牛源性成分核酸檢測方法研究進展及技術標準分析

周李華 馬麗俠 李懷平 孫登峰 沈興中 葉德萍 劉明東

摘 要：牛肉制假、摻假問題嚴重侵害消費者權益，影響進出口貿易。目前，基于DNA序列特異性以動物物種之間遺傳信息的差異作為物種鑒定檢測靶標的核酸檢測方法已被廣泛應用。該文綜合論述牛源性成分核酸檢測技術的研究進展，并對其發展趨勢進行討論。同時對牛源性成分檢測的國內現行技術標準的適用范圍、檢測方法、檢出限等進行詳細分析，以供相關執法部門和廣大檢測工作者參考，為制修訂牛源性成分檢測技術標準提供理論依據。

關鍵詞：牛源性；核酸；PCR；技術標準

文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2017）12-0050-08

Abstract： Beef fraud， adulteration problems seriously violates the health and interests of the consumers， even influences import and export trade. The nucleic acid detection method based on the DNA sequence specificity that uses genetic information among different animal species as a detection target of species identification has been widely used. This review summarizes the advances in nucleic acid detection techniques available for bovine derived material and discusses the development trend. At the same time， the applicable range， detection method and detection limit of the current China detection standards for bovine derived components were analyzed. In detail for reference by the relevant law enforcement departments and the majority of inspection workers， and lay the foundation for the revision of the technical standards for detection of bovine derived components.

Keywords： bovine derived； nucleic acid； polymerase chain reaction； technical standards

0 引 言

動物源性成分廣泛分布于食品、飼料、化妝品等，與人們的生活息息相關，其中食品和飼料所占比例最大。中國是世界上人口最多的國家，也是世界動物源性食品和飼料的生產和消費大國。統計數據顯示，2015年，我國牛肉產量達到700萬噸[1]。自2004年以來的世界性瘋牛病、禽流感、羊搔癢病，以及2013年涉及歐洲l6國的馬肉風波等事件曝光以來，肉及肉制品摻假成為世界各國共同關注的熱點問題[2]，肉食品及其飼料的安全隱患直接關系到人類的安危[3]。為保護消費者權益，全球不同國家和地區對肉制品的標識要求都做了不同程度的規定。歐盟定量成分聲明（quantitative ingredient declaration，QUID）強制要求肉制品需要標識出所有成分及其凈含量，詳細規定了凈含量的計算方法[4]。美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）食品標簽指南規定肉制品中需要標識出所有成分，并在食品外包裝的主展示面上根據質量按照降序羅列所有成分。《中華人民共和國食品安全法》第六十七條規定，預包裝食品的包裝上應當有標簽，標簽應當標明名稱、凈含量、成分或者配料表等事項。

綜上所述，各國已有肉制品標識的法律法規來約束生產者和經營者的行為，但要保障相關法規的有效執行，還需要借助科學精準的檢測方法，完善技術標準體系。本文就目前牛源性成分檢測的主流技術——核酸檢測方法[5]的研究進展進行分析和總結，同時對國內牛源性成分檢測現行技術標準狀況進行了梳理，并對該領域的未來發展方向進行了探討。

1 牛源性成分檢測方法研究進展

近幾十年來，以核酸為標志物的動物種類鑒別檢測方法飛速進步，并獲得了廣泛應用。常用于動物源性成分的核酸檢測方法主要包括核酸雜交，聚合酶鏈式反應（PCR）技術及衍生方法，實時熒光PCR技術，以及近年來發展起來的數字PCR技術，液相芯片技術，DNA條形碼技術等。

1.1 核酸雜交技術

早期研究中多用DNA雜交完成動物源性成分鑒定，該方法將用放射性同位素標記的動物全基因組DNA物種特異性探針與固定到尼龍膜上的樣品DNA進行雜交，根據產生的放射信號鑒定樣品的物種組成。利用這種方法對加工過的牛肉和豬肉的混合制品[6]進行同源性鑒定，得到了良好的效果。但由于方法耗時長、有放射性、對DNA的純度要求高，探針信號的強度常受到樣品組織來源或其加工方式等因素的影響，且靈敏度不高，定量困難，因此在實際應用中受限。

1.2 常規PCR技術

常規PCR技術是相對于熒光定量PCR技術而言的，該技術是核酸檢測的基礎技術。其突出特點是具有很高的靈敏度，是傳統形態學方法、基于代謝物的檢測方法以及基于蛋白的檢測方法不可比擬的。這在檢測加工牛肉制品和飼料中的牛源性成分時極為重要。該技術不僅可用于分辨動植物種類，也用于動物的品種鑒別和身份識別，并廣泛應用于肉類的溯源體系。歐盟、加拿大、澳大利亞等國家都相繼建立肉類溯源管理系統。當肉制品發生污染時，對其DNA標記進行檢測可以快速地追溯到它的親本和產地等來源信息。此法用于牛源性成分鑒定的目的基因通常位于線粒體上，可用于生鮮牛肉和烹煮牛肉等的測定，檢出限一般在1%以下，部分見表1。

在常規PCR基礎上延伸發展起來的有聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）、聚合酶鏈式反應-隨機擴增多態性DNA（PCR-RAPD）、微衛星標記檢測法（SSR）等技術。PCR-RFLP結合了RFLP與PCR技術的特點，通過限制性內切酶識別雙鏈DNA分子的特定序列，然后利用指紋圖譜對形成的長度不等的限制性片段進行多態性分析的技術[29]。該技術的缺點是操作中DNA用量大，純度要求高，DNA的污染（如蛋白質、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高濃度鹽）均能抑制酶切活性；此外，由于操作環節多、周期長、容易受到目標基因序列中酶切位點隨機突變的影響，易產生檢測結果的不確定性，如有些酶由于受旁側核苷酸甲基化的影響，導致在特異位點的切割效率降低，限制了RFLP技術的應用。PCR-RAPD能夠檢測多個基因位點，無須預先知道被研究生物基因組的核苷酸序列，因此此法不僅是鑒定家畜，而且是鑒定稀有物種（未知來源）的有效手段。Saez等[30]運用PCR-RAPD技術可以從加工過的食品中，鑒定出豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、火雞肉等成分。但由于RAPD引物擴增結果差，條帶模糊或難以辨認，且隨機擴增的重現性差[31]，該技術在動物源性成分鑒定方面的研究不多。微衛星DNA又稱簡單重復序列（simple sequence repeats，SSRs），由核心序列與兩側保守的側翼序列構成，具有種間特異性特點。孫金婷[32]篩選出了適合鑒別牛源性的微衛星標記AF271972、AF271980和AB463，可用于牛源性成分的鑒定。Calvo等[33]篩選出擴增的目的片段為84 bp的微衛星標記X00979，該標記的靈敏度可以達到0.005%。在模擬的生豬肉和生牛肉的混合物中，能檢測出0.01%的牛肉，相當于可以檢測到的牛DNA的含量在2.5 pg；在模擬的熟豬肉和熟牛肉的混合物中，能檢測出1%的牛肉。與其他技術相比，微衛星標記技術特異性高，分布數量廣，穩定性好、突變率低，適合大量樣品的檢測。利用牛的特異性微衛星標記來鑒定牛源性成分是一種新的、經濟的嘗試方法。

1.3 實時熒光PCR技術

實時熒光PCR技術融匯了PCR技術和DNA探針雜交技術（標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團）。其優點是反應快速簡便，檢測效率高；特異性強，避免假陽性；靈敏度高。用于動物源性成分實時熒光PCR檢測的主要是TaqMan探針和SYBR GreenⅠ染料[34]。此方法是目前牛肉及其制品中牛源性成分檢測應用的主要技術，目的基因有在線粒體也有在其他組織，檢出限基本能達到0.1%以下，見表1和表2。

多重實時熒光PCR法是在實時熒光PCR技術的技術上發展起來的。可以針對多個核酸，同時擴增出多個擴增曲線的PCR反應，提高了檢測效率與檢測通量。曾少靈等[35]根據牛、山羊和綿羊線粒體細胞色素b基因序列，設計引物探針，建立了能同時鑒別牛、山羊和綿羊源性成分的三重實時熒光PCR方法，可以在一個PCR反應中同時鑒別牛、山羊和綿羊3種源性成分，檢測效率與檢測通量得到了很大的提高；楊冬燕等[36]在常規熒光PCR檢測一種摻假成分的基礎上，成功建立了可以同時檢測牛、豬和馬，牛、馬和鴨，牛、鴨和豬的三重熒光PCR檢測體系。多重實時熒光PCR優點是快速、節約試劑，且由于多對引物的存在，能避免假陽性的結果。但設計引物探針時，應注意所有引物探針的Tm值應相近。

1.4 數字PCR技術

數字PCR（digital PCR，dPCR）是近年來發展起來的新技術，是對傳統PCR方法的技術革新。它可通過讀取熒光信號的有或無進行計數，經過統計學泊松分布的校準進行絕對定量[37]。目前，通過數字PCR技術對肉及肉制品摻假成分進行定性和定量檢測的研究才興起，有少部分學者成功建立了不同動物源性成分的檢測體系。Floren等[38]以微滴式數字PCR技術為基礎，通過線粒體和核基因的比較，選擇以單拷貝的F2基因為靶基因設計引物探針，對牛肉、馬肉和豬肉的混合物進行定量檢測，定量限為0.01%，檢出限為0.001%。苗麗等[39]基于微滴式數字PCR技術，在一定范圍內生鮮肉樣品的質量與DNA質量、DNA質量與DNA的拷貝數之間均存在線性關系，可以借由此完成DNA的拷貝數與生鮮肉質量的轉化，建立了定量檢測肉及肉制品中牛肉和豬肉的方法。數字PCR可以對樣品進行絕對定量，直接檢測出樣品中的拷貝數，數據重復性好，而且樣本需求較低，與實時熒光定量PCR相比，它不需要建立標準曲線，靈敏度更高。

1.5 液相芯片技術

液相芯片技術利用懸浮在液相中的分類熒光編碼微球作為檢測載體，提供一種能夠充分進行反應的液相環境，它將流式細胞術、激光技術、應用流體學和數字信號處理技術等結合在一起，具有高通量、快速靈敏、特異性強、檢測范圍廣等特點[40-41]。目前，將液相芯片技術應用于動物源性成分檢測方面的報道較少。但作為新一代分子診斷技術，液相芯片在食品安全檢測、醫學診斷、農業檢測和環境監測等方面得到了廣泛應用[42-44]。

1.6 DNA條形碼技術

DNA條形碼是指生物體內能夠代表該物種的標準的、有足夠變異的、易擴增、片段較短的DNA片段[45]。常用線粒體細胞色素C氧化酶亞基I（COX I）基因的一個特定片段DNA作為動物的條形碼[46]。目前，DNA條形碼技術的研究已應用于很多禽畜及海洋動物，如鱈魚[47]、鯰魚[48]、蝦[49]等。王東亮[50]以6種畜禽生鮮肉（牛肉、豬肉、羊肉、雞肉、鴨肉和鵝肉）和市售牛肉干作為研究對象，以基因組DNA電泳圖、PCR產物電泳圖及DNA測序圖為評價依據，采用基于COX I基因和16S rRNA基因的DNA條形碼技術驗證了其在畜禽肉及肉制品種屬鑒定中的可行性。研究發現，經過油炸處理后（處理時間小于5 min）的生鮮肉，仍可用DNA條形碼方法鑒定種屬，且16S rRNA比COX I基因更適合于深加工肉制品種屬的鑒定。根據DNA測序圖中雜峰的數量判斷被測樣品摻雜的程度，但無法同時鑒定出混合肉中每種成分的種屬。

由DNA條形碼技術衍生出來的宏條形碼技術結合了DNA條形碼技術和高通量測序技術的共同優點，可以獲得來自于混合樣品中所有目標DNA片段的序列，然后將這些序列與合適的數據庫進行比對即可確定其代表的物種，進而可以分析出被測樣品中的物種種屬[51]。宏條形碼技術對于食品類型鑒定，特別是對于未知食品、復雜食品或者深加工食品來說有著非常重要的作用，為科研人員分析物種成分提供了一個新的研究手段[52]，是一種快速、簡便與經濟的物種鑒定方法。

2 牛源性成分檢測現行國內技術標準分析

目前我國用于牛源性成分檢測的現行技術標準有14項，其中國家標準共有5項（含1項即將發布的標準），行業標準6項，地方標準1項，農業標準1項，商業標準1項。本文就每項標準的適用范圍、目的基因、檢出限等進行了梳理，見表3。

SN/T 1119——2002《進出口動物源性飼料中牛羊源性成分檢測方法 PCR方法》[62]是我國出入境檢驗檢疫行業第一個用于檢測動物源性飼料的標準，主要適用于動物源性飼料中牛源性成分的檢測。GB/T 20190——2006《飼料中牛羊源性成分的定性檢測定性聚合酶鏈式反應（PCR）法》[53]不僅僅適用于動物源性飼料，也適用于以植物為主要基質的配合飼料和濃縮飼料，適用范圍比SN/T 1119-2002中的廣。NY/T 1946——2010《飼料中牛羊源性成分檢測實時熒光聚合酶鏈反應法》[65]適用于動物源性飼料、配合飼料、濃縮飼料及精料補充料中的牛源性成分，適用范圍比SN/T 1119——2002、GB/T 20190——2006廣，采用實時熒光PCR法，方法也更先進、快捷，檢出限為0.1%。GB/T 21103——2007《動物源性飼料中哺乳動物源性成分定性檢測方法實時熒光PCR方法》[54]適用于動物源性飼料中哺乳動物源性成分的檢測，采用多重PCR方法，在同一反應管內對牛、綿羊、山羊、豬、兔、鹿、馬、驢、狗和貓等哺乳動物同時進行擴增，適用于鑒定含有未知成分的樣品，但是當樣品檢測結果為陽性時僅僅能判定為含有哺乳動物源性成分，而檢測不出具體的動物源性成分。GB/T 21104——2007《動物源性飼料中反芻動物源性成分（牛，羊，鹿）定性檢測方法 PCR方法》[55]主要適用于動物源性飼料中反芻動物-牛、羊、鹿的源性成分檢測。

SN/T 2980——2011《動物產品中牛、山羊和綿羊源性成分三重實時熒光PCR檢測方法》[59]實用性較廣，適用于肉品、奶品、飼料、生皮、動物油脂等多種動物產品的牛源性成分檢測。與山羊、綿羊、鹿、馬、驢、豬、貓、狗、兔、魚、雞、鴨、鵝、鴿子、火雞、鴕鳥等動物之間特異性良好，不存在交叉反應。該標準單一熒光PCR檢測和多重實時熒光PCR檢測都可以應用，并且多重與單一熒光PCR檢測的檢測限一致，比GB/T 20190——2006大約靈敏10倍，即0.025%[35]。SN/T 2557——2010《畜肉食品中牛成分定性檢測方法實時熒光PCR法》[58]主要適用于新鮮肉、冷凍肉和深加工食品中牛源性成分的定性檢測，如肉干、肉醬、火腿、肉松等，檢出限為0.1%。與馬、豬、野豬、兔、貓、雞、火雞、比目魚、大比目魚9種動物之間特異性良好，不存在交叉反應，但與鹿科動物和綿羊存在交叉反應。靈敏度方面新鮮肉的檢測限為0.01%，即0.02 ng；而對于深加工食品（比如罐頭肉）的靈敏度則較低，為0.1%[25]。

SN/T 2051——2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法-實時PCR法》[57]適用于食品、化妝品和飼料中牛源性成分的鑒別檢測，用雙標記熒光PCR技術，根據線粒體 COX I基因上動物種間多態性的差異進行牛羊源性成分鑒定，可以在一次PCR反應中實現對樣品中豬牛羊源性成分的定性檢測，測定底限為0.1%。寶生物工程（大連）有限公司將該標準方法開發成牛源性成分實時熒光PCR檢測試劑盒（貨號No.RR910）。該標準無需電泳，簡單快速，但價格較高，按照標準要求，每個樣品需設置2～3個平行反應體系及陽性對照、陰性對照、空白對照，原價平均40元/次，做1個樣品需要花費200～240元，對于經費充裕的實驗室來講是個不錯的選擇。啟封新的試劑盒后，注意分裝，-20 ℃保存。運用該標準檢測醬牛肉、肥牛卷、牛肉干、牛肉松、牛排、牛肉餡餃子等中的牛源性成分，結果顯示除了3份假冒牛肉外，其余樣品均可檢測出牛源性成分，說明標準適用范圍較廣[28]。

SN/T 3730.7——2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第7部分：水牛成分檢測實時熒光PCR法》[60]適用于食品和飼料中水牛成分的定性檢測，適用對象較單一，只針對水牛，未涉及到黃牛、牦牛等其他牛的成分，在一定程度上使用受限。SN/T 4397——2015《出口食品中牦牛源性成分的檢測方法實時熒光PCR法》[61]只適用于肉及肉制品中牦牛源性成分的定性檢測。在九龍牦牛、青海高原牦牛、麥洼牦牛、甘南牦牛、巴州牦牛、斯布牦牛、中甸牦牛、嘉犁牦牛8個牦牛品種中穩定性表現一致；與山羊、綿羊、豬、雞、黃牛、水牛、驢、馬、兔9種動物之間特異性良好，不存在交叉反應[66]。SB/T 10923——2012《肉及肉制品中動物源性成分的測定實時熒光PCR法》[64]主要適用于鮮（凍）肌肉組織或經過初步加工的鮮（凍）生肉制品，不適用于深加工的肉制品，適用范圍較窄。地方標準SZDB/Z268——2017《動物產品及飼料中黃牛、水牛和牦牛源性成分實時熒光PCR檢測方法》[63]的適用范圍是動物產品和飼料，不僅可以檢測單一源性成分，也可以用三重實時熒光PCR同時檢測黃牛、水牛和牦牛源性成分。

《動物制品中動物源性檢測基因條碼技術 Sanger測序法》即將發布，其基于DNA條形碼技術，根據樣品類型選擇基因條碼引物，制定了涵蓋常見哺乳類、禽類、魚類動物的肉、乳、血液、毛發、角骨、內臟、皮張等來源的動物制品及飼料物種的Sanger測序方法標準，該方法通過一次實驗，就可以高通量、快速、準確地完成對未知動物成分和混合樣品成分的定性檢測，為動物成分的真偽提供一些依據，解決動物制品摻假比較難以測出的難題。相對實時熒光PCR方法，該方法流程較多，成本偏高。

3 結束語

各國學者近年來基于各類技術平臺研究肉制品中動物種類的定性定量檢測方法，大致可分為形態學方法、基于代謝物的檢測方法以及基于蛋白、核酸的檢測方法。隨著食品摻假、制假水平的提高及樣本量大、頻次高、時效性強的食品抽檢，急需一些快速、準確、靈敏的篩查方法。核酸檢測方法因準確、快速、靈敏度高、特異性好而廣泛應用于動物源性成分的檢測。盡管近年來實時熒光PCR技術在牛源性成分及其他動物源性成分定性定量檢測中發揮著舉足輕重的作用，但是相關方法的完善和推廣仍然面臨著諸多挑戰。由于不同動物樣品性別、年齡、組織器官和肌肉類型等的DNA總量，特別是線粒體DNA總量存在很大差異，另外樣本不同，不同組織DNA提取難度和提取純度也不一樣，使得較難確定標準樣品，并且擴增的靶序列不同，PCR反應效率之間的差異也會對檢測結果產生影響，阻礙方法的標準化進程。數字PCR技術等新技術為動物源性成分檢測開辟了新的途徑。但是在已建立的數字PCR定量檢測方法中DNA的拷貝數與肉的質量分數轉化方面還有待研究。

隨著分子生物學的發展，動物源性成分的檢測技術也在不斷完善和創新，正向著高靈敏度、高特異性、高通量、自動化和低成本的方向發展。以動物作為原料的食用性制品的生產和消費在我國國民經濟中占據重要地位，隨著食品質量安全監管水平的不斷提升、消費者維權意識的不斷加強，進一步研究開發快速、準確、高效、多組分動物源性成分檢測方法是未來的發展趨勢。在技術標準方面，目前牛源性成分檢測技術國家標準主要適用于飼料，無法用于食品檢測。現有行業標準等涉及食品中的動物源性成分檢測存在交叉重復性，需要經過進一步驗證、歸攏、整理。多技術多方法可選，多參數多成分可測的基礎性通用技術標準的研制更能有效地推廣實施。

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（編輯：莫婕）