；番木瓜；RNAi

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A

Abstract RNAi-mediated virus resistance strategy was used to develop PRSV resistance papaya lines. A plant expression vector pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS was constructed. The vector was transferred into papaya callus by particle bombardment， selected on kanamycin media. Transformation papaya lines were validated by PCR， RT-PCR， ddPCR， etc. The transgenic lines were further challenged with viral inoculation. The results showed that transgenic line 474 was single copy insertion and insertion site was located in papaya chromosome 7 supercontig_61 at 717 141 bp； non-transgenic line 1280 accumulated higher concentration of virus and developed symptoms， while transgenic line 474 was almost no virus accumulation. Transgenic line 474 was resistance to PRSV， which needed field test.

Key words Papaya ringspot virus（PRSV）； papaya； RNAi

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.021

番木瓜（Carica papaya L.）廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區，由于其產量高、營養價值豐富和無季節性等特點，被認為是重要的熱帶水果之一[1-2]。番木瓜環斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是危害番木瓜生產的致命性病原，并制約番木瓜產業的發展。番木瓜環斑病毒為馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的單分體正鏈RNA病毒，主要經蚜蟲以非持久方式傳播[3]。

通過番木瓜的基因組分析發現，番木瓜因缺乏抗病的相關基因而比其他植物更易感病[4]。一些常規的抗病毒育種策略往往收效甚微，目前對于PRSV的防治以基因工程育種為主。實際利用的番木瓜抗病毒基因多數是來自病毒本身，如病毒的外殼蛋白基因、復制酶基因、核酶基因、運動蛋白基因等，其中外殼蛋白基因[5]和復制酶基因[6]運用的較為成功。

夏威夷轉基因番木瓜抗病毒的策略是根據“致病菌衍生的抗病性”（PDR）原理，采用病毒來源的基因序列，通過基因槍法將其轉入不抗病的番木瓜品種中[5]。RNAi（RNA interference）即RNA干擾，亦稱為轉錄后基因沉默（PTGS）或共抑制，是植物抵抗外來核酸（轉座子、轉基因或病毒）入侵，并保護自身基因組完整性的一種防御機制，被認為是RNA介導的病毒抗性，雙鏈RNA分子被認為是最適宜的RNA沉默啟動因子。構建反向重復（IR）序列能夠顯著提高轉基因植物的抗性[7]，一般來說轉病毒單鏈正義或者反義基因只有20%左右轉基因植株對病毒產生抗性，但是轉入能夠產生dsRNA的IR序列卻有高達90%的轉基因植物對病毒產生抗性[8]。

PRSV存在地理分化，各地的病毒分子差異較大。由于存在序列同源依賴性，因而限制了轉夏威夷PRSV外殼蛋白（CP）基因番木瓜在夏威夷以外地區的應用[9]。轉夏威夷或臺灣PRSV外殼蛋白基因的品種只對夏威夷或臺灣的PRSV株系具有抗性，不抗海南的PRSV株系[10]。目前，中國還缺乏表現良好的具有廣譜抗性的番木瓜品種，也因此番木瓜產業受到環斑病的嚴重威脅。

為了培育出對海南地區PRSV種群具特異抗性的番木瓜新品種，前期已對海南昌江、樂東、澄邁、文昌和三亞5個主要番木瓜產區的病毒病發生情況進行調查取樣，獲取了海南PRSV代表分離物以及海南PRSV CP基因的保守區域。利用CP基因保守區域構建RNAi發夾結構，將發夾結構導入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表達載體并酶切驗證[11]，本研究對轉入以海南PRSV代表分離物CP基因保守區域構建的反向重復序列番木瓜進行了分子特征的描述以及抗病性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

番木瓜品種SunRise和SunUp分別為來自夏威夷的非轉基因及商品化轉病毒CP基因的番木瓜，番木瓜品種SunRise的種子和經過片段化處理之后的番木瓜品種SunUp的DNA均由夏威夷農業研究中心朱蕓博士提供。轉化受體材料來源于番木瓜品種SunRise愈傷組織亦由夏威夷農業研究中心朱蕓博士提供。

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購于北京全式金生物技術有限公司，pMD18克隆載體購于寶生物工程（大連）有限公司，植物表達載體pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS由本實驗室構建并保存[11]，采自海南的PRSV HainanⅠ、HainanⅡ和HainanⅢ 3個分離物由本實驗室保存。

PCR試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司，質粒提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購于Omega公司，RNA提取試劑盒購于Qiagen公司，反轉錄試劑盒購于Promega公司，熒光定量PCR試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司，所有實驗用到的酶全部購于Thermoscientific公司，其他常用試劑為分析純。引物序列見表1，合成以及DNA測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 轉化及轉基因植株篩選 參照Kung等[12]方法誘導番木瓜胚性愈傷組織。參考Fitch等[13]的方法進行基因轉化，轉化采用PDS 1000型基因槍（Bio-Rad，Hercules，Calif.；http：//www.bio-rad.com）。用卡那霉素（100 mg/L）抗性篩選培養基培養1～2個月，成苗后再進行外源基因PCR檢測。將檢測為陽性的植株生根處理后移栽到土壤中，置于溫室中培養。轉化流程圖見圖1。

1.2.2 PRSV分離與接種 海南PRSV HainanⅠ、Ⅱ和Ⅲ這3個類型的病毒分離物保存于實驗室。接種前將病毒接種到番木瓜上活化[14]，表現出病癥的番木瓜葉片制備病毒接種液。參考魏亞軍[15]接種PRSV的方法并做了適當的修改。取同時含有海南PRSV的HainanⅠ、Ⅱ和Ⅲ 3個類型病毒的番木瓜葉樣適量，按照1 ∶ 10（w/V）的比例加入磷酸緩沖液，充分研磨。將勻漿液加入到1.5 mL離心管中，在4 ℃條件下5 000 r/min，冷凍離心10 min。冰上放置，取上清液作為病毒接種液。PRSV接種液-20 ℃保存并在48 h內使用，提取接種液中的RNA逆轉錄為cDNA，利用qPCR方法測定接種液里的PRSV含量。

選取4～6葉期的苗，在葉正面撒上少量石英砂，滴加10 μL接種液由葉脈向葉尖順勢輕輕摩擦均勻涂布葉片表面。接種結束后，立即用蒸餾水沖洗接種葉表面。轉基因株系為實驗組，非轉基因株系為對照組，同時設置不接種任何液體（CK）和接種PBS緩沖液的2種對照處理，每種處理設3個生物學重復。將接種后的植株置于溫室中培養，每隔4 d觀察記錄發病情況同時取新生幼葉用來檢測病毒量。由于PRSV在番木瓜上是系統性感病，排除其他因素對于病毒量的影響，故取新生幼葉檢測病毒量。采用逆轉錄PCR（RT-PCR）和qPCR檢測接種病毒后天數（Day After Inoculation，DAI）在第0、4、8、12、16、20、24、28天的病毒積累量。

1.2.3 PCR篩選陽性轉化苗 用轉化事件特異PCR進行陽性轉化苗的篩選。使用的引物分別是目標基因CP引物（CP1/CP2）、轉化事件特異性引物（35S-F/CP2）和內參引物（PapainF/R）（表1）。PCR擴增條件是：94 ℃，3 min預變性；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃再延伸10 min。這3對引物擴增條件一致，只有35S-F/CP2引物擴增是延伸時間為1 min，其余條件不變。反應結束后，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 微滴數字PCR（ddPCR）分析插入的拷貝數

參考姜羽等[16]用ddPCR分析轉基因的外源基因拷貝數的方法，分析陽性植株的插入的拷貝數。本實驗采用QX100TM Droplet DigitalTM PCR系統（Bio-Rad，美國，包括微滴生成儀和微滴讀取儀），按照說明書進行相關操作，擴增程序設置如下：95 ℃，5 min預變性；95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，共45個循環，擴增結束后進行在98 ℃條件下10 min熱失活。每個模板重復3個平行檢測。使用軟件Quanta Soft V1.3.2.0分析實驗數據，獲得轉化陽性植株絕對定量結果。

1.2.5 hiTAIL-PCR驗證插入位點 hiTAIL-PCR參考Liu等[17]描述的方法（引物見表1），驗證陽性植株的插入位點。第一輪和第二輪擴增產物電泳檢測，將條帶割膠回收后連接到pMD18克隆載體上，最后轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，每個挑選3個重復陽性菌送到生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果在Phytozome v11.0（https：//phytozome.jgi.doe.gov）網站上進行比對，以確定插入的位點信息。

1.2.6 PRSV的抗性檢測 用RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）試劑盒提取8個時間段采集的番木瓜幼葉樣本的RNA以及PRSV接種液的RNA后，使用ImProm-II Reverse Transcription System（Promega） 試劑盒逆轉錄生成cDNA。由于轉化事件是CP基因片段，因此用RT-PCR和qPCR檢測轉基因番木瓜的PRSV積累量時使用的是HC-Pro特異引物（表1）。

RT-PCR按照試劑盒說明書進行操作，將RNA、引物和水的混合物在70 ℃下變性5 min，立即在冰上靜置5 min，短暫離心用來配置反應體系。反應條件是25 ℃，5 min；42 ℃，60 min；70 ℃，15 min，4 ℃保存。

PCR病毒檢測的擴增條件是94 ℃ ，3 min預變性；94 ℃變性30 s，60℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃ 再延伸10 min。qPCR反應程序如下：95 ℃，5 min預變性；95℃變性 20 s，58 ℃退火30 s，共45個循環，在退火步驟中采集熒光信號。每個模板重復3個平行擴增。擴增結束后使用SDS 2.4軟件分析實驗數據，獲得實時熒光定量PCR結果。

2 結果與分析

2.1 PCR篩選分析

用于PCR檢測的這3對引物CP1/CP2、35S-F/CP2和PapainF/R擴增片段大小分別是544、大約760和198 bp。陽性對照SunUp轉入的是PRSV的 CP基因全長[18]。圖2是PCR篩選陽性轉化事件的部分結果，其中1280株系為非轉化株系，其檢測結果與陰性對照SR結果一致，電泳結果表明CP基因引物的檢測結果與組合引物結果一致，與陽性對照的結果相符，可判定474、242、422、537為陽性植株。

2.2 ddPCR定量結果分析

微滴生成是ddPCR記錄信號的關鍵步驟，只有當微滴數大于10 000時，DNA分子的分布符合泊松分布的統計學原理，系統可以對陽性和陰性微滴進行計數[19]。ddPCR擴增微滴形成由圖3-A可見，反應中形成的微滴數處于15 000～30 000之間，均大于10 000，滿足ddPCR微滴的分析要求。ddPCR系統生成的陰性微滴和陽性微滴區分明顯，系統可準確判讀出陽性微滴和陰性微滴數目。數據表明，實驗建立的ddPCR體系微滴生成穩定，重復性良好，能夠用于轉基因生物外源基因拷貝數的分析。

根據軟件讀取的外源基因和內參基因的濃度，通過公式：外源基因拷貝數=外源基因濃度/內參基因濃度，計算得出轉基因番木瓜474和陽性對照SunUp的外源基因（CP）的拷貝數。ddPCR分析顯示，轉基因番木瓜474含有1.0拷貝的CP基因，SunUp則含有2.4拷貝的CP基因，見圖3-B。由于SunUp是（CP/CP）純合子，結果和以前的報道一致[18]。

2.3 hiTAIL-PCR驗證轉化插入的位點

474樣品的hiTAIL-PCR第一輪和第二輪電泳結果如圖4-A，將測序結果進行分析（Carica papaya ASGPB v4.0， https：//phytozome.jgi.doe.gov），發現比對上7號染色體的supercontig_61，Score=1 314 bits（663），Expect=0.0，Identities=669/671（99%）插入位點在717 141的位置（圖4-B）。轉基因植株474中，外源基因未插入到番木瓜編碼基因中，插入位點上游+1.2 kb 處有evm.TU.supercontig_61.23；上游+3.9 kb處有evm.TU.supercontig_61.22；上游 +10.4 kb處有evm.TU.supercontig_61.21；上游+174.2 kb處有evm.TU.supercontig_61.20。下游-2.6 kb有evm.TU.supercontig_61.24這是一個編碼反轉錄酶（RNA-dependent DNA polymerase，RVT_2）的基因；下游

-96.8 kb處有evm.TU.supercontig_61.25。

為了驗證插入的真實性，根據插入位點上下游片段設計引物進行驗證。在supercontig_61上的717141位點的上游和下游各約200 bp處，利用NCBI網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）設計引物474-61F/R，擴增片段大小為192 bp。在反應體系中加入474-61F/R+CP2，如果存在CP基因插入時，CP基因的一條引物和設計引物組合擴增出的片段大小應該為1.2 kb左右（CP正向插入+35S啟動子+右邊界+基因組的擴增右翼）。474樣品的電泳結果（圖4-C）有2條帶其中一條帶大小與陰性對照一致192 bp，另一條帶約1.2 kb這大小符合有CP基因插入的預測，根據結果可判斷474樣品為雜合子。

2.4 轉基因番木瓜對PRSV的抗性評價

在接種病毒后28 d內，1280株系和474株系抗病性差異明顯。3株接種病毒的1280植株表現一致，均感病具體表現為在12 DAI時表現出病癥，隨著時間的延長，病癥日益明顯，在24 DAI時出現病癥典型；同時接種病毒的3株474植株整個過程均無病癥，表型正常，見圖5-A。對在8個時間點采集的樣品進行PCR檢測病毒積累量，電泳結果見圖5-B。在相同模板量下，非轉基因1280株系凝膠檢測灰度程指數增長趨勢，即隨著時間的延長感染病毒量逐漸遞增，轉基因474株系基本沒有變化，即幾乎沒有病毒的感染（圖5-C）。

2.5 熒光定量PCR檢測病毒積累

采用相對熒光定量PCR 2-△△Ct[20]處理數據，△△Ct=（CtPRSV樣品-Ctpapain樣品）-（CtPRSV校準-Ctpapain校準），結果見圖5-D。對照組非轉基因1280株系樣品和實驗組轉基因474株系樣品在不同時期中PRSV HC-Pro基因的轉錄水平存在顯著差異，1280樣品中HC-Pro表達量比474樣品高。隨著時間的延長，1280植株HC-Pro表達量逐漸增多且變化顯著，而474植株HC-Pro只有少量的表達且無明顯變化，1280株系和474株系HC-Pro表達量存在顯著差異。因此，實驗組與對照組的病毒積累量有顯著差異，實驗組雖然有極少量病毒但是無癥狀，對照組變化明顯，有大量病毒積累并表現出病癥。

3 討論

番木瓜病毒病是限制番木瓜生產的主要因素。為了調查海南番木瓜發病情況，進行環海南島采集番木瓜樣品，發現由于PRSV肆虐，海南的一些番木瓜種植區已經出現了絕產絕收的現象。海南PRSV具有極高的突變率，已報道海南PRSV HainanⅠ，HainanⅡ和HainanⅢ這3個分離物在海南不同區域間分布不同[21]，通過分析海南這3個分離物找到它們的共同保守區域片斷，采用RNAi原理構建植物表達載體。有研究表明，基因沉默效果與表達載體構建有關。構建發夾結構目標基因片斷長度小于200 bp或者大于600 bp 的效果不好；在200～600 bp之間的轉化后干擾效率最高[22]，本實驗選擇的CP基因片段大小為544 bp，在此范圍內。

在本研究中，利用海南PRSV代表分離物共同保守區域CP基因片段構建反向重復序列植物表達載體，采用基因槍法將載體導入番木瓜的愈傷組織中，經卡那霉素抗性篩選進而再分化成為植株。轉化苗經過PCR篩選、ddPCR分析插入拷貝數、hiTAIL-PCR驗證特異插入位點以及抗病毒試驗。PCR檢測為陽性的474樣品ddPCR分析結果為單拷貝插入，hiTAIL-PCR顯示插入位點在第7號染色體supercontig_61的717 141位置，設計特異引物驗證插入位點時發現474株系為雜合子。轉基因474植株和非轉基因1280植株通過摩擦接種PRSV的抗病毒試驗表明，474植株對PRSV的侵染產生了抗性，認為這是由于轉基因番木瓜474株系體內導入了由反向重復載體轉錄形成的dsRNA啟動了RNA沉默機制的結果，即轉入CP基因反向重復載體能夠形成dsRNA，從而有效抑制了PRSV對番木瓜的侵染；PRSV在番木瓜中是系統侵染，非轉基因番木瓜1280株系中病毒可以由接種葉片擴散到新生幼葉；而在轉基因番木瓜葉片上接種病毒，植株無病癥。圖5-D顯示，轉基因植株中存在病毒HC-Pro基因的極少量（不到2 dRn）表達，隨著時間的推移表達量無明顯變化，表明病毒少量存在轉基因植株中不擴增更不發病；但圖5-B顯示，轉基因植株中RT-PCR檢測不到病毒基因表達，這是由于病毒量極少擴增條帶不被識別，因此檢測不到病毒表達。

利用來源植物病毒本身的基因或核苷酸序列導入植物來得到抗病毒的工程株成為增強抗病性的主要措施之一，由RNA介導抗性使含單拷貝的轉基因植株能產生高度抗病性；短片斷核苷酸序列也可以起到抗病作用；入侵病毒的RNA能迅速被降解、不需表達蛋白質等優點使抗病毒策略具有潛在的應用價值并能引起廣泛關注和深入研究[23]。魏軍亞等[14]研究同源CP基因區段dsRNA對PRSV侵染的干擾作用，發現瞬時表達的dsRNA能夠特異地干擾PRSV侵染；張帆等[24]將PRSV CP基因的dsRNA載體pHG12-CPIR轉入番木瓜中，檢測結果顯示PRSV在野生型中有大量積累，而在轉基因植株中沒有積累；Wang等[25]證實表達病原dsRNA的轉基因植物能夠對相應的病毒侵染產生抗性，結果表明在植物細胞中表達dsRNA能夠引起導入序列的植物的基因沉默。本實驗采用RNA介導抗性，轉入以海南PRSV代表分離物CP基因保守區域構建的反向重復序列，若要獲得廣譜抗PRSV的植株，有待于進一步田間試驗。

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