MTT法檢測通絡(luò)止痛方對人膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖的影響

楊黎黎 王慶甫 王 歡 張 棟 王偉利 丁昊彬 甘 穩(wěn) 徐銘康 杜汪洋 郭玉茹

(北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京，100029)

MTT法檢測通絡(luò)止痛方對人膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖的影響

楊黎黎 王慶甫 王 歡 張 棟 王偉利 丁昊彬 甘 穩(wěn) 徐銘康 杜汪洋 郭玉茹

(北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京，100029)

目的:探討通絡(luò)止痛方對人膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)滑膜成纖維細(xì)胞增殖的影響。方法：取本院行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者術(shù)中廢棄滑膜組織，經(jīng)I型膠原酶消化后進(jìn)行原代培養(yǎng),取3～4代成纖維細(xì)胞進(jìn)行高、中、低濃度通絡(luò)止痛方干預(yù)。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽法測定(MTT)法檢測KOA滑膜細(xì)胞的增殖水平，并用倒置顯微鏡下觀察各濃度下的細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果：加藥組組間與加藥組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MTT法檢測隨通絡(luò)止痛方濃度減小KOA滑膜細(xì)胞在490 nm波長處吸光OD值數(shù)越大；高中濃度組抑制率為正值，隨濃度增加抑制率增大，低濃度抑制率為負(fù)值，隨濃度降低抑制率減少。結(jié)論：高、中濃度通絡(luò)止痛方對滑膜細(xì)胞增殖有抑制作用，低濃度組的通絡(luò)止痛方對滑膜細(xì)胞有增殖有促進(jìn)作用。

通絡(luò)止痛方；MTT法檢測；人膝骨關(guān)節(jié)炎；成纖維細(xì)胞

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee Ostoeahritis，KOA)是多發(fā)于老年人中的常見退行性疾病，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，但目前為止該病病因尚不明確，也沒有一種治療方法可以從根本上預(yù)防、改變或中止KOA[1]滑膜炎性反應(yīng)在骨關(guān)節(jié)炎病程進(jìn)展中起到的重要作用[2]。其中滑膜細(xì)胞主要分為巨噬樣細(xì)胞(A型細(xì)胞)，成纖維樣細(xì)胞(B型細(xì)胞)和樹突狀細(xì)胞。成纖維細(xì)胞是一種介導(dǎo)關(guān)節(jié)破壞的主要細(xì)胞，抑制成纖維細(xì)胞的增殖，可以有效緩解骨關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)的癥狀及進(jìn)展。通絡(luò)止痛方通過超聲促透的方法治療KOA患者的治療取得了滿意的療效[3-4]。為了明確通絡(luò)止痛方對KOA滑膜炎性反應(yīng)細(xì)胞的作用，本實驗應(yīng)用MTT法檢測通絡(luò)止痛方對KOA滑膜炎性反應(yīng)細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)一步明確該方對滑膜成纖維細(xì)胞的作用，并探討其機(jī)制。為其進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織 人KOA炎性滑膜組織源于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院行關(guān)節(jié)置換治療的KOA患者廢棄滑膜組織。無菌條件下將取得的滑膜組織去除脂肪、纖維等,加入PBS洗滌，PBS清洗2次后放在無菌小青霉素瓶中用解剖剪切碎成糊狀。置于2 mL 0.4%I型膠原酶的25 cm2培養(yǎng)瓶中消化2.5 h(期間搖勻數(shù)次)。經(jīng)200目金屬篩過濾。取未黏附的細(xì)胞移至離心管中，用2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,反復(fù)吹打后將細(xì)胞接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。1～2 d換液1次，選取3～4代細(xì)胞，純度大于98%，經(jīng)鑒定后用于實驗。

1.1.2 試劑與儀器 胎牛血清購自四季青公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)、I型膠原酶均購自Gibco公司。MTT(噻唑藍(lán))、二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。ELX800型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國生物技術(shù)儀器公司)、BH-2型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corning;CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific;25 cm2培養(yǎng)瓶，丹麥NUCU公司；四環(huán)凍干機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.1.3 藥物制備 通絡(luò)止痛處方由桃仁、紅花、桂枝、白芍、制草烏、細(xì)辛、川椒、牛膝、乳香、沒藥組成,購于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥房。將上述中藥飲片按成方比例置煎煮容器內(nèi),加水浸泡,煮沸30 min,棄藥渣取湯劑，經(jīng)過離心機(jī)2 000 r/min離心，棄藥渣取湯劑，利用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，粉末狀，PBS溶解，用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，配制成高、中、低濃度3組依次為：高濃度組：10/42mg/mL、10/43mg/mL、10/44mg/mL；中濃度組：10/45mg/mL、10/46mg/mL、10/47mg/mL；低濃度組：10/48mg/mL、10/49mg/mL、10/410mg/mL；空白組：0 mg/mL。-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測KOA滑膜細(xì)胞增殖活性 取生長狀況良好的成纖維細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，無菌條件下與含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液經(jīng)吹打制成滑膜細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，100 μL/孔，每孔細(xì)胞約1 000個。每塊96孔板四周邊孔用PBS填充以避免邊緣效應(yīng)。將細(xì)胞放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁并進(jìn)入對數(shù)增長期。

棄上清液，加入已配置的不同濃度通絡(luò)止痛方100 μL/孔，每種濃度設(shè)置4個復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中，36 ℃，5%CO2培育24 h。培養(yǎng)箱培育后吸棄各孔藥物，用PBS洗3遍。換入5 mg/mL的MTT-PBS液10 μL/孔，無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，終止培養(yǎng)。棄上清，加DMSO 100 mL/孔震蕩10 min后，在ELX800型酶標(biāo)儀上測其在490 nm波長處的吸光OD值(A)。用A值按如下公式計算各濃度藥物干預(yù)后的細(xì)胞抑制率，公式如下：

抑制率(%)=(A空白-A藥液)/A空白×100%,抑制率為正數(shù)時,表明該藥物對細(xì)胞的增殖有抑制作用，抑制率為負(fù)數(shù)時表明該藥物對細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡觀察各組不同濃度細(xì)胞的生長特點及形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 鏡下觀察滑膜細(xì)胞的生長 原代培養(yǎng)細(xì)胞4 h可見細(xì)胞貼壁(圖1)，細(xì)胞成星狀，通過3～4條樹突與培養(yǎng)瓶相貼，細(xì)胞器不明顯，細(xì)胞密度稀疏。隨培養(yǎng)時間至3～4代細(xì)胞(圖2)，形態(tài)成滑膜成纖維細(xì)胞呈梭形、樹突樣，胞核狹長,增殖旺盛,細(xì)胞器可見。低濃度通絡(luò)止痛方對人KOA滑膜細(xì)胞生長有促進(jìn)作用，細(xì)胞數(shù)量明顯增多。高濃度通絡(luò)止痛方對于細(xì)胞生長有抑制作用，可見少量細(xì)胞漂浮，緊密排列無規(guī)則，外觀多由梭形皺縮為圓形。

圖1 原代培養(yǎng)4 h貼壁KOA滑膜細(xì)胞

2.2 MTT法測定不同濃度組KOA滑膜細(xì)胞增殖活性 加藥組組間與加藥組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MTT法檢測隨通絡(luò)止痛方濃度減小KOA滑膜細(xì)胞在490 nm波長處吸光OD值數(shù)越大。見表1。高、中濃度組通絡(luò)止痛方對于KOA滑膜細(xì)胞的增殖有抑制作用，隨濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，高濃度較中濃度的抑制率明顯增加，但高濃度中，隨著濃度增加，抑制率的增長幅度減小。低濃度組的通絡(luò)止痛方對滑膜細(xì)胞有增殖有促進(jìn)作用。隨濃度的減低，促進(jìn)作用增強(qiáng)，但低濃度中，隨著濃度減低，促進(jìn)作用的增強(qiáng)幅度減低。見表2、圖3。

圖2 KOA滑膜3～4代細(xì)胞細(xì)胞

表1 通絡(luò)止痛方干預(yù)對KOA滑膜細(xì)胞增殖影響的OD值

注：與空白組比較，*P<0.05。

表2 不同濃度通絡(luò)止痛方對KOA滑膜細(xì)胞增殖抑制率(%)

3 討論

KOA是關(guān)節(jié)炎里最常見的疾病，根據(jù)人口統(tǒng)計學(xué)資料預(yù)測，到2020年，受關(guān)節(jié)疾病影響的人口比例將占到全世界人口的50%,將有5.7億人受到KOA的困擾。KOA是世界上導(dǎo)致殘疾的第八大疾病[5]。盡管如此，但KOA發(fā)病機(jī)制還不清楚。并且到目前為止，還沒有一種治療方法可以從根本上預(yù)防、改變或中止KOA的疾病進(jìn)程[6]。最后多數(shù)KOA晚期患者不得不通過接受膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，來“治愈”KOA。而很多KOA患者由于自身身體條件及家庭經(jīng)濟(jì)承受能力所限，無法接受膝關(guān)節(jié)置換術(shù)。因此，研究KOA的發(fā)病機(jī)制，并尋找防治KOA的有效治療藥物及手段是保證國民健康，提高KOA患者生活質(zhì)量和減輕國家醫(yī)療負(fù)擔(dān)的迫切需求。盡管KOA被普遍認(rèn)為是一種退行性疾病，但滑膜炎性反應(yīng)在KOA病理和臨床的重要作用逐漸被認(rèn)識[7]。骨性關(guān)節(jié)炎的病因?qū)W主要表現(xiàn)在2個方面：一是關(guān)節(jié)軟骨破壞導(dǎo)致軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性改變，二是滑膜炎性反應(yīng)致使滑膜細(xì)胞釋放炎性反應(yīng)遞質(zhì)。有研究報道，骨性關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)軟骨在致病因素作用下被破壞后，釋放碎片進(jìn)入滑液，刺激滑膜引起滑膜炎。滑膜炎釋放炎性反應(yīng)遞質(zhì)，進(jìn)一步降解軟骨，周而復(fù)始造成惡性循環(huán)，故滑膜炎的存在是骨性關(guān)節(jié)炎軟骨損傷及骨性關(guān)節(jié)炎慢性持續(xù)化的重要原因[8]。因此，因此探討對于滑膜炎的干預(yù)藥物，對研究治療滑膜炎及延緩治療KOA有重要意義。

圖3 不同濃度通絡(luò)止痛方對KOA滑膜細(xì)胞增殖抑制率(%)

注：1～9代表濃度10/42～10/410mg/mL。

了解細(xì)胞的存活與增殖情況，在細(xì)胞水平研究中是非常重要的。目前，主要的檢測方法有同位素?fù)饺敕ê突罴?xì)胞計數(shù)法。前者利用放射同位素，機(jī)器價格昂貴，污染較大。后者結(jié)果易受主觀因素影響，操作繁瑣，誤差大。因此2種方法都有一定的使用限制。MTT法應(yīng)用原理是線粒體MTT法的主要原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的紫色結(jié)晶物甲瓚(Formazan),并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無此功能。以其簡便、經(jīng)濟(jì)、安全等特點,而被廣泛使用。

通絡(luò)止痛方是我們導(dǎo)師憑借多年治療KOA的經(jīng)驗總結(jié)而成，組成包括：桃仁、紅花、桂枝、白芍、制草烏、細(xì)辛、川椒、牛膝、乳香、沒藥。主要功效包括活血化瘀，通絡(luò)止痛。其中白芍、桂枝為通絡(luò)止痛湯的君藥，桂枝辛甘溫，有溫通經(jīng)脈，助陽化氣之功效；白芍苦、酸、微寒，有養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛之功效。兩者合用一斂一散,一補一開，解肌發(fā)表,調(diào)和營衛(wèi),使發(fā)汗而不傷陰，氣血調(diào)而不傷氣。兩藥合用亦可治療氣血不調(diào)導(dǎo)致的四肢酸楚、麻木、疼痛等。以桃仁、紅花、乳香、沒藥為臣藥，可活血祛瘀、行氣止痛、舒筋通絡(luò)。紅花、桃仁為活血化瘀常用藥對。紅花辛溫,主入心、肝經(jīng),散瘀止痛。《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》云：“乳香、沒藥，二藥并用，為宣通臟腑、流通經(jīng)絡(luò)之要藥，……具通氣活血之力，又善治風(fēng)寒濕痹，周身麻木，四肢不遂及一切瘡瘍腫疼，或其瘡硬不疼。”這4味藥可加強(qiáng)行氣活血化瘀的藥力，正所謂“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”。制草烏、細(xì)辛為本方的佐藥，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、消腫止痛之效。川椒為為本方的使藥，具有活血祛瘀、祛風(fēng)利濕之效。牛膝“性善下行”，具有良好的引經(jīng)作用，且有補肝腎,強(qiáng)筋骨之功。全方組成嚴(yán)謹(jǐn)，配伍精湛。

為了增加該方有效的理論依據(jù)，我們進(jìn)行了一系列臨床及基礎(chǔ)研究。臨床試驗發(fā)現(xiàn)，通絡(luò)止痛外治法治療KOA可有效減輕患者疼痛、改善膝關(guān)節(jié)功能[3]；動物實驗發(fā)現(xiàn)，通絡(luò)止痛外治法能夠顯著抑制兔KOA滑膜細(xì)胞炎性反應(yīng)因子生成[9-10]；作用于大鼠不同程度KOA中通過降低血清中軟骨基質(zhì)相關(guān)細(xì)胞因子CTX-Ⅱ、COMP和MMP-3含量可以有效減緩或阻止膝關(guān)節(jié)軟骨的退行性變[11-12]；將該方君藥桂枝的有效成分桂皮醛作用于人KOA滑膜細(xì)胞，證明DAMPs/Toll樣受體(TLRs)介導(dǎo)的NF-κB炎性反應(yīng)通路在骨性關(guān)節(jié)炎滑膜炎性反應(yīng)中起到重要的調(diào)控作用，NF-κB通路上的許多基因均參與骨性關(guān)節(jié)炎滑膜炎性反應(yīng)[13]。將該方君藥桂枝、白芍的有效成分桂皮醛、白芍總苷作用于人KOA滑膜細(xì)胞，對骨性關(guān)節(jié)炎滑膜炎性反應(yīng)起到調(diào)控作用，參與骨性關(guān)節(jié)炎滑膜炎性反應(yīng)[14]但是該方作為成方進(jìn)行的研究還沒有開展，導(dǎo)致作用機(jī)制尚不清楚，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。本實驗建立人KOA滑膜成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,以MTT法[15]觀察不同濃度通絡(luò)止痛方對人成纖維細(xì)胞增殖的影響,篩選出合適藥物濃度。進(jìn)一步探討通絡(luò)止痛方的作用機(jī)制，為該方劑進(jìn)行新藥開發(fā)研制、走向市場提供一定的實驗參數(shù)。

[1]FAWAZ-ESTRUP F.The osteoarthritis initiative:an overview[J].Med HealthRI,2004,87(6):169-171.

[2]Benito MJ，Veale DJ，F(xiàn)itzgerald O，et al.Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis[J].Ann Rheum Dis，2005,64(9):1263-1267.

[3]殷岳杉.低頻超聲促透通絡(luò)止痛湯治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎30例病例報告及促透機(jī)理研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué),2012.

[4]王慶甫，祁印澤，陳兆軍,等.超聲電導(dǎo)透射通絡(luò)止痛中藥外治膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床觀察[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，33(4):283-285.

[5]Irchfield，P.C.Osteoarthritis overview[J].Geriatr Nurs，2001，22(3)：124-130，quiz 130-131.

[6]Fawaz-Estrup，F(xiàn).The osteoarthritis initiative：an overview[J].Med Health RI，2004，87(6)：169-171.

[7]Jan B, Blom AB, Shane W, et al.The role of synovial macrophages and macrophageproduced mediators in driving inflammatory and destructive responses in osteoarthritis[J].Arthritis Rheum，2010，62：647-657.

[8]Haynes M K，Hume J B.Phenotypic characterization of inflammatory cells from osteoarthritic synovium and synovial fluds[J].Clm Immunol，2002，105(3)：315.

[9]王慶甫,馬玉峰,殷岳衫,等.低頻超聲促透中藥對兔膝關(guān)節(jié)炎細(xì)胞因子的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,36(2):108-112.

[10]殷岳杉,王慶甫,馬玉峰,等.低頻超聲促進(jìn)中藥桂枝局部透入的實驗研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,36(12):825-828.

[11]戚晴雪，馬玉峰，吳忌,等.低頻超聲促透通絡(luò)止痛中藥對不同程度膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型CTX-Ⅱ、COMP及MMP-3的影響[J].世界中醫(yī)藥，2015,10(4):564-569.

[12]戚晴雪，馬玉峰，吳忌,等.低頻超聲促透通絡(luò)止痛方對大鼠不同程度膝骨關(guān)節(jié)炎的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2014，30(3):244-248.

[13]石鑫超.通絡(luò)止痛外治法通過Toll樣受體通路干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥機(jī)制的研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué),2015.

[14]王歡,王慶甫,楊黎黎,等.白芍總苷對人膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2016,31(11):4853-4856.

[15]司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].西安:世界圖書出版社,1996：187.

(2016-06-16收稿 責(zé)任編輯：白樺)

Effect of Tongluo Zhitong Decoction on Proliferation of Synovial Fibroblasts in Patients with Knee Osteoarthritis by MTT

Yang Lili,Wang Qingfu,Wang Huan,Zhang Dong,Wang Weili,Ding Haobin,Gan Wen,Xu Mingkang,Du Wangyang,Guo Yuru

(TheThirdAffiliatedHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To explore the effect of Tongluo Zhitong Decoction on the proliferation of knee osteoarthritis (KOA) synovial fibroblasts. Methods:The abandoned synovial tissues were taken from patients who had knee replacement surgery in the hospital. The tissues were primarily cultured after digestion in I type collagenase. Three to four generation fibroblasts were taken for high-medium-low concentration intervention. The proliferation of KOA synovial cells was detected by 4-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) and the cell morphology was observed under the inverted microscope. Results:Comparisons between the drug groups and comparisons between the drug groups and the control group,the difference was statistically significant (P<0.05). MTT assay showed that s the light OD number of KOA synovial cells became greatest in the wavelength of 490 nm when Tongluo Zhitong Decoction concentration decreased. The inhibition rates of high-medium concentration groups were positive. With the increase of the concentration,the inhibition rate increased and the inhibition rate of the low concentration group was negative. With the concentration decreased,the inhibition rate reduced. Conclusion:The medium-high concentrated Tongluo Zhitong Decoction may inhibit the proliferation of synovial cells,while low concentrated Tongluo Zhitong Decoction may promote the proliferation of synovial cells.

Tongluo Zhitong Decoction; MTT method; Knee osteoarthritis; Fibroblast

國家自然科學(xué)基金面上項目(編號：81373662)；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項目(編號：2016-JYB-XS192)

楊黎黎(1987.07—)，男，博士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治退行性骨關(guān)節(jié)炎，E-mail：105381902@qq.com

王慶甫(1956.10—)，男，碩士研究生，教授，主任醫(yī)師，副院長，研究方向：中醫(yī)藥防治退行性骨關(guān)節(jié)炎，E-mail：qingpu-wang@sohu.com

R274.9；R-332

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.05.038