丹曲林鈉細菌內毒素測定方法學驗證

陳偉娜　陳嘉璐　曾華哲　王燕清

[摘要]目的通過檢驗、控制丹曲林鈉原料藥的內毒素水平以期控制注射用丹曲林鈉的內毒素限值，因此需要建立丹曲林鈉原料藥的細菌內毒素驗證方法。方法用DMF溶解丹曲林鈉至0.12mg/mL，以靈敏度為0.06EU/mL的兩個廠家的鱟試劑，按照內毒素檢測方法進行了鱟試劑靈敏度復核實驗、溶劑干擾試驗、樣品干擾試驗等方法學驗證實驗。結果兩個廠家鱟試劑的入c均為0.06EU/mL，在0.5～2入之內；采用上述方法進行驗證，溶劑及樣品均無干擾。結論丹曲林鈉原料內毒素驗證需要DMF溶解樣品，按照最低稀釋濃度要求配制的供試品對內毒素的檢測也沒有干擾，因此可以判定可用該方法對本品進行內毒素檢查。

[關鍵詞]丹曲林鈉；細菌內毒素；方法學驗證；DMF

[中圖分類號]R927

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2017）03-53-04

丹曲林鈉的商品名為Dantrium，是美國保潔（P&G）公司研制的藥物，于1979年被美國FDA批準上市。丹曲林鈉用于治療惡性高熱。惡性高熱（malignant hyperthermia，MH）是一種嚴重的骨骼肌肉代謝亢進綜合征，是一種常染色體顯性遺傳性疾病。MH的發生主要是基于骨骼肌細胞內迅速且不可控的ca2+濃度增加，進而產生致死性的代謝亢進危象，在沒有特異性治療藥物的情況下，一般的臨床降溫措施難以控制體溫的增高，最終可導致患者死亡。據報道，在接受全身麻醉的患者中MH發生率在1：10000到1：250000，且各地發生率各有差異。有丹麥研究稱MH發病率在1：250000，紐約的一項研究稱MH發病率在1：100000，同時，另一項法國的研究發現全身麻醉中MH發生率可達1：10000，而且他們發現利用基因檢測的方法預估其發病率應該在1：2000到1：3000之間。近來，有研究稱攜帶MH相關治病基因的幾率可高達1：400。丹曲林鈉是特異性RYRl受體拮抗劑，是目前公認的治療MH發作的特效藥，它能夠關閉RYRl受體的異常開放，迅速減少肌質網釋放Ca2+，從而終止MH發作。其具體作用位點尚不明確，有研究稱可通過改變RYRl與DHPR間的聯系從而抑制DHPR通道，或者通過與RPRl特異性位點結合而抑制該通道。丹曲林鈉自1979年使用以來，MH的死亡率大大降低，從80%降低至不足10%。有研究稱在MH發生早期（30min內）使用丹曲林鈉，其死亡率有明顯降低。

內毒素（endotoxin）是一種革蘭陰性細菌細胞壁外膜的主要組成成分，其化學本質為脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS），是誘發炎癥反應過程中主要的致病成分。因此，對于注射劑必須嚴格控制產品中的內毒素。本文主要闡述如何控制丹曲林鈉的內毒素方法，具體研究如下。

1.材料

1.1實驗器材

DZKW-2型恒溫水浴鍋（上海路達實驗儀器有限公司），XW-80型旋渦混合儀（上海精科實業有限公司），101-2-BS型烘箱（上海市實驗儀器總廠）。

1.2樣品

丹曲林鈉原料，由麗珠醫藥集團研究所提供。

1.3細菌內毒素工作標準品及檢查用水

細菌內毒素工作標準品：批號為150601-200968，效價150EU/支；購自中檢所；細菌內毒素檢查用水：批號為1608220，裝量為5mL/支，購自湛江安度斯生物有限公司。

1.4鱟試劑

鱟試劑1：靈敏度為0.06EU/mL；批號為1601042，裝量：0.1mI/支；購自湛江安度斯生物有限公司；鱟試劑2：靈敏度為0.06EU/mL；批號為160201，裝量：0.1mI]支；購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司。

2.方法與結果

2.1細菌內毒素限值的計算

本原料制成的成品為注射用丹曲林鈉，為靜脈推注注射劑，已知注射劑最大可接受的內毒素劑量K=5EU/kg/h，根據本品所制備成的注射用丹曲林鈉制劑說明書提供的臨床最大使用量，M=600mg/60kg/h（20mg×30瓶），細菌內毒素限值L為：L=K/M=（5EU/kg/h）/600mg/60kg/h=0.5EU/mg，即每1mg丹曲林鈉中含內毒素不超過0.5EU。

2.2最小稀釋濃度的確定

C=入/L=0.06/0.5=0.12mg/mL，因此擬定最小有效稀釋濃度為0.12mg，mL。

2.3鱟試劑靈敏度復核

將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混合15min，然后分步稀釋制備成每1mL含內毒素0.12，0.06，0.03，0.015EU的溶液，依法測定（中國藥典2015年版四部通則1143），結果見表1～2。

計算結果表明，鱟試劑1與鱟試劑2的入c均為0.06EU/mL，在0.5～2入之內，因此鱟試劑標示靈敏度為0.06EU/mL。

2.4干擾實驗

2.4.1供試液制備方法

取本品及參比樣品10mg，依法測定（中國藥典2015年版四部凡例），試驗結果表明本品在N，N-二甲基甲酰胺中溶解，在甲醇中微溶，在冰乙酸中極微溶解，在乙醚、水和乙酸中幾乎不溶。具體試驗結果見表3。

為了保證原料在較小體積的溶液中溶解，本品供試品制劑選用DMF溶解，制備成10mg/mL的溶液。

2.4.2溶劑干擾實驗驗證取溶劑DMF，分別制備溶液A、B、C、D，依法測定（中國藥典2015年版四部通則1143），結果見表4。

由以上數據可得知，溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都均為陰性，溶液C的結果Es為入，在0.5～2入之內，Et為入，在0.5～2Es之內，因此可認為溶劑DMF在該檢測濃度下對鱟試劑無干擾作用。

2.4.3樣品干擾試驗驗證使用內毒素檢查用水和濃度為0.12mg/mL的未檢出內毒素的供試品溶液及細菌內毒素工作標準品。按表5、6分別制備溶液A、B、C、D，依法測定（中國藥典2015年版四部通則1143），結果見表5～6。

由以上數據可得知，兩種鱟劑干擾試驗中溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都均為陰性，溶液C的結果Es為）L，在0.5～2入之內；鱟試劑1干擾試驗溶液B的Et值為0.07，鱟試劑2干擾試驗溶液B的Et值為0.06，Et均在0.5～2Es之內；因此可認為供試品在該檢測濃度下對鱟試劑無干擾作用。

2.5試驗結果

由以上試驗可知，選用的兩種鱟試劑的靈敏度復核符合規定，而且選用的溶劑對內毒素的檢測沒有干擾，按照最低稀釋濃度要求配制的供試品對內毒素的檢測也沒有干擾，因此可以判定可用該方法對本品進行內毒素檢查。

3.討論

細菌內毒素試驗是利用鱟試劑檢測供試品中或其表面可能存在的細菌內毒素濃度的一種方法。細菌內毒素試驗的方法有：凝膠法（gelation assay）、濁度法（turbidimetric assay）、顯色底物法（chlomogendcassay）、免疫法（immunology assay）等。其中經典方法是凝膠法。目前，各國藥典收載的細菌內毒素試驗法均包含凝膠法。

在凝膠法實驗中，需要保證樣品能夠完成溶解，才能準確測定產品中的內毒素限值，但是，由于丹曲林鈉幾乎不溶于水，所以在進行內毒素驗證時無法用水來溶解樣品進行內毒素的檢測。經過對丹曲林鈉溶解度的系統考察，確定采用DMF來溶解。當使用非水溶劑溶解時，需要考察溶劑是否對內毒素的監測產生干擾，本實驗進行了溶劑干擾實驗，實驗結果證明DMF對產品檢測沒有干擾。

因該產品在使用過程中將根據患者的具體病癥進行較大量的給藥，本品按照制劑說明書的最大給藥劑量進行計算內毒素的限值，所以本品的內毒素限度較低，故選用靈敏度較高的（0.06EU/mL）鱟試劑。