皂莢種質資源SCoT遺傳多樣性分析及指紋圖譜的構建

張安世　駱揚　范定臣　張中海

摘要： 采用SCoT標記分析了18個皂莢種質的遺傳多樣性，并采用UPGMA法對18個皂莢種質進行了聚類分析。在此基礎上，通過篩選出的多態性條帶構建了18個皂莢種質的SCoT指紋圖譜。擴增結果表明：從51個SCoT引物中篩選了15個引物進行PCR擴增，共擴增出226條帶，其中多態性條帶216條，多態性比率為96.61%。各引物多態性信息含量（PIC）、觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Neis基因多樣性指數（H）和Shannons信息指數（I）的平均值分別為0.875 9、1.964 9、1.440 1、0.272 6、0.426 1。18個皂莢種質的遺傳相似系數在0.491 4～0.938 1之間，表明供試材料之間具有較豐富的遺傳多樣性。聚類分析結果表明： 在遺傳相似系數為0.60處可將18個皂莢種質分為3組，其中野皂莢單獨為一組，山皂莢和皂莢T聚為一組，其它皂莢材料聚為一組。利用3個引物擴增的8個多態性位點構建了18份皂莢種質資源的DNA指紋圖譜，可以將其區分并精準鑒定。該研究結果為皂莢種質的鑒定和新品種選育提供了一定的理論依據。

關鍵詞： 皂莢， SCoT， DNA指紋圖譜， 遺傳多樣性

中圖分類號： Q949.9， S718.46

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）11137808

Abstract： Genetic diversity of eighteen Gleditsia sinensis germplasms was analyzed based on SCoT markers， the cluster analysis on eighteen G. sinensis germplasms was carried out by UPGMA method， and the SCoT fingerprints of eighteen G. sinensis germplasms were constructed by the polymorphic bands. The results of amplification showed that， 226 SCoT bands were obtained from fifteen primers selected from 51 SCoT primers， including 216 polymorphic bands， with a polymorphism rate of 96.61%. The average of the polymorphism information content（PIC）， observed number of alleles（Na）， effective number of alleles（Ne）， Neis gene diversity （H） and Shannons information index （I） were 0.875 9， 1.964 9， 1.440 1， 0.272 6 and 0.426 1， respectively. The genetic similarity coefficients of these samples were between 0.491 4 and 0.938 1. Therefore， it indicates that there are rich genetic diversities among these materials. The results of cluster analysis showed that， eighteen G. sinensis germplasms could be divided into three groups when the genetic similarity coefficient was 0.60. G. heterophylla formed the first group， G. melanacantha and ZaojiaT formed the second group， and the others formed the third group. DNA fingerprints of eighteen samples were constructed from eight polymorphic loci amplified by three primers， and these materials could be distinguished and identified accurately. All these results provide the important information for the identification and breeding for new cultivars of G. sinensis.

Key words： Gleditsia sinensis， SCoT， DNA fingerprint， genetic diversity

皂莢屬（Gleditsia Linn.） 系豆科蘇木亞科， 全世界約12種， 主要分布于亞洲、美洲和熱帶非洲（顧萬春等，2003）。中國產8種， 引進1種， 其中中國皂莢是分布在我國的特有種， 廣泛分布于我國東北、華北、華東、華南等地， 多生長于平原、山谷及丘陵地區。皂莢能抗旱、耐鹽、耐高溫，具有多種多樣的生態屬性，遺傳多樣性程度高，是經濟林、用材林、防護林及園林綠化的理想樹種（顧萬春等，2003；楊海東，2003）。皂莢具有很高的藥用價值，皂莢、皂刺、皂根、皂葉均可入藥，特別是棘刺是中醫治療乳腺癌、肺癌等多種癌癥的常用配伍藥之一， 被列為抗癌中草藥（蔣建新等，2003）。同時，皂莢還是優良的城市抗污染劑和日用化工原料（王薊花等，2008）， 殺蟲、殺鼠效果也非常好（張宏利等，2013）。目前國內外對皂莢的研究主要集中在皂莢果實與皂刺中活性成分（張宏利等，2013； 余俐佳等， 2016）、引種栽培（范定臣等，2015）及生態屬性（楊海東，2003）等方面，并開展了相關的遺傳學研究（蘭彥平和顧萬春，2006； 李偉等，2013）。最近，分子標記技術也已開始在皂莢研究中得到應用。邢俊連等（2017）成功地進行了皂莢ESTSSR引物的開發與篩選，且證實這些引物在其近緣種間具有很高的通用性，為以后開展皂莢種質資源的遺傳多樣性研究提供有效的分析方法和手段。李偉等（2017）利用AFLP分子標記技術對10個南方皂莢群體進行了遺傳多樣性分析，結果表明群體內的變異是皂莢遺傳變異的主體，皂莢群體的遺傳多樣性與遺傳結構的形成不僅與其分布廣泛、種子特性及生活史有關，而且與人為的砍伐、引種、生境片段化等因素有重要關系，并由此提出了皂莢的保護策略。就目前而言，分子標記技術在皂莢的系統進化、種質資源鑒定、指紋圖譜構建等方面還缺乏有效利用。

隨著分子生物學的發展，大量的分子標記技術被開發利用，每種分子標記技術都各有其特點。目標起始密碼子多態性（start codon targeted polymorphism， SCoT）是由Collard & Mackill（2009）開發的新目的基因分子標記技術，并首先在水稻上得以應用，是一種基于單引物擴增反應的分子標記技術。SCoT具有操作簡單、通用性良好、多態性豐富、成本低廉等優點，同時又能對性狀進行跟蹤，有利于分子輔助育種，已在多種植物上得到成功應用（楊祥燕等，2013； 王健勝等，2015； 王發明等，2017）。因此，本試驗采用SCoT標記對河南省18份皂莢種質資源進行遺傳多樣性分析，并構建DNA指紋圖譜，以期為皂莢種質資源的鑒定和優良品種的選育等研究提供科學依據。

1材料與方法

1.1 材料和試劑

材料包括3個種共18份，具體見表1。除野皂莢、山皂莢和皂莢T為實生苗外，其余的15份材料是以單株產量高、單刺（或單果）平均重量重的皂莢植株為接穗、野皂莢為砧木（濟科除外）嫁接而獲得的無性系， 其中部分品種已經通過河南省

林木品種審定委員會審定。另外皂莢T是從土耳其引進種子的3年生實生苗，曾被當做皂莢品種，但其所表現出的形態特征與皂莢有較大差異，而與山皂莢極為相似。所有材料均隨機選取3株，每株采集2片健康、幼嫩葉片，置于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

試劑為2×Taq MasterMix（含有Taq DNA Polymerase， 2×Taq PCR Buffer， 3 mmol·L1 MgCl2和400 μmol·L1 dNTP mix）購自北京康為世紀生物科技有限公司，SCoT引物根據蘇亞春等（2012）公布的40條引物序列由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。

1.2 皂莢基因組DNA的提取

每個皂莢品種取3片不同植株的幼嫩葉片等量混合，采用改良CTAB法（張安世等，2009）提取皂莢基因組DNA，并將模板DNA濃度稀釋至20 ng·μL1，保存于-20 ℃備用。

1.3 SCoTPCR分析

選用40個SCoT單引物（SC1SC40）和11個由SCoT單引物搭配而成的引物組合共計51個引物對供試材料進行擴增。反應體積 10 μL，其中DNA 1.0 μL，引物 1.4 μL，2×Taq MasterMix 5.0 μL，RNaseFree water 2.6 μL。SCoTPCR擴增程序：首先94 ℃預變性5 min；然后進行40個循環，包括94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min，72 ℃延伸1.5 min。最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存備用。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠分離。

1.4 數據統計分析

根據電泳結果進行條帶的統計分析。在電泳圖相同位置上若出現DNA條帶記為“1”， 無記為“0”，形成1，0矩陣，將此矩陣導入POPGENE1.32軟件進行多態性百分率（PPL）、觀測等位基因數（Na）、

有效等位基因數（Ne）、Neis基因多樣性（H）和Shannons信息指數（I） 等遺傳多樣性參數分析，參照黃秀等（2014）方法計算引物多態性信息含量（PIC），通過NTSYSpc 2.0軟件依據UPGMA法進行聚類分析，同時參照云天海等（2013）的方法構建18個皂莢種質DNA指紋圖譜。

2結果與分析

2.1 SCoT引物篩選與多態性分析

選用51個SCoT引物對18份皂莢種質材料進行了PCR擴增，最終篩選出了條帶清晰、多態性高、重復性好的15個引物，其中，包括10個SCoT單引物和5個引物組合。所用引物序列及多態性統計結果見表2。15個引物共擴增出226個條帶，其中多態性條帶216個，多態位點百分率（PPL）為96.61%。多態性信息含量（PIC）的變化范圍為0.783 0～0.925 6，平均值為0.875 9。說明所選引物在18個皂莢種質間具有很高的SCoT多態性。觀測等位基因數（Na）的變化范圍為1.812 5～2.000，平均值為1.964 6；有效等位基因數（Ne）的變化范圍為1.319 1～1.591 0，平均值為1.440 1；Neis基因多樣性指數的變化范圍為0.215 4～0.345 0，平均值為0.272 6；Shannons信息指數的變化范圍為0.349 0～0.516 8，平均值為0.426 1。上述結果表明，18個皂莢種質間存在較豐富的遺傳多樣性。同時，利用SPSS17.0軟件對4個主要遺傳多樣性參數多態性信息含量、有效等位基因數、Neis 基因多樣性指數和Shannons信息指數進行非參數Kruskal Wallis Test獨立樣本檢驗，結果顯示18個皂莢種質之間遺傳多樣性水平存在顯著性差異（X2=49.795，P=0.000﹤0.001），表明上述分析得到的各參數值能很好地說明皂莢種質間遺傳多樣性水平。

2.2 遺傳相似性和聚類分析

利用NTSYSpc軟件計算種質間的遺傳相似系數（Gs），結果表明18份皂莢種質兩兩間的Gs在0.491 4～0.938 1之間，平均值為0.711 4，變幅為0.446 7，說明供試材料間存在較大的遺傳差異。其中焦科4和焦科5的Gs最大（0.938 1），親緣關系最近，山皂莢和豫皂2的Gs最小（0.491 4），親緣關系最遠。

利用NTSYSpc軟件對18份皂莢種質進行聚類分析。結果表明（圖2），在Gs為0.60處可將18分皂莢材料分為3組。第1組為野皂莢；第2組為山皂莢和皂莢T；第3組共有15個皂莢種質材料：密刺、碩刺、皂莢H、豫皂1、懷皂王2、博科、焦科1、焦科2、焦科3、濟科、嵩刺1、太行2、豫皂2、焦科4和焦科5。

2.3 DNA指紋圖譜的構建

通過篩選的15個引物對18份皂莢種質的擴增結果分析，選取其中SC1、SC13和SC23 3個引物擴增的8個多態性位點構建了18份皂莢種質的DNA指紋圖譜（圖3）。每份材料都有唯一的指紋圖譜，可以將18份皂莢種質區分并準確鑒定。

3討論與結論

3.1 皂莢種質資源的遺傳多樣性分析

利用分子標記技術分析皂莢種質資源的遺傳多樣性，了解不同皂莢種質之間的遺傳差異，對于皂莢的新品種選育和種質資源鑒定具有重要意義。在遺傳多樣性研究中，多態性是評價遺傳多樣性的重要依據之一。在本研究中，通過SCoT標記對18份皂莢種質資源的遺傳變異分析表明，多態性位點百分率 （PPL）高達96.61%，多態性信息量（PIC）為0.875 9，處于高水平（高：PIC >

0.5； 適中： 0.5 > PIC > 0.25； 低： PIC < 0.25）（徐玉仙等，2015），說明本研究篩選的引物在供試材料間具有很高的多態性，可以有效的用于皂莢的遺傳多樣性分析。同樣，有效等位基因數、Neis 基因多樣性和 Shannons 信息指數分別為1.440 1、0.272 6和0.426 1，也處于較高水平。另外，18個皂莢種質間的遺傳相似系數（Gs）在0.491 4～0.938 1之間，變幅達0.446 7，說明供試材料間存在較豐富的多樣性。通過對多態性信息量、有效等位基因數、Neis 基因多樣性指數和Shannons信息指數，4個主要的遺傳多樣性參數進行的非參數Kruskal Wallis Test獨立樣本檢驗結果也證實了這一結論。

3.2 皂莢種質資源的聚類分析

本研究涉及野皂莢、山皂莢和皂莢共3個種18份材料。聚類結果表明，在Gs為0.60處可將18份皂莢種質分為3組。其中，野皂莢單獨為一組，山皂莢和皂莢T聚為一組，其余15份皂莢種質材料聚為一組。在上述第3組的15份皂莢種質中，焦科4和焦科5是以皂莢莢果為目的選育的品種，其余均以皂刺為目的選育。焦科4和焦科5的接穗均為莢果較大的不同皂莢品種，在所有供試材料中親緣關系最近，在其15份皂莢種質一組聚為一個分支，其它13份材料聚為另一分支，與預期相符。濟科是以嵩刺1為接穗、山皂莢為砧木的嫁接品種，兩者首先聚在一起，也與實際情況相吻合。從聚類圖中還能看出部分種質材料具有一定的地理來源一致性特征。如采集于河南修武的5份材料除焦科4和焦科5聚在一起外，焦科1、焦科2和焦科3也聚在一起；采集于河南博愛的5份材料也分別聚于2個分支，豫皂1、懷皂王2和博科為一個分支，太行2和豫皂2為另一分支；采集于河南嵩縣的3份材料除嵩刺1外，其余2份材料密刺和碩刺聚在一起。另外，皂莢T是從土耳其引進種子的三年生播種苗，起初曾被作為皂莢品種，但其三年生播種苗無論從葉的形態、皮孔大小及形狀以及嫩枝的顏色都與山皂莢極為相似，因此認為該種子在引進時可能鑒定有誤。本研究結果顯示山皂莢和皂莢T聚為一組，兩者具有很近的親緣關系，因此，應將皂莢T歸為山皂莢而非皂莢品種，同時還要結合其它標記技術及其以后的生長過程中所表現出的其它形態學特征進行進一步的驗證。

3.3 皂莢種質資源鑒定與DNA指紋圖譜構建

分子標記是以DNA多態性為基礎的遺傳標記，能直接反映植物間的遺傳差異，具有高效、快捷、準確度高、信息量大等優點，已經成為植物種質鑒定的有效方法，也是數字化身份證構建的有效工具，已在大量的種質資源研究中得到應用。SCoT作為一種新型的DNA分子標記技術，在植物種質鑒定和DNA指紋圖譜構建方面已經得到了初步應用。陳紅等（2014）利用SCoT分子標記技術對71份貴州桃種質進行了分析，結果表明，來自貴陽和黔南州荔波縣的兩份青桃資源（20號和39號）親緣關系較遠，說明它們為同名異物。同時也證實自同一縣份的血桃（31號和32號）和白花桃（16號和19號）不完全是同一樣品，從而在分子水平理清了供試材料的親緣關系，并對部分桃資源名稱混亂的現象進行了糾正，為貴州桃種質資源的科學保存與利用提供了依據。林清等（2013）通過對5個SCoT引物在46份供試芥菜種質中擴增所得的16個多態性DNA譜帶進行統計，初步構建了芥菜種質的指紋圖譜，能夠準確地鑒定這46份芥菜種質。本研究利用SCoT技術，選用3個引物擴增的8個多態性位點構建了18份皂莢種質的DNA指紋圖譜，為皂莢種質間的鑒別提供了重要的科學依據。

綜上所述，通過SCoT標記對18份皂莢種質資源的遺傳變異分析表明，18份皂莢種質材料間具有較豐富遺傳多樣性；聚類分析與皂莢的傳統分類基本吻合，并對可疑材料皂莢T進行了合理歸類；利用3個SCoT引物擴增的8個多態性位點構建的DNA指紋圖譜具有唯一性，可以利用此圖譜對供試材料進行鑒定。

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