結核分枝桿菌的檢測技術研究進展

李天寧

DOI：10.19392/j.cnki.16717341.201714220

摘要：結核病是一個全球性公共衛生問題。結核病的病原菌為結核分枝桿菌。可侵犯全身各器官。本文旨在對這些結核桿菌的檢測方法和最新進展進行綜述，以此來評價結核分枝桿菌檢測技術的新進展在結核實驗室中的診斷價值。

關鍵詞：結核分枝桿菌；免疫檢測；分子生物學檢測技術

結核病高死亡率的主要原因是缺乏對結核分枝桿菌快速有效的檢測方法。本文現對這些結核桿菌的檢測方法和最新進展進行綜述，為實驗室在檢測結核分枝桿菌時提供參考。

1 細菌學檢測方法

1.1 抗酸染色

取患者的痰液或組織切片標本，將其中的膿性物質或干酪樣物質部分厚涂片，然后進行抗酸染色，在顯微鏡下觀察涂片。一般每100個視野出現1～9條視為陽性。其優點為操作簡便易行；缺點是敏感性低，陽性率低。而過氧化氫能夠提高細胞壁通透性，使染液易于進入細胞內，因此，可將30%過氧化氫加入堿性品紅染液中，有效提高抗酸染色敏感性，增加抗酸染色陽性率。

1.2 金胺O熒光染色

結核桿菌細胞壁具有嗜石炭酸性，可選擇在染色劑中加入石炭酸，使其作為媒染劑，促使抗酸桿菌著色。鏡下觀察，亮綠色熒光表示金胺 O 熒光染色陽性，即為抗酸桿菌。與暗色背景形成鮮明對比。在顯微鏡下觀察涂片，一般每50個視野出現2～18個熒光點則視為陽性。其優點為與暗色背景對比鮮明，不易漏檢，但其缺點是由于在暗場中觀察，而且熒光強度不斷衰減，因此要及時觀察，涂片后保存時間較短。近幾年來有將發光二極管技術與熒光顯微鏡相結合，其鏡檢時間明顯縮短，陽性檢出率也有所提高。

1.3 噬菌體壓電傳感器快速檢測

利用串聯式壓電石英傳感器對環境電參數相應靈敏的特點，對壓電頻移曲線進行分類，用噬菌體成斑率為指標，根據噬菌體只能感染活的結合分枝桿菌的特點，將PAMSPQC法應用于結合分枝桿菌耐藥檢測。該方法特異性比較好，但是PAMSPQC同樣存在噬菌體感染效率的問題。

1.4 結核桿菌培養法

傳統的固體培養法以改良羅氏培養基最為常見，其靈敏度高于涂片鏡檢。隨著快速培養概念的提出，半自動和全自動分枝桿菌培養系統迅速涌入市場。隨后的BACTECMGIT 960系統保留 BACTEC 460 快速培養的優點得同時以熒光代替放射元素進行檢測。

法國生物梅里埃公司研制的BacT/Alert 3D全自動快速結核分枝桿菌培養檢測系統，根據培養管中CO2 變化導致的pH 改變，設計可以隨著 pH 改變發生顏色改變的傳感器進行檢測。

2 免疫檢測方法

2.1 血清學診斷

血清學診斷常用酶聯免疫吸附實驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）的方法。現在常用的結核分枝桿菌抗體包括LAM、38×103與16×1033種抗原的IgG。在最新的研究中，主要將重組抗原應用于ELISA，以提高反應的敏感性和特異性，如包含幾個MTB蛋白的融合蛋白（如CFP10、EAST6、MPT64 和 38 kDa 蛋白）。

人群中結核分支桿菌的感染局較高，其中大部分發生是隱性感染，導致在不發病的健康群體內也會存在一定基礎滴度的結核分支桿菌抗體，此外各地區健康人群內結核分支桿菌抗體基礎水平有較大差異，綜上，血清中結核分支桿菌抗體檢測雖然具備一定診斷價值，但仍存在局限性。血清學只能作為輔助結核病診斷的指標之一。

2.2 抗酸免疫組化雙重染色

在此前的研究中，常應用抗酸和免疫組織化學的方法對組織切片進行染色。但在應用免疫組化的方法同時檢測肺結核組織和淋巴結結核組織中結核桿菌的分泌蛋白 （ MPT32、MPT44、MPT46、MPT51、MPT53、MPT59、MPT63 和MPT64） 及菌體蛋白（ Mce1A、Hsp65、MPT57）的實驗中發現，不同感染階段結核桿菌的分泌蛋白的實驗結果存在很大差異，因此無法應用于結核病的診斷。此外，結核桿菌菌體蛋白特異性過低，不能較好的反應分枝桿菌與巨噬細胞的準確位置關系，現結核病組織病理學研究時，多應用萋納氏抗酸染色法和CD68免疫組化雙重染色，在同一組織切片中達到同時顯示結核分枝桿菌與巨噬細胞分布情況的目的。

采用先免疫組化染色，再抗酸染色，最后蘇木素染核的順序進行操作處理的組織切片，背景清晰、對比鮮明、顯色效果好，在同一切片內可以清楚觀察到巨噬細胞和結核分枝桿菌的分布狀態，便于判定結核病病程性質。

2.3 結核分枝桿菌抗體（IgG）生物微矩陣（芯片）法

利用生物蛋白芯片對結核患者的蛋白制備進行檢測，需要將幾個蛋白指標進行聯合檢測，如可將LAM、38 KDa及 16KDa等蛋白聯合，有利于結核病陽性蛋白檢測的準確率，為結核與肺外結核的早期診斷提供參考。系統包括生物微矩陣（芯片）分析儀與生物微矩陣（芯片），可對生物微矩陣（芯片）的檢測信號進行定量分析和結果判定，只需3～5min即可讀取數據，特異性好，靈敏度高。

最近20多年來，近年來結核病疫情呈明顯上升趨勢，現在中國成為全球22個結核病高負擔國家之一，全球的流行形勢十分嚴峻。本文通過對這些結核桿菌的檢測方法和最新進展進行綜述，以此來評價結核分枝桿菌檢測技術的新進展在結核實驗室中的診斷價值。

參考文獻：

[1]Global Tuberculosis Control：Epidemiology，Strategy，Financing：WHO report 2009[R].Genera，WHO HTM TB 2009.

[2]米賢文.新型噬菌體壓電傳感器快速檢測結核分枝桿菌的機理及其藥敏應用效果的研究[D].湖南大學，2013.

[3]曹冉冉，劉邦英，等.分子信標熒光定量PCR在肺結核早期診斷及療效評價中的初步應用[J].中國防癆雜志，2012.