結(jié)核分枝桿菌的檢測技術(shù)研究進(jìn)展

李天寧

DOI：10.19392/j.cnki.16717341.201714220

摘要：結(jié)核病是一個(gè)全球性公共衛(wèi)生問題。結(jié)核病的病原菌為結(jié)核分枝桿菌。可侵犯全身各器官。本文旨在對這些結(jié)核桿菌的檢測方法和最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，以此來評價(jià)結(jié)核分枝桿菌檢測技術(shù)的新進(jìn)展在結(jié)核實(shí)驗(yàn)室中的診斷價(jià)值。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；免疫檢測；分子生物學(xué)檢測技術(shù)

結(jié)核病高死亡率的主要原因是缺乏對結(jié)核分枝桿菌快速有效的檢測方法。本文現(xiàn)對這些結(jié)核桿菌的檢測方法和最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，為實(shí)驗(yàn)室在檢測結(jié)核分枝桿菌時(shí)提供參考。

1 細(xì)菌學(xué)檢測方法

1.1 抗酸染色

取患者的痰液或組織切片標(biāo)本，將其中的膿性物質(zhì)或干酪樣物質(zhì)部分厚涂片，然后進(jìn)行抗酸染色，在顯微鏡下觀察涂片。一般每100個(gè)視野出現(xiàn)1～9條視為陽性。其優(yōu)點(diǎn)為操作簡便易行；缺點(diǎn)是敏感性低，陽性率低。而過氧化氫能夠提高細(xì)胞壁通透性，使染液易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此，可將30%過氧化氫加入堿性品紅染液中，有效提高抗酸染色敏感性，增加抗酸染色陽性率。

1.2 金胺O熒光染色

結(jié)核桿菌細(xì)胞壁具有嗜石炭酸性，可選擇在染色劑中加入石炭酸，使其作為媒染劑，促使抗酸桿菌著色。鏡下觀察，亮綠色熒光表示金胺 O 熒光染色陽性，即為抗酸桿菌。與暗色背景形成鮮明對比。在顯微鏡下觀察涂片，一般每50個(gè)視野出現(xiàn)2～18個(gè)熒光點(diǎn)則視為陽性。其優(yōu)點(diǎn)為與暗色背景對比鮮明，不易漏檢，但其缺點(diǎn)是由于在暗場中觀察，而且熒光強(qiáng)度不斷衰減，因此要及時(shí)觀察，涂片后保存時(shí)間較短。近幾年來有將發(fā)光二極管技術(shù)與熒光顯微鏡相結(jié)合，其鏡檢時(shí)間明顯縮短，陽性檢出率也有所提高。

1.3 噬菌體壓電傳感器快速檢測

利用串聯(lián)式壓電石英傳感器對環(huán)境電參數(shù)相應(yīng)靈敏的特點(diǎn)，對壓電頻移曲線進(jìn)行分類，用噬菌體成斑率為指標(biāo)，根據(jù)噬菌體只能感染活的結(jié)合分枝桿菌的特點(diǎn)，將PAMSPQC法應(yīng)用于結(jié)合分枝桿菌耐藥檢測。該方法特異性比較好，但是PAMSPQC同樣存在噬菌體感染效率的問題。

1.4 結(jié)核桿菌培養(yǎng)法

傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)法以改良羅氏培養(yǎng)基最為常見，其靈敏度高于涂片鏡檢。隨著快速培養(yǎng)概念的提出，半自動和全自動分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)迅速涌入市場。隨后的BACTECMGIT 960系統(tǒng)保留 BACTEC 460 快速培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)得同時(shí)以熒光代替放射元素進(jìn)行檢測。

法國生物梅里埃公司研制的BacT/Alert 3D全自動快速結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測系統(tǒng)，根據(jù)培養(yǎng)管中CO2 變化導(dǎo)致的pH 改變，設(shè)計(jì)可以隨著 pH 改變發(fā)生顏色改變的傳感器進(jìn)行檢測。

2 免疫檢測方法

2.1 血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷常用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）的方法。現(xiàn)在常用的結(jié)核分枝桿菌抗體包括LAM、38×103與16×1033種抗原的IgG。在最新的研究中，主要將重組抗原應(yīng)用于ELISA，以提高反應(yīng)的敏感性和特異性，如包含幾個(gè)MTB蛋白的融合蛋白（如CFP10、EAST6、MPT64 和 38 kDa 蛋白）。

人群中結(jié)核分支桿菌的感染局較高，其中大部分發(fā)生是隱性感染，導(dǎo)致在不發(fā)病的健康群體內(nèi)也會存在一定基礎(chǔ)滴度的結(jié)核分支桿菌抗體，此外各地區(qū)健康人群內(nèi)結(jié)核分支桿菌抗體基礎(chǔ)水平有較大差異，綜上，血清中結(jié)核分支桿菌抗體檢測雖然具備一定診斷價(jià)值，但仍存在局限性。血清學(xué)只能作為輔助結(jié)核病診斷的指標(biāo)之一。

2.2 抗酸免疫組化雙重染色

在此前的研究中，常應(yīng)用抗酸和免疫組織化學(xué)的方法對組織切片進(jìn)行染色。但在應(yīng)用免疫組化的方法同時(shí)檢測肺結(jié)核組織和淋巴結(jié)結(jié)核組織中結(jié)核桿菌的分泌蛋白 （ MPT32、MPT44、MPT46、MPT51、MPT53、MPT59、MPT63 和MPT64） 及菌體蛋白（ Mce1A、Hsp65、MPT57）的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同感染階段結(jié)核桿菌的分泌蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在很大差異，因此無法應(yīng)用于結(jié)核病的診斷。此外，結(jié)核桿菌菌體蛋白特異性過低，不能較好的反應(yīng)分枝桿菌與巨噬細(xì)胞的準(zhǔn)確位置關(guān)系，現(xiàn)結(jié)核病組織病理學(xué)研究時(shí)，多應(yīng)用萋納氏抗酸染色法和CD68免疫組化雙重染色，在同一組織切片中達(dá)到同時(shí)顯示結(jié)核分枝桿菌與巨噬細(xì)胞分布情況的目的。

采用先免疫組化染色，再抗酸染色，最后蘇木素染核的順序進(jìn)行操作處理的組織切片，背景清晰、對比鮮明、顯色效果好，在同一切片內(nèi)可以清楚觀察到巨噬細(xì)胞和結(jié)核分枝桿菌的分布狀態(tài)，便于判定結(jié)核病病程性質(zhì)。

2.3 結(jié)核分枝桿菌抗體（IgG）生物微矩陣（芯片）法

利用生物蛋白芯片對結(jié)核患者的蛋白制備進(jìn)行檢測，需要將幾個(gè)蛋白指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測，如可將LAM、38 KDa及 16KDa等蛋白聯(lián)合，有利于結(jié)核病陽性蛋白檢測的準(zhǔn)確率，為結(jié)核與肺外結(jié)核的早期診斷提供參考。系統(tǒng)包括生物微矩陣（芯片）分析儀與生物微矩陣（芯片），可對生物微矩陣（芯片）的檢測信號進(jìn)行定量分析和結(jié)果判定，只需3～5min即可讀取數(shù)據(jù)，特異性好，靈敏度高。

最近20多年來，近年來結(jié)核病疫情呈明顯上升趨勢，現(xiàn)在中國成為全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，全球的流行形勢十分嚴(yán)峻。本文通過對這些結(jié)核桿菌的檢測方法和最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，以此來評價(jià)結(jié)核分枝桿菌檢測技術(shù)的新進(jìn)展在結(jié)核實(shí)驗(yàn)室中的診斷價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]Global Tuberculosis Control：Epidemiology，Strategy，F(xiàn)inancing：WHO report 2009[R].Genera，WHO HTM TB 2009.

[2]米賢文.新型噬菌體壓電傳感器快速檢測結(jié)核分枝桿菌的機(jī)理及其藥敏應(yīng)用效果的研究[D].湖南大學(xué)，2013.

[3]曹冉冉，劉邦英，等.分子信標(biāo)熒光定量PCR在肺結(jié)核早期診斷及療效評價(jià)中的初步應(yīng)用[J].中國防癆雜志，2012.