針刀干預對帕金森病模型大鼠小膠質細胞及IL-1β表達的影響

馬薇薇 郭長青 蘆 娟 杜寧宇 梁靖蓉 吳 桐 盧勝春

(1 北京中醫藥大學針灸推拿學院,北京,100029; 2 江西省德興市勝春醫院,江西,334200)

針刀干預對帕金森病模型大鼠小膠質細胞及IL-1β表達的影響

馬薇薇1郭長青1蘆 娟1杜寧宇1梁靖蓉1吳 桐1盧勝春2

(1 北京中醫藥大學針灸推拿學院,北京,100029; 2 江西省德興市勝春醫院,江西,334200)

目的:探討針刀療法治療帕金森病(Parkinson′s Disease,PD)的炎性作用機制。方法:將48只大鼠隨機分為正常組、模型組、針刀組、電針組。采用立體定位技術將6-羥基多巴胺(6-DAOH)注入大鼠右側紋狀體制備PD大鼠模型。針刀組于枕下肌群和C1-2橫突處進行松解干預,2次/周,連續4周;電針組選“百會”“太陽”穴,由“百會”透刺“太陽”穴進行電針干預,3次/周,連續4周。采用HE染色光鏡下觀察神經元細胞形態、數目及小膠質細胞數目變化,酶聯免疫吸附法(ELisa)檢測IL-1β的水平。結果:與正常組比較,模型組大鼠損毀側多巴胺能神經元細胞數目減少,小膠質細胞數目增多,IL-1β水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,針刀組和電針組大鼠損毀側多巴胺能神經元細胞數目增多,小膠質細胞數目減少,IL-1β水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。結論:針刀療法可以改善多巴胺能神經元細胞的形態和數目,其機制可能是通過抑制小膠質細胞激活介導的炎性反應,降低炎性因子IL-1β的含量,從而治療PD。

帕金森病;針刀;6-羥基多巴胺(6-DAOH);白介素-1

帕金森病(Parkinson′s Disease,PD)是老年人多發的神經系統疾病,其特征性病理學表現是中腦黑質多巴胺(DA)能神經元細胞的變性和丟失。迄今為止,其病因尚未完全明確,神經系統老化、遺傳因素、內外環境因素、氧化應激反應、免疫異常、線粒體功能障礙與細胞凋亡等假說較為流行[1],其中神經炎性反應在PD發病過程中持續發揮作用,理由可歸結如下:非甾體類抗炎藥物可降低PD的患病率[2];炎性反應信號通路MAPKs及HLA基因位點與PD患病風險存在相關性[3-4];應用追蹤劑PK11195標記活體PD大鼠腦內的小膠質細胞,并使用PET-CT掃描證實了小膠質細胞被激活[5];PD患者尸檢顯示存在促炎性遞質[6]。故認為炎性因子水平的升高是導致PD的重要因素之一。臨床上已有實踐證明,針刀治療PD具有很好的效果[7],但相關的實驗性研究較少。本實驗采用立體定位技術將6-羥基多巴胺(6-DAOH)注入大鼠右側紋狀體制備PD大鼠模型,觀察針刀干預對小膠質細胞及白介素細胞1(IL-1β)表達的影響,探討針刀治療PD的炎性機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用SPF級的健康雄性SD大鼠共48只,周齡12周,重量為(200±20) g,購買于北京維通利華公司實驗動物中心,該動物許可證號為SCXK(京)2012-0001。實驗前1周選購大鼠,并將大鼠隨機分為模型組、正常組、針刀組、電針組4組,于北京中醫藥大學SPF級實驗室內適應性飼養1周,自由進食飲水。第2周進行實驗,術前12 h內禁食不禁水。

1.1.2 試劑與儀器 6-羥基多巴胺(6-DAOH)和阿撲嗎啡(APO)(美國Sigma),水合氯醛(天津科密歐化學試劑中心),多聚甲醛(常德市華生醫療器械有限公司),HE染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);0.9%氯化鈉溶液(哈藥集團三精制藥有限公司)。漢章系列一次性針刀:規格0.4 mm×40 mm(北京卓越華友醫療器械有限公司);中研太和牌針灸針:規格0.25 mm×25 mm(北京中研太和醫療器械有限公司);韓氏電針治療儀;5 mL微量進樣器(上海安亭微量進樣器廠);腦立體定位儀(美國Stoelting公司),AE-160電子天平(瑞士MET-TLER公司),人IL-1β試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 48只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、針刀組和針灸組。以10%的水合氯醛腹腔內注射麻醉,用剃毛機剔除顱頂部鼠毛,將動物頭部固定在立體定位儀上,頭部備皮碘伏消毒后,用手術刀片在右耳前做長1.5 cm的切口,處理切口面至暴露出前囟,確定前囟坐標。按照包新民[8]的《大鼠腦立體定向圖譜》定位注射靶點坐標如下:1)第1點為前囟前0.7 mm,頂正中線右3.0 mm,深度為4.5 mm(不包括顱骨的厚度);2)第2點為前囟后0.2 mm,頂正中線右2.6 mm,深度為6.0 mm[3]。打開微型電鉆,采用持筆式持微型電鉆,電鉆保持與大鼠大腦骨面垂直,并按上述坐標鉆孔,將15 μg的6-OHDA溶于3 μL的生理鹽水(含0.2%維生素C)中,以5 μL微量注射器向腦內2個預定靶點緩緩注入,注完后留針約10 min。退針時,以1 mm/min的速度緩緩出針,并用手術彎鑷鑷取適當大小的海綿明膠填塞鉆孔,用手術線縫合。腹腔注射青霉素鈉8萬U后將大鼠放回籠中保溫修養。正常組不作任何處理。術后4周腹腔注0.01%的APO(0.5 mL/kg),開始觀察并記錄大鼠旋轉的啟動時間、持續時間、啟動后60 min內旋轉圈數,記錄大鼠注射后的行為變化,記錄標準為頭尾相接并向健側恒定旋轉,若大鼠旋轉圈數為7次/min以上,則視為造模成功。

1.2.2 干預方法 正常組、模型組正常飼養不予以治療,共4周。針刀組選用漢章系列一次性使用針刀,規格0.4 mm×40 mm(北京卓越華友醫療器械有限公司)。治療點及操作步驟:選取枕下肌群和C1-2橫突點,用紫藥水在進針刀部位做“×”型記號,進針刀時刀口線的方向與脊柱方向平行,刀體與大鼠皮毛面垂直刺入,針刺至枕骨骨面和C1-2橫突處,當刀口接觸骨面時,按刀口線方向縱行疏剝,迅速出刀并加壓片刻,防止出血,治療2次/周,共治療4周。電針組參照文獻全國針灸學會實驗針灸研究會制定的“實驗動物針灸穴位圖譜”[6],選取“百會”“太陽”位置,用0.25 mm×25 mm毫針針刺,沿皮由百會透刺單側太陽,刺畢接韓氏電針治療儀,疏密波,頻率100 Hz,強度約2 mA,電針強度以大鼠頭部微顫為宜,使動物不掙扎嘶叫保持安靜為度,治療3次/周,20 min/次,共治療4周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 病理標本制備 取各組大鼠4只,腹腔注射10%的水合氯醛,麻醉后,先用生理鹽水灌注心腔內,后以提前配制好的多聚甲醛進行固定,固定好后立即斷頭取腦,在冰袋上迅速分離出大鼠的紋狀體,并將其置于4%的多聚甲醛溶液中進行后固定。常規脫水,石蠟包埋,連續冠狀切片,采用HE染色光鏡下觀察黑質內多巴胺能神經細胞的形態。另外取各組8只大鼠麻醉狀態下處死后快速斷頭取腦,在冰面上迅速分離出右側紋狀體,用0.32 mmol/L含蛋白酶抑制劑的蔗糖液制作組織勻漿,15 000 r/min離心10 min,采用酶聯免疫吸附Elisa法檢測上清液白介素細胞-1(IL-1β)的水平。

1.2.3.2 HE染色檢測步驟 石蠟切片脫蠟至水;用蘇木精液在室溫條件下染色5 min,自來水充分沖洗1 min;鹽酸分化30 s;水稍洗至促藍液返藍;置于1%的伊紅液染2 min;梯度乙醇常規脫水,透明,封片。結果顯示:胞質呈粉紅色,細胞核呈藍紫色。

2 結果

2.1 形態學觀察 光鏡下觀察,正常組的DA神經元細胞形態完整,細胞及神經纖維排列較整齊,核呈現卵圓形或椎形,且細胞核大,較為清晰,核仁較明顯;模型組:DA神經元細胞數目明顯減少,部分細胞固縮且體積較正常組小,神經纖維排列散亂,細胞核形態大小不一,且偏居一側,核仁不清晰,此外在脫失的多巴胺能神經元細胞周圍,分布著大量核小、深染,呈扁圓形或三角形的小膠質細胞;電針組:神經元細胞數目增多,小膠質細胞數量減少,神經纖維排列較整齊;針刀組神經元細胞數目增多,小膠質細胞減少,較模型組改善明顯。

圖1 各組大鼠紋狀體多巴胺能神經元細胞形態學變化(HE染色,4×20倍)

表1 白介素細胞1(IL-1β)含量比較

注:與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01,▲▲P<0.01。

2.2 白介素細胞1(IL-1β)含量比較 結果顯示,與正常組比較,模型組大鼠紋狀體內IL-1β水平明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,針刀組、電針組大鼠紋狀體內IL-1β水平均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01),說明電針治療和針刀干預能有效降低大鼠紋狀體內IL-1β的含量;針刀組大鼠紋狀體內IL-1β的含量略低于電針組,2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。3 討論

通過諸多參考文獻顯示,PD模型的選擇是制備大鼠PD模型的關鍵,目前常用的方法是利用物理或化學的方法損毀多巴胺能系統。建立該模型,一種是淺靜脈注入甲基-苯基-四氫毗咤制備模型,通常選擇C57BL/6J的小鼠作為造模對象;另一種采用大腦立體定位儀將6-OHDA注入大鼠中腦紋狀體中制備模型,一般選取大鼠作為造模對象。因小鼠個體小,取腦組織研究相對困難,而且針刀松解剝離范圍較大,損傷程度亦大,針刺時不容易精準定位,所以根據實驗需求,本實驗選取個體大,容易精準定位的大鼠進行6-OHDA單側紋狀體進行模型制備,采用單側而非雙側是根據王剛等人的研究認為單側損毀的方法成熟、操作相對容易、死亡率較低且模型穩定性高[9]。Ungerstedt于1968年首先報道了采用6-OHDA制作PD動物模型,他提出,動物的旋轉模型特點與人類PD發病的特點相似[10]。研究表明注入6-OHDA后對紋狀體黑質的損傷在6個月到10個月內無顯著的改變,且不存在紋狀體再生現象,證明本模型穩定性較高[11]。

近年來的臨床醫家治療PD主要是以頭針為主,配合腹針、中藥、拔罐等多種針法綜合治療在改善PD癥狀方面療效較為肯定[12-14]。亦有醫家運用針刀療法治療PD取得良好的效果,如肖德華[15]選取頸背部為治療點,治療PD療效顯著。周蕾[16]等人運用頭皮電針結合督脈接力針、針刀綜合治療PD療效佳,安全性好。本實驗以枕下肌群和C1-2橫突點為進針刀點,是通過松解枕下肌群和觸激頸上交感神經節,改善頸部肌肉痙攣引起的腦血循環和代謝障礙。有學者從影像學證實了寰枕段和橫突段容易受頸軟組織炎性壓迫等因素刺激導致血管痙攣出現眩暈、頭痛、惡心、嘔吐、視覺障礙等缺血癥狀[17]。由于頸上神經節支配頸內動脈,而頸內動脈的分支大腦中脈是中腦血供的主要動脈,所以大腦中動脈的供血間接受頸上交感神節經影響。肖德華[18]認為在PD患者中,黑質內多巴胺含量的不足與腦供血相關,因合成多巴胺的原料來源于血液,而原料的缺乏是導致黑質內多巴胺含量不足的主要原因。由此我們推測,通過刺激枕下肌群和C1-2橫突,能改善PD患者寰枕段肌肉軟組織損傷及頸上交感神經節壓迫狀態,直接或間接的影響大腦中動脈供應黑質的血運,增加腦內多巴胺的合成原料,從而減輕PD的癥狀。

腦內IL-1有IL-1α和IL-1β 2種亞型,但以IL-1β為主,可參與免疫調節、介導炎性反應等。許多外源性刺激或病理狀態可以使IL-1β的分泌水平明顯升高。Mogi[19]等人經活檢發現,PD患者紋狀體尾狀核、殼核處的IL-1β等炎性細胞因子的濃度高于大腦皮質區。楊海華[20]等認為中樞神經系統退變性疾病過程中細胞因子水平持續升高,會對神經元產生損傷作用,其中對神經元產生損傷作用的主要有TNF-α、NO、IL-1β、TNF-γ。大量體外研究發現神經細胞表面都有相應受體的表達,既可以直接對表達相應受體的神經元細胞產生毒性作用,也可以通過進一步活化小膠質細胞這樣一個間接的途徑,產生一系列神經毒性物質。由于小膠質細胞是IL-1β的主要來源,IL-1β可上調小膠質細胞的活性,使小膠質細胞分泌更多的前炎性細胞因子,導致炎性損害進一步加重。Griffin[21]等人研究認為IL-1β基因的多態性可以使AD的發病風險增加6倍。小膠質細胞的激活和炎性因子白介素的釋放在PD的發病機制和其慢性病程發展中起重要作用[22]。所以抑制小膠質細胞的激活和炎性反應是緩解PD進程的之一。

在本實驗結果中,與正常組比較,模型組PD大鼠的DA神經元細胞數目明顯減少,部分細胞固縮且體積減小,神經纖維排列較散亂,細胞核形態不一,核仁不清晰,變性的神經元細胞周圍存在大量神經膠質細胞,ELisa檢測顯示IL-1β細胞表達上調;電針組和針刀組大鼠多巴胺能神經元細胞形態得到改善,ELisa檢測顯示IL-1β細胞表達下降。結果說明6-OHDA介導的模型大鼠中多巴胺能神經元存在著嚴重損害,而針刀治療能顯著提高模型大鼠黑質多巴胺能神經元數量,改善神經元細胞形態,反應出針刀干預對模型大鼠黑質多巴胺能神經元具有明顯的保護作用。此外,炎性反應細胞因子IL-1β的表達可能造成神經元細胞變性丟失,參與了PD的發病過程。模型組和針刀組小膠質細胞數目的變化提示小膠質細胞被激活也可能是IL-1β的主要來源。說明針刀調節多巴胺能神經元的變性是通過抑制小膠質細胞激活介導的炎性反應,下調細胞因子IL-1β的表達來減輕神經元損傷的。針刀可通過降低大鼠紋狀體內IL-1β的表達,減輕炎性反應對多巴胺能神經元的損傷,一定程度上阻止多巴胺能神經元變性丟失進程從而治療PD。

[1]國華,宋軍平.帕金森病發病機制最新國內外研究進展[J].職業與健康,2012,28(4):490-492.

[2]Jacobs E,Schwarzschild M.A,A.Ascherio,等.非甾體抗炎藥的使用與帕金森病風險的關系[J].世界核心醫學期刊文摘:神經病學分冊,2006，1(5):16.

[3]徐評議,孫叢叢.HLA-DRB1等位基因與散發性帕金森病易感性的相關性研究[A].//中華醫學會第十七次全國神經病學學術會議論文匯編(下)[C].廈門：2014.

[4]龔元勛.針刺對帕金森病模型大鼠腦內MAPKs信號通路及炎性反應的作用研究[D].武漢:湖北中醫藥大學,2014.

[5]高靚,張玉虎,王麗娟.帕金森病與神經免疫炎癥研究的新進展[J].臨床神經病學雜志,2014,27(3):234-236.

[6]陳清,趙楊.炎性反應與帕金森病的研究進展[J].中國神經免疫學和神經病學雜志,2015,22(6):434-437.

[7]肖德華,齊丹丹.針刀松解法治療帕金森病[J].世界針灸雜志(英文版),2012,22(2):60-63.

[8]包新民,舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜[M].北京:人民衛生出版社,1991:19-49.

[9]王剛,鄭靜.6-OHDA損毀帕金森大鼠模型和MPTP誘導帕金森小鼠模型的比較[J].南京醫科大學學報:自然科學版,2010,30(3):383-385.

[10]周厚廣,陸建明,鮑遠程,等.6-羥基多巴胺帕金森病大鼠模型的建立與評價[J].中國行為醫學科學,2002,11(1):4-7.

[11]蔣花,王順.頭部電針透穴對帕金森病模型大鼠細胞凋亡的作用機制研究[D].哈爾濱:黑龍江省中醫研究院,2008.

[12]陳秀華,李漾,奎瑜.腹針配合美多巴治療帕金森氏病臨床觀察[J].中國針灸,2007,27(8):562-564.

[13]丁淑強.針刺配合刺絡拔罐治療震顫麻痹87例療效觀察[A].天津國際針灸暨中醫臨床學術會議[C].天津,2000:737-737.

[14]張晶,劉璇,劉琛,等.針刺配合中藥治療震顫麻痹32例臨床觀察[J].中國民康醫學,2005,17(10):624-624.

[15]肖德華,齊丹丹.針刀松解法治療帕金森病[J].世界針灸雜志(英文版),2012,22(2):60-63.

[16]周蕾,鄭水紅.針刺結合針刀治療帕金森病的療效對照觀察[J].針灸臨床雜志,2014,30(5):14-17.

[17]徐小柳,李殿寧,周建斌,等.針刀定點松解枕下肌群治療椎動脈型頸椎病30例臨床觀察[J].江蘇中醫藥,2016,48(5):64-66.

[18]肖德華.帕金森病的針刀頸部治療及病因新釋(附5例典型病例報告)[J].臨床薈萃,2010,25(10):907-908,封2.

[19]成曉華,劉斌,馬原源,等.咪多吡對帕金森病模型大鼠黑質炎性因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達的影響[J].免疫學雜志,2014,30(8):671-676.

[20]楊海華,徐評議,劉焯霖.小膠質細胞與中樞神經系統變性疾病[J].國外醫學:內科學分冊,2006,33(1):36-39.

[2]Griffin W S,Mrak R E.Interleukin-1 in the genesis and progression of and risk for development of neuronal degeneration in Alzheimer′s disease[J].Journal of Leukocyte Biology,2002,72(2):233-238.

[22]李淑娟.小膠質細胞與白介素在帕金森病發病機制中作用的實驗研究[D].長春:吉林大學,2005.

(2016-09-06收稿 責任編輯：王明)

Effects of Acupotomy on Microglic and the Expression of IL-1Β in Parkinson′s Diseases

Ma Weiwei1,Guo Changqin1,Lu Juan1，Du Ningyu1， Liang Jingrong1， Wu Tong1，Lu Shengchun2

(1CollegeofAcupunctureandMoxibustion，BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029，China; 2ShengchunhospitolofDexingcity,Jiangxi334200,China)

Objective: To explore the mechanism of acpotomy in Parkinson′s disease (PD). Methods: Fourty-eight rats were randomly divided into a model group, a normal group, an acupuncture group and an acupotomy group. Using the technology of Stereo-positioning to inject the 6-hydroxy dopamine (DAOH) into the right striatum of rats to build PD rats model; Rats in the acupotomy group were treated by disposable acupotomy at suboccipital muscle group and transverse process of C1-2, twice a week for continued four weeks. Electroacupuncture (EA) group were treated by acupuncture at Baihui and Taiyang, to strike Taiyang from Baihui, third a week for four weeks. HE staining method was used for observation of morphology, quantity of neurons and quantity of microglia, and Elisa method was used for testing the expression of IL-1β. Results: Compared with the nomal group, the quantity of the dopaminegic neurons in the damaged side of PD model group obviously decreased, while microglic increased, and the level of IL-1β was improved with significant difference(P<0.05).Compared with the model group, the quantity of the dopaminegic neurons in the damaged side of the acpotomy and EA group increased obviously, while microglic decreased, and the level of IL-1β was alleviated with significant difference(P<0.05).Conclusion: Acupotomy can improve the morphology and quantity of dopaminergic neurons and its mechanism may be mediated by inhibition of microglia activation of inflammatory reaction, reducinf the content of inflammatory cytokines IL-1 beta, thus to treat PD.

Parkinson′s disease; Acpotomy; 6-hydroxy dopamine;IL-1β

企事業單位委托科技項目(編號:535104032)——針刀治療帕金森病機制的研究

馬薇薇(1991.06—),女,碩士研究生三年級,研究方向:針刀理論與臨床研究,E-mail:244296978@qq.com

郭長青(1959.01—),男,碩士,教授,博士研究生導師,研究方向:針刀理論與臨床研究,Tel:(010)64286687,E-mail:guochangqing66@163.com

R245.31

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.05.041