NF—κB/TLR4信號(hào)通路在急性胰腺炎大鼠肝損傷中的表達(dá)及PPAR—γ激動(dòng)劑的保護(hù)作用

陸貝　于源泉　殷俊杰

[摘要] 目的 基于NF-κB/TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路探討γ激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷的保護(hù)作用。方法 72只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SO組）、SAP模型組、羅格列酮處理組（ROSI組），每組24只，各組再隨機(jī)分為術(shù)后6 h、12 h、24 h組，每組8只。SAP模型組采用腹腔注射L-精氨酸法制備，ROSI組在SAP造模后30 min從股靜脈注射10%羅格列酮溶液6 mg/kg，SO組僅腹腔注射等體積生理鹽水。制模后觀察大鼠肝臟組織病理變化，測定肝組織TLR4、NF-κB、Bax、Bcl-2等因子及外周血TNF-α、IL-1β、IL-6、ALT、AST、LDH含量。 結(jié)果 ROSI組大鼠肝細(xì)胞病理損害較SAP組減輕，肝組織NF-κB、TLR4、Bax、Bcl-2、肝細(xì)胞凋亡指數(shù)與SAP組比較有明顯差異（P<0.05），外周血TNF-α、IL-1β、IL-6、ALT、AST、LDH含量與SAP組比較明顯下降（P<0.05）。 結(jié)論 PPAR-γ激動(dòng)劑可能通過抑制NF-κB/TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性，下調(diào)下游促炎細(xì)胞因子水平，從而減輕急性胰腺炎過程中的肝細(xì)胞損傷。

[關(guān)鍵詞] 重癥急性胰腺炎；過氧化物酶體增殖物激活受體；核因子-κB；Toll樣受體

[中圖分類號(hào)] R576 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）33-0030-04

[Abstract] Objective To discover the protective effect of PPAR-γ agonists rosiglitazone on injured liver cells in rats correlate with NF-kappa B/TLR4 signal pathway during severe acute pancreatitis. Methods 72 SD rats were randomly divided into sham operation （SO） group （n=24）， SAP model （SAP） group （n=24）， rosiglitazone （ROSI） group （n=24）. Each group was divided into 6 h， 12 h， and 24 h group（n=8） after operation. SAP rats model were did via peritoneal injection of L-arginine. Rats in ROSI group were injected with 6 mg/kg of 10% rosiglitazone via femoral vein 30 min after SAP models were succeed. Sham group was peritoneal injected of same volume NS as SAP group. Pathological changes of liver tissue after operation， TLR4， NF-κB， Bax， Bcl-2 in liver tissue were tested. Serum TNF-α， interieukin-1β， interieukin-6， ALT， AST， LDH were also determined. Results The pathological injuries of liver cell were relieved in ROSI group compared with SAP group. There were significant differences in NF-κB， TLR4， Bax， Bcl-2 and liver cell apoptosis index between ROSI and SAP group（P<0.05）. TNF-α， IL-1β， IL-6， ALT， AST and LDH were decreased in ROSI group when compared with those in SAP group（P<0.05）. Conclusion The liver cell injury during SAP may relived by PPAR-γ agonists， the probable reason is that PPAR-γ agonists suppress NF-kappa B/TLR4 signal pathway， and reduce inflammatory cytokines.

[Key words] Severe acute pancreatitis； Peroxisome proliferator activating receptor； Nuclear factor-kappa B； Toll-like receptor

重癥急性胰腺炎（SAP）最常見的致命并發(fā)癥是多器官功能不全，臨床上尚無特異性治療能有效阻斷病程的進(jìn)展，學(xué)術(shù)上也頗具爭議。SAP常見胰外損害之一是肝損傷，亦是導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（MODS）患者死亡的主要原因。羅格列酮（rosiglitazone，ROSI）是人工合成的PPAR-γ激動(dòng)劑，臨床上早已作為胰島素增效劑用于2型糖尿病治療。1998年研究證實(shí)PPAR-γ通過抑制NF-κB活化具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[1]，Hashimoto等[2]學(xué)者2003年初次發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎大鼠的治療靶點(diǎn)PPAR-γ，但此后的實(shí)驗(yàn)未能闡述其具體機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)SAP大鼠靜脈注射羅格列酮，觀察其對(duì)大鼠肝臟NF-κB和TLR4表達(dá)的影響及肝損傷的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討PPAR-γ激動(dòng)劑對(duì)胰腺炎的治療作用與NF-κB/TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性清潔級(jí)SD大鼠72只，質(zhì)量255～315 g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購入。戊巴比妥鈉、L-精氨酸（Sigma，USA）、羅格列酮（Cayman，USA）、Bax、Bcl-2、NF-κB、TLR4單克隆抗體（Santa Cruz，USA），TUNEL盒（Takara，Japan）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型 72只大鼠分為SAP模型組（SAP組，n=24）、羅格列酮組（ROSI組，n=24）、假手術(shù)組（SO組，n=24），各組再隨機(jī)分為術(shù)后6 h、12 h、24 h組，每組8只。大鼠腹腔內(nèi)注射2.5%戊巴比妥鈉0.2 mL/100 g麻醉，股靜脈插管用微泵持續(xù)輸液。SAP組：腹腔兩次注射法建立大鼠SAP模型：先后兩次（間隔1 h）向腹腔內(nèi)注射L-精氨酸2.0 g/kg，濃度20 g/L，即完成SAP制模。SO組：僅向腹腔內(nèi)兩次注射等體積生理鹽水。ROSI組：造模SAP成功后30 min，經(jīng)股靜脈注射10%羅格列酮溶液6 mg/kg，術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)剖殺。

1.2.2 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察 大鼠剖殺后取左肝葉組織以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色后光鏡下觀察。

1.2.3 肝臟TLR4、NF-κBp65蛋白水平檢測 部分右肝葉組織采用免疫組化法和免疫印跡（Western blot）法檢測Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）和核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65（nuclear transcription factor-κBp65，NF-κBp65）的表達(dá)，具體操作參照TLR4和NF-κBp65檢測試劑盒說明書。結(jié)果判定：光鏡下觀察，以胞質(zhì)出現(xiàn)黃染為陽性細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)視野利用圖像分析系統(tǒng)分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度比值，計(jì)算相對(duì)含量，以陽性單位（positive unit）PU值大小定量[3]。

1.2.4 肝臟Bax、Bcl-2、AI檢測 SABC染色法檢測肝Bcl-2相關(guān)x蛋白（Bcl-2 associated x protein，Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），結(jié)果按PU值定量[3]。TUNEL染色法檢測肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

1.2.5 血清生化指標(biāo)檢測 心臟采血后，使用全自動(dòng)生化分析儀測定血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interieukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interieukin-6，IL-6）、丙氨酸基轉(zhuǎn)移酶（alamine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，其中計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用重復(fù)測量方差分析及SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理變化

SO組大體及鏡下肝細(xì)胞形態(tài)無明顯改變（封三圖1）；SAP組6 h大體肝組織色澤變暗，12 h出現(xiàn)瘀血，24 h出現(xiàn)缺血壞死斑塊，隨時(shí)間延長范圍逐漸擴(kuò)大。鏡下6 h出現(xiàn)炎癥細(xì)胞聚集，12 h后出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死和出血（封三圖2）；ROSI組肝臟各時(shí)相點(diǎn)大體及鏡下改變較SAP模型組有不同程度減輕（封三圖3）。

2.2三組肝臟TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平比較

與SO組比較，SAP組造模后6 h肝組織TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）。與SAP組比較，ROSI組TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），見表1。

2.3三組肝臟Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

ROSI組肝組織Bax較SAP組減少，Bcl-2較SAP組上升（P<0.05），見表2。

2.4三組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

SAP組大鼠造模后凋亡指數(shù)明顯升高，ROSI組凋亡指數(shù)較SAP組明顯下降（P<0.05），見表3。

2.5三組血清炎癥因子含量比較

SAP組各血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β、IL-6隨時(shí)間延長逐漸升高。ROSI組與SAP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

2.6 三組血清肝功能指標(biāo)比較

SAP組血清肝酶指標(biāo)含量隨造模時(shí)間延長逐漸升高，ROSI組各指標(biāo)含量較SAP組有不同程度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表5。

3 討論

急性胰腺炎尤其是重癥急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展與炎癥細(xì)胞的過量產(chǎn)生有關(guān)，核因子κB便是調(diào)控MODS的中介之一。早在1998年，Jiang等[1]首次提出PPAR-γ可能通過抑制NF-κB調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。PPAR-γ能促進(jìn)炎癥細(xì)胞增殖反應(yīng)，具有很強(qiáng)的抗炎功能，能抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生及ICAM-1、NF-κB的表達(dá)。PPAR-γ抑制IκB降解后可有效降低NF-κB活性[4-8]。

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）激動(dòng)劑也是細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，可通過抑制NF-κB調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[5-8]。查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，有關(guān)急性胰腺炎（AP）與PPAR-γ激動(dòng)劑之間的研究不少，但以研究15 d-PGJ2和羅格列酮關(guān)系較多，很多學(xué)者也通過實(shí)驗(yàn)證明PPAR-γ激動(dòng)劑能在一定程度上減輕胰腺炎，特別是在預(yù)防和降低胰腺炎的外周并發(fā)癥方面有一定作用。但查閱文獻(xiàn)后我們發(fā)現(xiàn)研究NF-κB信號(hào)通路的文獻(xiàn)報(bào)道較少[9-18]。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)SAP大鼠靜脈注射羅格列酮，觀察其對(duì)大鼠肝細(xì)胞損傷、肝細(xì)胞凋亡、外周血炎癥細(xì)胞因子的影響及NF-κB/TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ROSI組大鼠各時(shí)相肝臟病理損害最輕，外周血肝酶ALT、AST、LDH水平明顯下降（P<0.05），表明羅格列酮對(duì)SAP肝損傷有保護(hù)作用。同時(shí)ROSI組肝細(xì)胞Bax較SAP組減低而Bcl-2上升（P<0.05），肝細(xì)胞凋亡指數(shù)較SAP組有明顯下降（P<0.05），表明羅格列酮可能參與Bax/Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制控制肝細(xì)胞凋亡。ROSI組大鼠外周血IL-1β、IL-6、TNF-α等含量下調(diào)（P<0.05），肝組織NF-κB、TLR4活性下降（P<0.05），表明羅格列酮可能通過抑制NF-κB/TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮效應(yīng)，提示PPAR-γ激動(dòng)劑抑制NF-κB/TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化，下調(diào)下游促炎細(xì)胞因子表達(dá)可能是胰腺炎治療的新途徑。

總之，PPAR-γ激動(dòng)劑對(duì)急性胰腺炎有確定的治療效果，其可能是通過對(duì)NF-κB/TLR4信號(hào)通路的選擇性抑制，控制促炎因子釋放，減輕炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，保護(hù)胰外器官，已廣泛投入臨床應(yīng)用治療糖尿病，包括吡格列酮、羅格列酮等。上述噻唑烷二酮類藥物對(duì)PPAR-γ選擇性較高[19，20]，激活強(qiáng)度在毫微克量級(jí)，希望在不久的將來其獨(dú)特又強(qiáng)大的控制炎癥功效可以用于急性胰腺炎的早期治療。

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（收稿日期：2016-08-18）