江蘇省宿遷地區貓弓形蟲流行病學調查和分析

李崎川 賈傳禮

DOI：10.3969/j.issn.2096-3637.2017.10.007

摘要：為了解江蘇省宿遷地區貓弓形蟲病的感染情況，分別采用糞便檢查、PCR組織檢測及IHA血清檢測等方法對該地區家養貓和流浪貓開展弓形蟲流行病學調查。糞檢結果未發現弓形蟲卵囊，但顯示該地區貓感染主要腸道寄生蟲是貓弓首蛔蟲及等孢球蟲；采用PCR及IHA方法檢測發現，貓弓形蟲病平均感染率分別為22.64%和35.85%；2種方法弓形蟲陽性符合率為52.63%（10/19），陰性符合率達94.12%（32/34）。調查表明，宿遷地區貓弓形蟲感染較為廣泛，相比家養貓，流浪貓弓形蟲感染率更高，但2種方法檢測流浪貓與家養貓弓形蟲感染率差異均無統計學意義（P > 0.05）。

關鍵詞：弓形蟲；貓；糞檢；PCR；IHA；江蘇

中圖分類號：S858.293 文獻標識碼：B 文章編號：2096-3637（2017）10-0009-02

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種可感染包括人在內所有溫血動物，并呈世界性分布的專性細胞內寄生原蟲。研究表明，孕婦感染弓形蟲后可導致早產，流產，胎兒發育畸形等，人感染弓形蟲的重要途徑之一是貓感染弓形蟲后排出的卵囊。而隨著寵物行業的發展，流浪動物數量的不斷增多，人與犬、貓等動物的接觸日益頻繁，使得人感染弓形蟲的風險也隨之日益加大。為了解宿遷市貓的弓形蟲感染情況，同時為貓源性弓形蟲病的預防和控制提供依據，本研究于2017年3月至6月期間對該地區家養貓及流浪貓進行了弓形蟲感染狀況調查及相關因素的研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器

PCR Buffer、d NTP、Taq酶等均購自TaKaRa公司；蛋白酶K、RNase購自上海生工生物工程公司；弓形蟲抗體間接血凝（IHA）檢測試劑盒（批號20170508203），購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所；引物合成由華大基因公司完成。酚、氯仿、異戊醇等均為國產分析純。EDC-810 PCR擴增儀，NANODROP 2000分光光度計（Thermo公司）等。

1.1.2 實驗動物及蟲株

2017年3月～6月期間，收集來自江蘇省宿遷市及周邊地區的53只成年貓，其中包括17只家養貓和36只流浪貓。弓形蟲RH株，為國際公認的標準I型強毒株，其基因組DNA被提取后，由本室于-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1糞便檢查

所有成年貓單籠飼養，采集各貓的新鮮糞便樣品，若糞便不能當日檢查，則應放在4℃普通冰箱或陰冷處，以抑制蟲卵的發育及糞便發酵。所有糞樣逐一編號，避免交叉污染。

采用飽和糖鹽水漂浮法檢查各貓是否在排弓形蟲卵囊。取2～5g糞便，加入適量的飽和糖鹽水充分攪拌均勻，用60目的金屬篩過濾入試管中。3000 rpm離心后，繼續滴加飽和糖鹽水至液面微凸起，取蓋玻片直接蓋上，并保證其與液面完全接觸，靜置5 min后，鏡檢。如此方法，連續檢查3d，以防漏檢。如發現弓形蟲卵囊則迅速收集培養并保存。

1.2.3血清及組織樣品采集

對所有貓采集血液后，分離血清，于-20℃保存備用。同時采集各貓腦、心肌、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟、淋巴結等組織，用于基因組DNA的提取。

1.2.4組織DNA的提取

20～50mg組織剪碎，每管分別加入10%SDS 50 μL，0.5 M EDTA 25 μL，5 M Nacl 10 μL，1 M Tris-HCl 10 μL，20 mg/mL蛋白酶K 5 μL，ddH2O 400 μL，混合均勻后于37℃水浴4～8 h。隨后采用經典的酚-氯仿法提取貓各組織的基因組DNA，分光光度計測定DNA樣品濃度及純度后，-20℃保存備用。

1.2.5弓形蟲PCR方法檢測

合成以弓形蟲529bp重復序列為靶基因的引物片段，F：5-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3，R：5-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3。反應體系為：1×PCR緩沖液、2.5 mM Mg2+、100 μM dNTP、0.3 μM上下游引物、1 U TaqDNA聚合酶、模板1 μL、加無菌雙蒸水至總體積25 μL。反應條件：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，58℃ 30s，72℃ 45 s，35個循環；最后72℃ 10 min。每次反應分別設陽性和陰性對照，產物經1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.2.6 血清檢測

參照商品化試劑盒操作指南采用IHA方法對所有動物血清樣品進行檢測。在陽性對照血清滴度不低于1：1024，陰性對照除第1孔（可能存在前滯現象）外，其余各孔及空白孔均未發生紅細胞凝集的前提下，血清稀釋度≧1：64判定為陽性，對處于臨界值或可疑的血清樣品，則進行重復檢驗。

1.2.7 數據分析

采用SPSS 20.0軟件中獨立樣本及配對資料卡方檢驗對貓弓形蟲病感染情況做統計分析，并以P < 0.05表示樣本間顯著性差異，同時對各影響因素做必要的風險評估（OR）。

2 結果

2.1糞便檢查

飽和糖鹽水漂浮法連續3d檢查所有成年貓只的糞便樣品，未鏡檢到弓形蟲卵囊，但在部分糞便樣品中發現有貓等孢球蟲卵囊（20.75%，11/53）、弓首蛔蟲卵（28.30%，15/53）以及毛尾線蟲卵（3.77%，2/53）。

2.2 PCR檢測

PCR方法檢測發現，宿遷地區貓弓形蟲病平均感染率為22.64%。其中家養貓檢測陽性率為11.76%；流浪貓陽性率27.78%。統計結果顯示流浪貓與家養貓弓形蟲感染率無顯著性差異（P > 0.05）（表1）。

表1 宿遷地區成年貓弓形蟲感染率

表2 PCR檢測貓各組織弓形蟲檢出率

對所有貓各組織DNA樣品進行PCR檢測發現，腦與肺臟組織弓形蟲檢出率最高，均達15.09%，相比心肌、腎臟及肝臟組織，兩者弓形蟲檢出率均顯著更高（P < 0.05），且風險系數是其他組織的3.86倍（表2）。除此之外，脾臟、淋巴結組織則均未檢測到弓形蟲的存在。

2.3 血清檢測

IHA方法檢測貓血清結果顯示，宿遷地區貓弓形蟲病平均感染率為35.85%。家養貓與流浪貓弓形蟲檢測陽性率分別為29.41%，38.89%。統計結果表明流浪貓與家養貓弓形蟲感染率差異無統計學意義（P > 0.05）（表1）。

2.4 兩種方法弓形蟲檢測結果的符合率

兩種不同方法檢測弓形蟲感染結果的符合率見表3。綜合檢測結果顯示，兩種方法陽性符合率較低，僅為52.63%，陰性符合率較高，達94.12%。同時統計分析表明，無論流浪貓還是家養貓，兩種方法弓形蟲檢測結果均無顯著性差異（P > 0.05）。兩種檢測方法結合，該地區成年貓弓形蟲感染的綜合陽性率達39.62%（21/53），其中流浪貓感染率為44.44%（16/36），家養貓為29.41%（5/17），但采用卡方檢驗統計顯示兩者差異并不顯著（P > 0.05）。

表3 兩種不同方法檢測貓弓形蟲感染的符合率

3 討論

國內外對貓糞便檢查情況已有相關報道。本文對宿遷地區成年貓進行糞便檢查，發現貓等孢球蟲及弓首蛔蟲是該地區貓感染的主要腸道寄生蟲。這一結果與國內其他地區貓腸道寄生蟲病的調查結果一致。文中顯示，貓弓首蛔蟲卵檢出率最高（28.30%），而國內外其他地區貓弓首蛔蟲的感染率也較高。貓既是弓形蟲生活史的終末宿主，也是其中間宿主，有報道指出貓首次感染弓形蟲時可在7～20d之間排出大量卵囊 。但當貓再次感染時則主要作為弓形蟲感染的中間宿主，這可能是在成年貓糞便中難以檢測到弓形蟲卵囊的重要原因。

據之前報道，我國不同地區貓弓形蟲感染率在10.3%～63.2%之間。而本文對宿遷地區成年貓的弓形蟲檢測陽性率達39.62%。這些結果表明貓弓形蟲病流行十分廣泛，且存在地區差異。對貓各組織DNA進行PCR檢測結果顯示，腦及肺臟弓形蟲檢出率最高，這提示我們隱性感染是該地區貓感染弓形蟲的主要方式。本文中，相比家養貓，流浪貓弓形蟲感染率略高，但兩種檢測手段的結果顯示，家養貓與流浪貓弓形蟲感染率差異并不顯著（P > 0.05），而這一結果與崔麗麗的報道并不完全一致，同時多個地區的研究結果均顯示，流浪貓相比家養或寵物貓，其弓形蟲感染率更高。究其原因，這主要與貓的生活習性有關，流浪貓由于常在戶外覓食，食入被弓形蟲污染的食物的機會要比家養貓大得多。

PCR方法已廣泛應用于動物弓形蟲病的流行病學調查，基于不同靶基因建立的PCR檢測方法也逐漸應用于臨床診斷中，本文中對2種方法弓形蟲檢測結果的符合率進行分析發現，PCR方法弓形蟲檢出率低于血清學方法，而在Li 的研究報道中也得到相同的結論。血清學方法存在假陽性率高，無法排除母源抗體干擾等缺點，而PCR方法同樣存在假陽性以及易污染的問題。在無法獲得動物組織樣品的情況下，血清學檢測方法更適用于較大規模流行病學的研究，而在應用于動物弓形蟲病的臨床診斷時，2種方法可適當選擇，或互補應用。

參考文獻

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