蜂膠黃酮
——鋁鋯復合氧化物的制備和緩釋性能研究

趙傳怡 張慶樂 許福生 張凌霄 王福剛 王浩

（泰山醫學院藥學院，泰安 271016）

蜂膠黃酮
——鋁鋯復合氧化物的制備和緩釋性能研究

趙傳怡 張慶樂 許福生 張凌霄 王福剛 王浩

（泰山醫學院藥學院，泰安 271016）

利用鋁鋯復合氧化物作為新型藥物緩釋材料，對蜂膠黃酮進行負載和緩釋，為提高其生物利用度提供科學依據。方法:利用植物提取液為軟模板合成鋁鋯復合氧化物，通過單一因素試驗評價該材料的制備條件對蜂膠黃酮負載率的影響，并利用體外試驗分析了蜂膠黃酮的緩釋效果。結果:以冬青提取液作為溶劑、三氯化鋁和氯氧化鋯的摩爾比為8∶1，添加0.08 g納米海泡石和400 mg/L環糊精時制備的鋁鋯復合氧化物對蜂膠黃酮的最大負載率為83.41%。蜂膠黃酮—鋁鋯復合氧化物在模擬胃液和腸液中最大釋放時間為480 min。結論:鋁鋯復合氧化物適宜作為蜂膠黃酮的緩釋載體。

鋁鋯復合氧化物；蜂膠黃酮；冬青提取液；緩釋

黃酮類化合物是一類重要的植物次生代謝物質，廣泛分布于植物的根、表皮、葉片和果實中，其在植物體內的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素[1]。許多研究表明，黃酮類化合物具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、降血脂、增強免疫力等多種藥理活性，在預防阿爾默茨海默病和心血管疾病等方面具有極為重要的應用價值[2-4]。與大多數天然植物相比，蜂膠中所含有的黃酮種類豐富且含量較高，其提取技術和藥物制劑劑型的研究引起了中外學者的廣泛關注。乙醇提取法是目前蜂膠黃酮和其他植物黃酮提取中應用最為廣泛的提取技術[5]，然而由于蜂膠黃酮難溶于水，生物利用度低，其在醫學上的應用受到很大限制[6]。開發黃酮制劑的新劑型，提高其生物利用度成為當前的研究熱點。

載藥納米粒是一種藥物控釋和緩釋的新劑型，常用的載藥材料包括生物可降解聚合物如聚乳酸、聚己內酯等疏水性聚合物[7，8]、殼聚糖、海藻酸鈉等親水性聚合物[9，10]和固體脂質如飽和脂肪酸甘油酰、卵磷脂、甘油三酯等[11，12]。層狀雙金屬氧化物因其具有良好的生物相容性和化學穩定性，層間存在可交換的陰離子，藥物分子可插層于層狀雙金屬氧化物的層間而形成藥物/層狀雙金屬氧化物雜化物[13，14]，從而使其成為一種極具潛力的藥物緩釋載體材料。許多研究表明，制備方法和條件對層狀雙金屬氧化物的形貌結構具有顯著影響[15，16]，從而影響其藥物負載能力。模板法是目前合成層狀雙金屬氧化物的最常見方法，利用植物提取液作為溶劑和分散劑，通過改變制備條件，可對層狀雙金屬氧化物的顆粒大小和藥物負載能力進行有效調控。

本文采用冬青提取液為軟模板合成鋁鋯復合氧化物，利用其作為新型緩釋材料，探討了其制備條件對蜂膠黃酮負載量的影響和緩釋效果。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

1.2 試驗儀器

主要儀器：KQ-100型超聲波清洗儀（北京東南儀誠實驗室設備有限公司）；TDL-5A型臺式離心機（金壇市宏華儀器廠）；HJ-6型六聯磁力攪拌器（江蘇省金壇市宏華儀器廠）；HY-3型恒溫振蕩器（江蘇省金壇市宏華儀器廠）；752S紫外可見分光光度計（上海棱光技術有限公司）。

2 試驗方法

2.1.蜂膠黃酮的制備

采用付英娟等人[17]的方法對蜂膠總黃酮進行提取：將0.2 g蜂膠和一定量的質量分數為80%的乙醇溶液加入到錐形瓶中，置于超聲波清洗儀中在功率540W下提取20 min，經離心分離后，濾渣重復超聲提取若干次，合并濾液，將濾液置于4℃冰箱中冷藏保存。

2.2 鋁鋯復合氧化物的制備

利用植物提取液為軟模板合成鋁鋯復合氧化物，主要步驟如下：將一定量的三氯化鋁、氯氧化鋯、納米海泡石和環糊精加入到盛有100 ml植物提取液的燒杯中，將其置于磁力攪拌器上連續攪拌2h，使溶液混合均勻。然后，利用1.0mol/L的氫氧化鈉溶液對其進行逐滴滴定，直至溶液的pH為9.5，繼續攪拌2 h后，將混合液置于80℃的烘箱中陳化24 h，過濾后，將濾渣于105℃干燥24 h，得到鋁鋯復合氧化物。通過改變金屬鹽種類、鋁鋯摩爾比、納米海泡石和環糊精加入量等反應條件制備系列鋁鋯復合氧化物。

2.3 蜂膠黃酮負載方法

將0.1g的鋁鋯復合氧化物加入到盛有100 ml濃度為85mg/L蜂膠黃酮的錐形瓶中，置于恒溫振蕩器上進行震蕩反應，待反應達到平衡后，過濾。以蘆丁為標準品，在亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉顯色體系中進行顯色反應，利用紫外可見分光光度計在510nm處測定濾液的吸光值，利用下式（1）計算蜂膠黃酮負載率：

采用ANSYS三維有限元計算軟件進行模擬計算分析。根據實例工程的特性及相關參數，網格選擇矩形網格，網格間距設置為5～20m，整個模型共有12856個節點與8266個網格（圖3）。

式中：R為蜂膠黃酮負載率；C0為蜂膠黃酮初始濃度；Ce為蜂膠黃酮平衡濃度。

2.4 響應曲面法優化鋁鋯復合氧化物的制備條件

依據Box-Behnken設計原理，選取鋁鋯摩爾比、海泡石投加量、環糊精濃度3個影響因素進行響應曲面分析，對鋁鋯復合氧化物的制備條件進行優化，以蜂膠黃酮負載率為評價指標，確定最優制備條件。實驗因素與水平設計見表1。

2.5 蜂膠黃酮釋放量的測定

表1 響應面分析因素及水平

首先，配制pH值為4.8的磷酸一檸檬酸緩沖溶液和pH值為7.2的磷酸緩沖溶液作為人工胃液和腸液。然后，將0.3g蜂膠黃酮/鋁鋯復合氧化物雜化材料加入到100ml的模擬胃液和腸液中，在37℃、100 r/min下進行恒溫震蕩，按照設定的時間間隔進行取樣,經0.45μm的濾膜過濾后,利用紫外——可見分光光度計在510 nm下測定其吸光度,計算蜂膠黃酮釋放量。每個實驗重復三次，結果取平均值。

3 結果與分析

3.1 制備條件對蜂膠黃酮負載率的影響

3.1.1 不同金屬氧化物對蜂膠黃酮負載率的影響

將0.001 mol的氯化鋁、氯氧化鋯、氯化鎂、氯化鐵、硫酸鋅、氯化錫、硝酸鈰分別加入到盛有100 ml冬青提取液的燒杯中，利用類似合成方法，得到氧化鋁、氧化鋯、氧化鎂、氧化鐵、氧化鋅、氧化錫、氧化鈰七種材料。由圖1可知，氧化錫對蜂膠黃酮的負載率最低為41.2%，氧化鐵、氧化鋅、氧化鎂和氧化鈰對蜂膠黃酮的負載率為50%左右，而氧化鋁和氧化鋯對蜂膠黃酮的負載率較高，分別為57.6%和60.6%。因此，在后續試驗中通過調整鋁鋯摩爾比來評價鋁鋯復合氧化物對蜂膠黃酮負載率的影響。

圖1 不同金屬氧化物對蜂膠黃酮負載率的影響

3.1.2 鋁鋯摩爾比對蜂膠黃酮負載率的影響

圖2 鋁鋯摩爾比對蜂膠黃酮負載率的影響

將總摩爾質量為0.001mol的氯化鋁和氯氧化鋯（其摩爾比分別為1∶1、1∶4、1∶8、4∶1、8∶1）依次加入到盛有100 ml冬青提取液的燒杯中，合成鋁鋯復合氧化物。由圖2可知，隨著鋁鋯摩爾比的增加，鋁鋯復合氧化物對蜂膠黃酮負載率呈現先降低后增加的趨勢，當鋁鋯摩爾比為4∶1時，該復合氧化物對蜂膠黃酮的負載率達到最大值70%，繼續增加鋁鋯摩爾比，蜂膠負載率基本趨于穩定。因此，選擇鋁鋯摩爾比為4∶1時制備該復合氧化物效果較好。

3.1.3 納米海泡石投加量對蜂膠黃酮負載率的影響

圖3 海泡石含量對蜂膠黃酮負載率的影響

將總摩爾質量為0.001mol的氯化鋁和氯氧化鋯（其摩爾比為4∶1）和不同質量的納米海泡石（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g）依次加入到盛有100 ml冬青提取液的燒杯中，采用類似方法合成鋁鋯復合氧化物。由圖3可知，當納米海泡石的投加量從0.02 g增加到0.08 g時，鋁鋯復合氧化物對蜂膠黃酮的負載率從48.8%迅速增加到68.8%。超過0.08 g后，繼續增加納米海泡石的用量，鋁鋯復合氧化物對蜂膠黃酮的負載率基本穩定。因此，選用0.08 g的納米海泡石進行鋁鋯復合氧化物的制備為宜。

3.1.4 環糊精濃度對蜂膠黃酮負載率的影響

圖4 環糊精含量對蜂膠黃酮負載率的影響

將總摩爾質量為0.001 mol的氯化鋁和氯氧化鋯（其摩爾比為4∶1）、0.08 g的納米海泡石和不同質量濃度的環糊精（0、100、200、400、600、800、1000 mg/L）依次加入到盛有100 ml冬青提取液的燒杯中，采用類似方法合成鋁鋯復合氧化物。由圖4可知，當環糊精濃度從0 mg/L增加到200 mg/L時，隨著環糊精濃度的增加，蜂膠黃酮的負載率從68.8%增加到80.6%;而當環糊精濃度超過200mg/L時，蜂膠黃酮的負載率增速較為緩慢，基本穩定在82%左右。因此，選取環糊精濃度為200mg/L進行鋁鋯復合氧化物的制備。

3.2 響應面分析

使用Design-Expert 7.0.0軟件對鋁鋯摩爾比、海泡石投加量、環糊精濃度3個影響因素設計三因素三水平共17個試驗響應面分析實驗，相應試驗數據見表2。

表2 響應中心組合試驗設計及結果

數據分析和顯著性檢驗見表3。

試驗數據經二次方程式的數學模型擬合后，得到鋁鋯復合氧化物的最佳制備條件的數學模型為：Y=+ 82.57-0.42X1-1.16X2+6.43X3-5.26X2X3-5.94X12-7.75 X22+11.02X32。由表3中的P＜0.01可以看出，其因變量和全體自變量之間的線性關系顯著，即這種試驗方法是可靠的。從各項方差的進一步檢驗來看，X3是影響鋁鋯復合氧化物制備的關鍵因子。X1和X2對試驗結果影響不太明顯。另外，方程的失擬項F=93.41，顯著，表明方程對試驗擬合情況好，實驗誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析和預測。回歸模型預測的最佳去除率的工藝條件是鋁鋯摩爾比為8∶1、海泡石投加量為0.08 g、環糊精濃度為400 mg/L，此條件下制備的鋁鋯復合氧化物對蜂膠黃酮的最大負載率為83.41%。

3.3 蜂膠黃酮的釋放率的測定

由圖5可知，經鋁鋯復合氧化物負載后，蜂膠黃酮在pH4.8（模擬胃液）和pH 7.2（模擬腸液）下的釋放率均隨反應時間的延長而逐漸增加，且在模擬胃液下的釋放效果更佳。整個釋放過程可分為三段：當反應時間小于120 min時，蜂膠黃酮在模擬胃液和腸液下的釋放率增幅較大；在120～480 min時，蜂膠黃酮在模擬胃液和腸液下的釋放率增幅較為緩慢，逐漸趨于穩定。超過480 min后，蜂膠黃酮釋放率基本穩定。因此，該復合氧化物對蜂膠黃酮的最大緩釋時間為480 min，在模擬胃液和腸液的最大釋放率分別為82.3%和75.7%。

表3 回歸方程的方差分析表

圖5 蜂膠黃酮在pH為4.8和pH為7.2下的釋放率曲線

4 結論

利用冬青提取液為軟模板合成的鋁鋯復合氧化物作為新型緩釋材料，對蜂膠黃酮進行負載和緩釋，試驗結果表明：（1）制備條件對蜂膠黃酮負載量有顯著影響，當向100ml冬青提取液中添加總摩爾質量為0.001 mol的氯化鋁和氯氧化鋯（摩爾比為8∶1）、0.08 g的納米海泡石、400 mg/L的環糊精時制備的鋁鋯復合氧化物對蜂膠黃酮的負載率達到最大值83.41%。（2）在模擬胃液和腸液下,該復合氧化物對蜂膠黃酮具有較好的緩釋效果，最大釋放時間為480 min。

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Preparation of propolis flavonoid/alumina-zirconium oxide composite and controlled-release properties

Zhao Chuanyi,Zhang Qingle,Xu Fusheng,Zhang Lingxiao,Wang Fugang,Wang Hao
(Institute of pharmaceutical,Taishan Medical university,Shan dong Tai'an,271016)

Taking alumina-zirconium composite oxide as a novel material to load propolis flavonoid,providing scientific basis for increasing its bioavailability.Methods:Alumina-zirconium oxide composite was prepared using plant extracts as soft template.Effect of preparation condition of alumina-zirconium oxide composite on propolis flavonoid loading rate was discussed by single factor experiment,and controlled-release properties of propolis flavonoid was analyzed by in vitro test.Results:Using Holly extracts as solvent,when the molar ratio of aluminum chloride and zirconium oxychloride was 8∶1,0.08 g sepiolite and 400mg/L cyclodextrin,the maximum loading ratio of propolis flavonoid on alumina-zirconium composite oxide was got at 83.41%.The maximum release time of propolis flavonoid/alumina-zirconium composite oxide in stimulated gastric juice and intestinal juice was 480 min.Conclusion:Alumina-zirconium oxide composite was suitable for the controlled-release material of propolis flavonoid.

Alumina-zirconium oxide composite;propolis flavonoids;holly extracts；controlled-release

國家大學生創新創業計劃項目(201510439076)，山東省自然科學基金（ZR2013HL062）

趙傳怡（1995-），山東萊蕪市人，2013級藥學專業本科學生

王浩，副教授，研究方向為中藥藥理學,E-mail:tywanghao@163.com。