浮萍多樣性對富營養化水體凈化效果的影響

李陽　成家楊　鐘鈺　唐杰

摘要：【目的】通過研究浮萍物種多樣性對凈化富營養化水體效果及其對浮萍生物質積累的影響，為未來利用浮萍混養組合修復富營養化水體及開發浮萍生物質提供理論依據?！痉椒ā糠謩e將青萍（Lemna aequinoctialis LC33）、少根紫萍（Landoltia punctata LC06）和多根紫萍（Spirodela polyrhiza LC15）進行單獨和混合培養，測量其對富營養化水體中氮、磷的去除率，同時分析混養組合的生物質含量。【結果】由少根紫萍和多根紫萍構成的混養組合對水體中硝氮（NO3--N）、總氮（TN）和總磷（TP）的去除率最高，分別為97.05%、95.00%和97.64%；由3種浮萍構成的混養組合對水體中氨氮（NH4+-N）的去除率最高，達98.17%。由青萍和少根紫萍構成的混養組合及由少根紫萍和多根紫萍構成的混養組合具有更高的生物量增長率，由青萍和少根紫萍構成的混養組合可積累更多的淀粉，由少根紫萍和多根紫萍構成的混養組合可積累更多的粗蛋白?！窘Y論】適當的浮萍混養搭配不僅可提高富營養化水體凈化效果，還能促進生物質的積累。

關鍵詞： 浮萍；混合培養；植物修復；氮磷去除率；生物質

中圖分類號： TK6 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）02-0259-07

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for eutrophic water purification and duckweed biomass utilization in the future， the effects of duckweed species diversity on eutrophic water purification and duckweed biomass accumulation were investigated. 【Method】Three duckweed species， Lemna aequinoctialis LC33， Landoltia punctata LC06 and Spirodela polyrhiza LC15， were cultured both individually and in mixture to measure their removal rates of nitrogen and phosphorus， and to analyze biomass content of mixed combinations. 【Result】Combination of L. punctata LC06 and S. polyrhiza LC15 showed the highest removal efficiency of nitrate nitrogen（NO3--N）， total nitrogen（TN） and total phosphorus（TP）， reaching 97.05%、95.00% and 97.64% respectively； while combination of L. aequinoctialis LC33， L. punctata LC06 and S. polyrhiza LC15 showed the highest removal efficiency of ammonia nitrogen（NH4+-N）， reaching 98.17%. Moreover， compared with other groups， polyculture of L. aequinoctialis LC33 and L. punctata LC06， polyculture of L. punctata LC06 and S. polyrhiza LC15 exhibited higher biomass growth rate； polyculture of L. aequinoctialis LC33 and L. punctata LC06 accumulated more starch； polyculture of L. punctata LC06 and S. polyrhiza LC15 accumulated more crude protein. 【Conclusion】Appropriate combination of duckweed species can enhance purifying effects of eutrophic water， and promote biomass accumulation.

Key words： duckweed； mixed culture； phytoremediation； nitrogen and phosphorus removal efficiency； biomass

0 引言

【研究意義】近年來，水體富營養化已成為一個世界性的環境問題（高愛環等，2005），而水生植物浮萍因具有氮磷去除率高、生長速度快、環境適應性強、易收獲等優點，已廣泛應用于富營養化水體修復（鄢恒珍等，2009； Cheng and Stomp， 2009； Megateli et al.， 2009； Khellaf and Zerdaoui， 2010； Stout et al.， 2010）和生物能源等領域。野生浮萍多以兩種或多種浮萍種類聚集在一起的方式生長，但目前對浮萍凈化污水方面的研究多采用單一浮萍物種，對混養組合的污水凈化能力及其生物質積累能力尚不清楚。因此，探索浮萍混養組合在凈化污水方面的效果及積累生物質的情況將填補這一領域的空白，為更好地進行污水處理和利用浮萍生物質提供理論支持?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內外對單一浮萍物種在生物質開發、污水處理等方面的研究已十分成熟。種云霄等（2003）研究發現，稀脈浮萍的最適pH為5.0～6.0，而當pH<6.0時，紫萍基本不能生長；Cheng等（2002）利用人工合成的養豬場廢水進行篩選后發現，紫萍（Spirodela punctata 7776）可在含NH4-N/L 240 mg和PO4-P 31 mg/L的廢水中存活，且積累最多的蛋白質；Suppadit（2011）在用蕪萍（Wolffia arrhiza）處理農場廢水時發現，當生物量密度為12.0 g/L、處理周期為30 d時，蕪萍生長最快；Ge等（2012）研究發現，浮萍在饑餓條件下可積累更多的淀粉。但由于不同地域、不同品種浮萍在污水凈化和生物質積累方面存在明顯差異，因此研究結果也存在差異。于斌（2010）研究發現，揚州地區的稀脈浮萍對稀釋畜禽廢水中氮、磷的去除能力強于少根紫萍，去除率最高可達74.92%和88.00%；毛杉杉等（2012）研究得出浙江浮萍屬（Lemna）植株在污水處理和淀粉積累能力等方面均強于紫萍屬（Spirodela）植株的結論；鮑姝等（2014）研究戶外條件下云南本地4個浮萍品種的氮磷含量及氮磷固定能力存在明顯的種屬差異。雖然Su等（2012）的研究表明長時間保持單一浮萍物種用于污水凈化控制系統的效果不理想，但目前利用浮萍處理污水的研究仍以單一浮萍株系為主，關于浮萍混養組合方面的研究報道僅有1篇，即Zhao等（2014）測量了青萍（L. minor OT）和少根紫萍（L. punctata OT）混養組合在不同生長條件下的生物量，發現混養組合在弱光照條件下可積累更多的淀粉；同時考察了少根紫萍（L. punctata C3）、青萍（L. minor C2）和多根紫萍（S. polyrhiza C1）3種浮萍相互搭配組成的混養組合對養豬場廢水中氮磷的去除率，發現所有的混合組合中，少根紫萍和青萍組成的混養組合具有最高的氮磷去除率和生物質產量。上述研究結果表明，恰當的浮萍混養組合可提高其污水凈化能力和生物量，從而加強植物修復效果?！颈狙芯壳腥朦c】雖然單一浮萍品種對水體中氮、磷的凈化及積累生物質的能力已經得到證實，但浮萍混養組合對污水的凈化能力和其生物質積累情況尚缺乏系統性研究?！緮M解決的關鍵問題】以安徽省合肥市巢湖流域的3種浮萍（青萍、少根紫萍和多根紫萍）為研究對象，通過單獨培養和混合培養、調查浮萍物種多樣性對模擬污水中氮、磷去除的影響及其對浮萍生物質（生物量、淀粉和蛋白質）積累的影響，揭示不同組合浮萍凈化水質的能力和特點及其生物質積累能力。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試浮萍材料均采集自安微省合肥市巢湖流域，分別為青萍（Lemna aequinoctialis LC33）、少根紫萍（Landoltia punctata LC06）和多根紫萍（Spirodela polyrhiza LC15）（Tang et al.， 2015）。將浮萍樣品清洗干凈后，用0.5% NaClO溶液消毒1 min，轉入稀釋10倍的Hoagland培養液[大量元素：680.00 mg/L KH2PO4+

1515.00 mg/L KNO3+1180.00 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+

492.00 mg/L MgSO4·7H2O；微量元素：2.85 mg/L H3BO3+

3.62 mg/L MnCl2·4H2O+0.22 mg/L ZnSO4·7H2O+

0.08 g/L CuSO4·5H2O+0.12 mg/L Na2MoO4·2H2O；其他：酒石酸3.00 mg/L]中，放入光照培養箱培養兩周。光照培養箱環境條件設置為：溫度25 ℃，光照強度5000 lx，光照時間16 h。待其生物量擴大后挑選健康植株，供后續試驗使用。

1. 2 模擬富營養化水體

結合我國主要水體富營養化的水質特征（奚姍姍等，2016），以Hoagland培養液為基礎，模擬富營養化水體，其中總氮（TN）濃度為9.48 mg/L，總磷（TP）濃度為0.72 mg/L。根據孫宜敏（2004）的研究，當硝氮（NO3--N）與氨氮（NH4+-N）的比例為3∶1時，浮萍對TN的去除率最高，因此設NH4+-N濃度為2.37 mg/L，NO3--N濃度為7.11 mg/L。

1. 3 試驗設計

選用直徑12 cm的不透光塑料桶為試驗容器，加入500 mL上述模擬富營養化培養液。初始鮮重投放總量約0.30 g，其中，單種浮萍的投放量為0.30 g，兩種浮萍按1∶1的比例各投放0.15 g，3種浮萍按1∶1∶1的比例每種各投放0.10 g，不同浮萍組合的組成見表1。各試驗組合均設3個重復，共21桶。根據前期對浮萍生長條件的研究，設試驗溫度25 ℃，光照強度7000 lx，光照周期16∶8（光照16 h，黑暗8 h），將上述浮萍置于恒溫光照生物培養箱內連續培養12 d，每隔2 d采樣測定培養液中NH4+-N、NO3--N、TN和TP含量。培養12 d后，測定各浮萍組合的鮮重和干重、淀粉含量、蛋白質含量。培養期間，塑料桶中蒸發的水分可用蒸餾水補充。

1. 4 氮磷去除率測定

培養液中的TN采用堿性過硫酸鉀氧化—紫外分光光度法（HJ 636-2012）測定；TP采用過硫酸鉀消解—鉬酸銨分光光度法（GB 11893-89）測定；NH4+-N采用納氏試劑分光光度法（HJ 535-2009）測定；NO3--N采用氨基磺酸紫外分光光度法（HJ/T 346-2007）測定。去除率計算公式如下：

RE=（C0-Ct）/C0 （1）

式中，RE為營養元素的去除率（Removal efficiency，%），C0為初始時刻的營養元素濃度（mg/L），Ct為t時刻的營養元素濃度（mg/L）。

1. 5 生物量測定

浮萍鮮重（Fresh weight，FW）測定采用Bergmann等（2000）的方法，即用濾水網斗或其他工具將浮萍從水中撈起，除去自由水（無水滴出現），將浮萍置于衛生紙墊上吸水5 min后，用電子天平秤其鮮重。鮮重測定完畢后，將浮萍放于凍干機內凍干24 h，即可測量浮萍干重（Dry weight，DW）。

生物量增長率（g/m2·d）=（收獲時鮮重-投入時鮮重）/（培養時間×培養面積）

1. 6 生物質含量測定

1. 6. 1 淀粉含量測定 淀粉含量運用修改后的酶解法（Smith and Zeeman， 2006）進行測定：稱取50 mg冷凍干燥后的浮萍干粉于50.0 mL離心管，加入1.5 mL 80%乙醇，混勻，于90 ℃水浴15 min，在室溫下離心5 min（12000×g），棄上清液，重復2次上述步驟，直至上清液變澄清；將剩余乙醇蒸發掉，剩余固體轉移至容量瓶中，加蒸餾水定容至10.0 mL，混勻，然后取0.5 mL勻漿至2.0 mL EP管，在100 ℃水浴中加熱10 min；冷卻后加入0.5 mL 200 mmol/L醋酸鈉（pH 4.8）、1 μL淀粉葡糖苷酶（A7095）和1 μL α-淀粉酶（A4582），混勻，37 ℃培養4 h；之后，12000×g離心5 min，得到的上清液即為浮萍淀粉水解產生的葡萄糖。葡萄糖含量采用葡萄糖乳酸生物傳感分析儀（SBA-40E，山東省科學院研究所）進行測定和分析。淀粉含量計算公式為：

淀粉含量=葡萄糖含量×0.909

1. 6. 2 蛋白質含量測定 浮萍干基蛋白質含量按GI3/T 6432執行（Xiao et al.，2013），計算公式如下：

浮萍蛋白質含量=氮元素含量×6.25

1. 7 統計分析

利用Origin 8.5.1和SPSS 18.0對試驗數據進行統計分析，并利用Duncan法進行方差分析。

2 結果與分析

2. 1 對氮磷的去除效果

2. 1. 1 水體NO3--N的去除效果 從圖1可看出，在培養的前2 d，所有水體NO3--N含量基本上未發生變化，可能與浮萍剛開始適應環境、仍處在調整期有關。2 d后，浮萍進入快速生長期，對水體NO3--N的吸收率也極大提高，水體NO3--N濃度開始迅速下降。

由表2可知，經過12 d培養后，3種單獨培養浮萍對NO3--N的去除能力排序為少根紫萍（96.62%）>多根紫萍（94.80%）>青萍（93.67%）；不同混養組合對NO3--N的去除率分別為95.50%（組合4）、95.08%（組合5）、97.05%（組合6）和95.36%（組合7）?？梢?，組合5和組合6均表現出較其組合內單種浮萍更高的NO3--N去除率，而其他浮萍混養組合（組合4和組合7）未表現出明顯優勢。因此，適宜的浮萍混養組合可提高NO3--N的去除率。

2. 1. 2 水體NH4+-N的去除效果 從圖2可看出，水體NH4+-N含量在培養過程的前2～3 d下降了50%～60%，且水體中大部分NH4+-N在8 d后已被去除。由表2可知，經過12 d的培養，3種單獨培養浮萍對NH4+-N的去除能力排序為少根紫萍（97.61%）>多根紫萍（96.35%）>青萍（95.80%）；不同混養組合對NH4+-N的去除率分別為98.03%（組合4）、97.47%（組合5）、97.23%（組合6）和98.17%（組合7）。除組合6外，其他混養組合（組合4、5和7）對NH4+-N的去除率均高于組合中單種浮萍的NH4+-N去除率。說明適宜的浮萍混養搭配可增強對水體NH4+-N的去除效果。

綜合分析2.1.1和2.1.2的結果發現，當水體中同時存在NH4+-N和NO3--N時，浮萍優先利用NH4+-N合成細胞物質（Oron，1994），因此，在培養前期，水體中NH4+-N含量大幅度下降，而NO3--N含量基本未發生變化。之后，當水環境中NH4+-N大量消耗時，浮萍開始吸收NO3--N進行生命活動（Caicedo et al.， 2000），對NO3--N的去除率明顯增加。產生這種現象的主要原因可能是細胞利用NH4+-N來合成氨基酸和蛋白質所需能耗較低（Oron， 1994）。

2. 1. 3 水體TN的去除效果 7種浮萍組合對水體TN的去除效果見圖3。由表2和圖3可知，經過12 d的培養，3種單獨培養浮萍對TN的去除能力排序為少根紫萍（94.03%）>多根紫萍（92.14%）>青萍（91.58%）；不同混養組合對TN的去除率分別為94.86%（組合4）、94.30%（組合5）、95.00%（組合6）和93.63%（組合7）。除組合7外，由兩種浮萍組成的所有混養組合（組合4、5和6）對TN的去除率均高于單種浮萍的去除率，說明兩種浮萍組成的混養組合對TN的去除效果更佳。因此，適宜的浮萍混養組合可提高對水體TN的去除效果。

2. 1. 4 水體TP的去除效果 7種浮萍組合對水體TP的去除效果與對TN的去除效果相似（圖4）。在培養的前8 d，所有組合的水體TP含量呈下降趨勢，8 d后大部分P被去除；在培養的最后4 d，去除效率明顯降低，可能是由于TP濃度過低，不利于浮萍的生長所致。由表2可知，經過12 d的培養，3種單獨培養浮萍對TP的去除能力排序為多根紫萍（97.08%）>少根紫萍（95.42%）>青萍（94.17%）；不同混養組合對TP的去除率分別為94.86%（組合4）、97.36%（組合5）、97.64%（組合6）和97.22%（組合7）。除組合4外，其他由2種和3種浮萍組成混養組合（組合5、6和7）對TP的去除率均高于組合中單種浮萍的去除率。說明適宜的浮萍混養組合可增強浮萍對水體TP的去除效果。

綜合來看，對NH4+-N、NO3--N和TN的去除，單種浮萍的去除能力排序為少根紫萍>多根紫萍>青萍；對TP的去除能力排序為多根紫萍>少根紫萍>青萍。在所有組合中，組合6（少根紫萍+多根紫萍）對水體中NO3--N、TN和TP的去除率最高，組合7（青萍+少根紫萍+多根紫萍）對NH4+-N的去除率最高。因此，通過適宜的浮萍混養組合可提高水體凈化效果。

2. 2 生物質的積累

浮萍的生物質產量對浮萍資源化利用具有重要意義。淀粉是浮萍含量最多的活性成分之一，也是浮萍作為新一代生物能源原料的關鍵因素。此外，浮萍植物體蛋白質含量也很高，可達干重的45%，且不含毒生物堿，飼料系數約30，是一種很有發展前景的蛋白質飼料源（孔春林和陳宇，2006）。本研究探討了3種試驗浮萍（青萍、少根紫萍和多根紫萍）在單種培養和混合培養組合下生物量、淀粉和蛋白含量的差異。

2. 2. 1 浮萍的生長情況 由表3可知，單種浮萍積累生物量的能力排序為青萍>少根紫萍>多根紫萍，其生物量增長率分別為9.45、8.87和7.83 g/m2·d；不同混養組合生物量增長率分別為9.87（組合4）、9.12（組合5）、9.93（組合6）和9.29 g/m2·d（組合7），其中，組合4的生物量增長率比單種青萍和少根紫萍分別高2.30%和11.27%，組合6的生物量增長率比單種少根紫萍和多根紫萍分別顯著高12.00%和26.82%（P<0.05，下同）。說明適宜的浮萍混養組合能促進浮萍生長，提高生物量，其原因可能是種間組合通過競爭機制刺激了浮萍的生長能力。

2. 2. 2 淀粉的積累 由表3可知，青萍、少根紫萍和多根紫萍的淀粉含量差別不明顯，分別為13.74%、14.29%和15.99%；不同混養組合的淀粉含量分別為15.28%（組合4）、15.15%（組合5）、15.03%（組合6）和15.69%（組合7），其中，組合4的淀粉含量比單種青萍和少根紫萍顯著高11.21%和7.00%，多根紫萍的淀粉含量最高，顯著高于除組合7外的其他組合。表明適宜的浮萍混養組合能促進浮萍積累更多淀粉，可能是混合培養提高了整個混養組合的光合作用效率，從而促進了淀粉的積累。

2. 2. 3 蛋白質的積累 由表3可看出，單種浮萍體內的蛋白質含量為青萍>少根紫萍>多根紫萍，其蛋白質含量分別為23.40%、22.19%和20.73%；不同混養組合的蛋白質含量分別為22.65%（組合4）、23.24%（組合5）、23.07%（組合6）和22.44%（組合7），其中，組合5的蛋白質含量最高，與青萍及組合6差異不顯著（P>

0.05），組合6的蛋白質含量比單種少根紫萍和多根紫萍顯著高4.00%和11.29%。說明適當種類的浮萍混合培養可提高其蛋白質含量，可能是混合培養促進了不同種浮萍間對氮元素的吸收，從而促進了蛋白質的合成。

3 討論

Zhao等（2014）測量了青萍和少根紫萍的混養組合在不同生長條件下的生物量和淀粉含量，但未對浮萍生物質的主要組成部分蛋白質進行研究。本研究以3種浮萍構成的7種浮萍組合為研究對象，系統地研究浮萍多樣性對富營養化水體中多項水質指標及生物質積累的影響，為未來大規模利用浮萍處理富營養化水體提供了理論基礎。此外，Zhao等（2014）通過研究少根紫萍、青萍和紫萍相互搭配組成的混養組合對養豬場廢水中氮磷去除率，發現少根紫萍和青萍組成的混養組合具有最高的氮磷去除率和生物質產量。本研究發現，不同浮萍混養組合對水體中NH4+-N、NO3--N、TN和TP的去除效果也存在差異。與單種浮萍或3種浮萍構成的混養組合（組合7）相比，兩種浮萍構成的混養組合（組合4、5和6）對水體TN的去除率較高；對于NO3--N的去除，青萍+多根紫萍（組合5）及少根紫萍+多根紫萍（組合6）的去除率也高于單種浮萍；對于NH4+-N和TP的去除，除少根紫萍+多根紫萍混養組合對NH4+-N的去除及青萍+少根紫萍混養組合對TP的去除外，其他由2種或3種浮萍混養組合水體中的氮磷含量均低于浮萍單種培養后水體中的氮磷含量。同時，混養浮萍的生物量、淀粉積累量和蛋白質產量均高于單種浮萍。其中，青萍+少根紫萍混養組合的生物量（9.87 g/m2·d）比單種少根紫萍（8.87 g/m2·d）增加11.27%，淀粉含量（青萍+少根紫萍：15.28%；少根紫萍：14.29%）增加7.00%；少根紫萍+多根紫萍混養組合的生物量（9.93 g/m2·d）比單種多根紫萍（7.83 g/m2·d）增加26.82%，蛋白質含量（少根紫萍+多根紫萍：23.07%；多根紫萍：20.73%）增加11.29%。本研究結果表明，不同來源浮萍組成混養體系的富營養化水體凈化效果及其生物質產量存在明顯差異。因此，篩選適合當地富營養化水體修復的浮萍組合是提高其水體凈化效果的關鍵。

以上研究結果表明，浮萍混合培養是一種有效促進凈化富營養化水體能力和增加生物質產量的方法，其促進機理可能是：（1）混合培養增強了浮萍組合抵抗不利環境條件的能力（Griffith et al.， 2011）；（2）浮萍遺傳多樣性可能會通過選擇效應增加高效基因型的概率，從而促進具有抵抗型基因型浮萍的生長（Chen et al.， 2014）；（3）由于不同種類浮萍對氮磷的吸收率不同，混養搭配可使組合中的個體分別利用本身優勢，實現資源的互補效應和生態位分化，從而提高整體效果（Crawford and Whitney，2010）。

本研究系統分析了浮萍多樣性對富營養化水體凈化效果及生物質積累情況的影響，發現適宜的浮萍混養組合可提高對水體TN、TP的凈化效果和生物質產量，但對其中的促進機制尚不清楚，今后將從生態學、生理學及分子生物學等角度進一步探索混養組合的代謝機理。

4 結論

適當的浮萍混養搭配不僅可提高富營養化水體凈化效果，還能促進生物質的積累。該研究結果為實現生物質生產與環境治理雙贏提供了新思路。

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（責任編輯 鄧慧靈）