HPLC法測(cè)定生脈注射液中特征成分莽草酸

吳建國(guó) 董禮 陳虹靜 徐小平

摘 要：采用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)生脈注射液中莽草酸成分進(jìn)行確認(rèn)，建立高效液相色譜法測(cè)定生脈注射液中莽草酸含量。采用液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定目標(biāo)峰的分子離子峰m/z：173.08[M-H]-，與莽草酸對(duì)照品對(duì)比確認(rèn)目標(biāo)峰為莽草酸成分；色譜柱采用Synergi Hydro-RP 80A（250 mm×4.6 mm，4 μm），以20 mmol/L的KH2PO4（H3PO4調(diào)pH至2.5）溶液為流動(dòng)相，流量為0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；莽草酸在0.02～0.64 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 8，精密度、重復(fù)性試驗(yàn)RSD分別為0.15%和1.49%，平均加樣回收率為99.2%，RSD=1.56%。該研究首次確認(rèn)生脈注射液中含有莽草酸成分，且該成分來源于五味子；含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、可靠，可作為生脈注射液中五味子成分質(zhì)量控制檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：生脈注射液；質(zhì)量控制；有機(jī)酸；高效液相色譜

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-5124（2017）12-0041-04

Abstract： Identification of shikimic acid in Shengmai injection was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry，To establish an HPLC method for determining Shikimic acid in Shengmai injection. The liquid chromatography-mass spectrometry determination confirmed that the target peak was Shikimic acid by comparing the molecular ion peak weight（m/z：173.08[M-H]-） with Shikimic acid standard substance.The analysis was performed on a Synergi Hydro-RP 80A（250 mm×4.6 mm，4 μm）， mobile phase was 20 mmol/L KH2PO4 （tune pH to 2.5 with H3PO4）， flow rate was 0.6 mL/min， detection wavelength at 214 nm. It was a good linear relationship of Shikimic acid content among 0.02 to 0.64 μg， r=0.999 8. The RSD of precision and repeatability were 0.15% and 1.49% respectly. The average recovery was 99.2%， RSD=1.56%. The study identified the existence of Shikimic acid in Shengmai injection for the first time. And the component derived from Schisandra chinensis. The content determination method was accurate and reliable. It could be used for the quality control of Schisandra chinensis in Shengmai injection.

Keywords： Shengmai injection； quality control； organic acid； HPLC

0 引 言

生脈注射液為華西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院根據(jù)我國(guó)古驗(yàn)方“生脈散”研制而成的中藥注射劑，由紅參、麥冬、五味子3味藥組成[1]。五味子性溫，味酸、甘，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效，主要用于久嗽虛喘、滑精尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、心悸失眠等癥[2]。五味子中化學(xué)成分為揮發(fā)性成分、木脂素類、有機(jī)酸類、多糖類及其他成分[3]。2011年10月25日，由國(guó)家藥典委員會(huì)審定，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布正式執(zhí)行生脈注射液新質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4]。該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)五味子中特征成分，五味子醇甲進(jìn)行了定量控制，但對(duì)有機(jī)酸成分未進(jìn)行控制。莽草酸，廣泛存在于八角茴香[5]、五味子[6]、松柏[7-8]、銀杏[9]等植物中；是抗擊禽流感最有效藥物“達(dá)菲”的主要合成原料[10]，文獻(xiàn)報(bào)道，莽草酸具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，可改善AS大鼠炎癥狀態(tài)，能夠抑制sPLA2-IIA mRNA[11]，對(duì)小鼠具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[12]；提示莽草酸為生脈注射液中有效成分之一。目前，關(guān)于五味子莽草酸含量測(cè)定研究未見報(bào)道，紅參、麥冬藥材中也未發(fā)現(xiàn)莽草酸成分。因此，為加強(qiáng)生脈注射液五味子成分的質(zhì)量控制，本文將采用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)生脈注射液中莽草酸成分進(jìn)行確認(rèn)，并用高效液相色譜法測(cè)定本品中莽草酸的含量，為生脈注射液的質(zhì)量研究提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀 器

Agilent 1100高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；LCQ-FLEET液質(zhì)聯(lián)用儀（賽默飛世爾科技有限公司）；METTLER TOLEDO XA205DU型電子天平（梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）。

1.1.2 試 劑

磷酸二氫鉀（分析純，天津市博迪化工有限公司）；乙腈（色譜純，Merk）；莽草酸對(duì)照品（MUST-11061702，成都曼斯特標(biāo)準(zhǔn)品有限公司）；生脈注射液由雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；實(shí)驗(yàn)所有用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測(cè)條件

高效液相色譜條件：色譜柱采用Synergi 4 μm Hydro-RP 80 A（250 mm×4.6 mm，4 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相為20 mmol/L的KH2PO4（H3PO4調(diào)pH到2.5）；流量：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。

液質(zhì)聯(lián)用色譜條件：色譜柱采用Synergi 4 μm Hydro-RP 80 A（250 mm×4.6 mm，4 μm）；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液；流量：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源（ESI），負(fù)離子檢測(cè)方式，掃描范圍50～500 m/z。鞘氣壓力：40 psi（1 psi=6.895 kPa），輔氣壓力：10 psi，毛細(xì)管溫度320 ℃。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取莽草酸對(duì)照品適量，用2 mmol/L的KH2PO4溶液（H3PO4調(diào)pH至2.5）稀釋至128 μg/mL，得對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋至25.6 μg/mL，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備

取生脈注射液適量，用純化水稀釋50倍，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得陽性供試品；取紅參、麥冬原料，照生脈注射液制法[4]，制得缺五味子陰性樣品，再用純化水稀釋50倍，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得陰性供試品。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜峰的確認(rèn)

2.1.1 色譜柱的選擇

采用反相高效液相色譜分離有機(jī)酸，色譜柱須耐受高比例水相。本研究采用Synergi 4 μm Hydro-RP 80 A色譜柱，該色譜柱能夠耐受100%水相流動(dòng)性。同時(shí)該色譜柱填料粒徑為4 μm，色譜柱粒徑越小，塔板高度越低，柱效越高[13]，能夠提供更好的色譜分離能力。

2.1.2 專屬性確認(rèn)

取莽草酸對(duì)照品、供試品（生脈注射液）、缺五味子陰性供試品，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1，從圖中可以看出，莽草酸色譜峰無干擾，說明莽草酸檢測(cè)專屬性良好。

2.1.3 質(zhì)譜確認(rèn)

取莽草酸對(duì)照品、供試品（生脈注射液），按質(zhì)譜色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖2，從圖中可以看出，生脈注射液中，與莽草酸對(duì)照品保留時(shí)間相同的位置出現(xiàn)分子離子峰相同的色譜峰[M-H]-173.08，說明生脈注射液中確實(shí)存在莽草酸。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道莽草酸色譜檢測(cè)波長(zhǎng)有203[14]，213[7]，214[15]，217[8]，220 nm[16]。為確定莽草酸的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，本研究采用DAD檢測(cè)器檢測(cè)莽草酸色譜峰光譜圖，見圖3，從圖中可知莽草酸在該流動(dòng)相下最大吸收波長(zhǎng)為214 nm。因此，選擇214 nm波長(zhǎng)為莽草酸含量測(cè)定的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

精密吸取莽草酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用2 mmol/L的KH2PO4（H3PO4調(diào)pH至2.5）溶液稀釋為4，8，16，

32，64，128 μg/mL的溶液。精密吸取5 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析。以莽草酸峰面積（y）對(duì)進(jìn)樣量（x），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=4.97×103x+43.4，r=0.999 8，結(jié)果表明莽草酸進(jìn)樣量在0.02～0.64 μg范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量之間呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 進(jìn)樣精密度

取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，以莽草酸峰面積計(jì)算RSD=0.15%，結(jié)果表明進(jìn)樣精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)生脈注射液（批號(hào)：130507）6份，照1.2.3項(xiàng)制得陽性供試品6份，分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量5 μL，以莽草酸峰面積計(jì)算RSD=1.49%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 中間精密度

取同一批號(hào)生脈注射液（批號(hào)：130507），分別在不同時(shí)間（7 d），隨機(jī)3人，照1.2.3項(xiàng)制得陽性供試品，檢測(cè)莽草酸含量。以莽草酸含量計(jì)算RSD=2.25%，結(jié)果表明方法中間精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.3.4項(xiàng)下一陽性供試品，在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，以莽草酸峰面積計(jì)算RSD=0.85%，結(jié)果表明莽草酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取生脈注射液（批號(hào)：130507，照1.2.1色譜條件測(cè)得莽草酸含量為1.31 mg/mL）9份，每份0.1 mL，置于5 mL容量瓶中；精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.5，

1.0，0.5 mL各3份，分別加入容量瓶中；用純化水稀釋至刻度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，制得供試品溶液。照2.1色譜方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率，得平均回收率為99.2%，RSD=1.56%，見表1。

3 結(jié)束語

本文建立了生脈注射液中五味子特征成分莽草酸的高效液相測(cè)定方法；通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合莽草酸對(duì)照品，確認(rèn)了生脈注射液中含有莽草酸；通過方法學(xué)考察，表明生脈注射液中莽草酸含量測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠。莽草酸作為生脈注射液中五味子成分的特征成分，具有很好的藥理活性，且含量較高，因此，莽草酸含量測(cè)定可以作為生脈注射液質(zhì)量控制的新指標(biāo)；為本品在五味子成分方面的質(zhì)量控制進(jìn)一步提升提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 汪祺，鄭笑為，于健東，等. 生脈注射液中皂苷類化學(xué)成分的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2013，38（11）：1731-1734.

[2] 中國(guó)藥典：一部[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：66-67.

[3] 羅家洪，莊艷. 五味子化學(xué)成分及生理活性研究進(jìn)展[J]. 臨床合理用藥雜志，2012，10（5）：174-175.

[4] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.生脈注射液：WS3-B-2865-98-2011[S]. 2011.

[5] 余凡，葛亞龍，楊恒拓，等. 八角茴香中莽草酸的提取分離工藝及生理活性的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)調(diào)味品，2014，39（1）：32-36.

[6] 唐苗苗，劉翼翔，毛婷，等. 高效液相色譜法測(cè)定北五味子有機(jī)酸含量[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33（15）：328-330.

[7] 俞靜靜，李風(fēng)華，陳素紅，等. HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地馬尾松等松葉中莽草酸的含量[J]. 藥物分析雜志，2015，35（1）：52-55.

[8] 王東東，石曉峰，李沖，等. 7種松柏科植物中莽草酸的含量測(cè)定[J]. 中國(guó)藥房，2011，22（7）：616-618.

[9] 任紅，喬洪翔，黃海波，等. 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定銀杏葉片中小分子有機(jī)酸含量[J]. 藥物分析雜志，2016，36（6）：1037-1043.

[10] 邱米，馬錦林，張日清，等. 莽草酸的研究綜述[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，2009，23（1）：45-47.

[11] 黃曉婷，楊冬業(yè)，鄭楚，等. 八角莽草酸的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（11）：126-130.

[12] 林潔，蘭琪欣，韋應(yīng)芳，等. 八角茴香藥用成分的提取及其鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，30（2）：195-196.

[13] 董禮，李梅，干建偉，等. HPLC法快速測(cè)定參麥注射液指紋圖譜[J]. 中成藥，2016，38（3）：599-602.

[14] 熊煜，劉星，余志立，等. 大花八角中莽草酸的提取及含量測(cè)定[J]. 廣東化工，2016，43（20）：40-41，48.

[15] 丁小娟，丁珊珊，呂凌，等. HPLC 法同時(shí)測(cè)定宣木瓜中五種有機(jī)酸和原兒茶酸的含量[J]. 安徽醫(yī)藥，2013，17（9）：1496-1498.

[16] 周揚(yáng)陽，張志榮. HPLC測(cè)定大鼠血漿中的莽草酸[J]. 華西藥學(xué)雜志，2017，32（4）：429-430.

（編輯：莫婕）