氣相色譜法測定蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯的殘留

王祥云金銀銀汪志威張 倩王新全閔順根

（1中國農業大學理學院，北京100093；2省部共建國家重點實驗室培育基地“浙江省植物有害生物防控重點實驗室”，農業部農藥殘留檢測重點實驗室，浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，杭州310021）

氣相色譜法測定蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯的殘留

王祥云1，2金銀銀2汪志威2張 倩2王新全2閔順根1

（1中國農業大學理學院，北京100093；2省部共建國家重點實驗室培育基地“浙江省植物有害生物防控重點實驗室”，農業部農藥殘留檢測重點實驗室，浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，杭州310021）

氟胺氰菊酯屬于合成除蟲菊酯，是國內蜂業生產中使用最廣泛的殺螨劑，在蜂蜜和蜂王漿等蜂產品中潛在殘留風險。本文建立了蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯殘留測定方法。方法以正己烷+丙酮混合溶液提取蜂蜜和蜂王漿樣品中的氟胺氰菊酯殘留，經弗羅里硅土固相萃取柱凈化，以氣相色譜—電子捕獲檢測器檢測，外標法定量。試驗結果顯示，在5～100 μg/kg添加水平下，方法回收率在90.6～110%，相對標準偏差低于10%，滿足殘留分析方法的要求；蜂蜜和蜂王漿中的方法定量限分別為5 μg/kg和10 μg/kg，滿足國內外殘留限量的要求。

蜂蜜；蜂王漿；氟胺氰菊酯；氣相色譜帶電子捕獲檢測器

1 前言

蜂螨是蜂業生產中的頭號病蟲害，蜂農每年需進行1~3次藥物防治以確保蜂群的正常發展[1]。對于蜂螨的防治，世界各國科學家和從業者嘗試了各種措施，但效果最顯著、起效最快的仍為化學合成殺螨劑。目前蜂農使用化學殺螨劑主要為氟胺氰菊酯，氟胺氰菊酯對蜜蜂大蜂螨等寄生螨具有極好的防效，且對蜜蜂的毒性最低，因而在世界范圍內成為了應用最廣泛的蜂業殺螨劑[2]。

我國自20世紀90年代推廣使用新型氟胺氰菊酯殺螨制劑——“螨撲”[3]以來，蜂螨至今已對其產生了較大的抗藥性，迫使蜂農在使用時增加劑量和頻率，導致蜂蜜和蜂王漿產品中的氟胺氰菊酯殘留風險越來越高[2]。此外，近年來氟胺氰菊酯被發現具有一定的發育和生殖毒性，對消費者潛在一定的健康風險，歐盟更是將其列為內分泌干擾物[4]。為此，國內外各主管部門為確保消費者的蜂產品食用安全，紛紛建立了蜂蜜和蜂王漿中的最大殘留限量標準。其中，日本[5]、歐盟[6]分別規定了蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯殘留限量為0.05 mg/ kg；我國規定了蜂蜜中的最大殘留限量為0.05 mg/kg[7]，蜂王漿中尚無明確規定；美國僅規定了蜂蜜中的氟胺氰菊酯殘留限量為0.02 mg/kg[8]。

目前，蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯殘留量的儀器檢測方法較多[9]，包括氣相色譜法[10-15]、氣相色譜質譜法[16]、液相色譜法[17-19]和液相色譜串聯質譜法[20-21]等。然而，針對靈敏度最高、儀器保有量最大的氣相色譜電子捕獲檢測器的相關文獻和標準方法已稍顯陳舊，個別方法表現出溶劑用量大、使用含氯試劑等不足，本文擬建立基于氣相色譜電子捕獲檢測器，能同時滿足蜂蜜、蜂王漿乃至兩者混合物中的氟胺氰菊酯殘留量檢測的分析方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

GC 2010 Plus氣相色譜儀，配備電子捕獲檢測器和自動進樣器；渦旋儀；離心機；氮吹儀；旋轉蒸發儀；固相萃取裝置。弗羅里硅土柱（1 g，6 ml，天津博納艾杰爾科技有限公司）。氟胺氰菊酯標準溶液（1000 mg/L，中國農業科學院環境保護科研監測所），正己烷、丙酮均為分析純，購自華東醫藥有限公司。

2.2 試驗方法

2.2.1 試樣提取

準確稱取2 g蜂王漿或5 g蜂蜜（精確至0.01 g）至50 ml離心管中，加入10 ml水并渦旋10 s以溶解樣品，靜置1 min，加入20 ml正己烷-丙酮（1+1，V/V），渦旋震蕩提取1 min，7000 r/min離心3 min，取上清液于100 ml雞心瓶中，殘渣再加入20 ml正己烷-丙酮（1+1，V/V）渦旋提取一次，合并上清液，在旋轉蒸發儀上于300 Mpa、37℃濃縮至近干，氮氣吹干，待凈化。

2.2.2 試樣凈化

以5 ml正己烷進行淋洗活化弗羅里硅土柱，以9 ml正己烷分3次超聲雞心瓶，并依次轉移至萃取小柱上，棄去上述流出液，最后以10 ml正己烷+丙酮（95+ 5，V/V）洗脫目標化合物，收集于10 ml刻度管中，37℃水浴下氮吹干，以1 ml正己烷渦旋超聲定容后轉移至進樣小瓶，以氣相色譜質譜電子捕獲檢測器檢測，外標法定量。

2.2.3 儀器條件

色譜柱：VF-1MS(30 m×0.25 mm×0.25μm)石英毛細管柱；載氣：氮氣，純度≥99.999%；流速為1.0 ml/ min；進樣口溫度：280℃；檢測溫度：300℃；柱溫：溫度80℃，保持1min，30℃/min升至200℃，保持1min，隨后以10℃/min升至280℃保持6 min；進樣量：1μl；進樣方式：不分流進樣，1 min后打開分流閥。

3 結果與分析

3.1 檢測儀器的確定

關于氟胺氰菊酯的檢測，現有文獻及標準中所使用檢測儀器主要包括氣相色譜帶電子捕獲檢測器（GCECD）、氣相色譜質譜（GC-MS）、液相色譜帶紫外檢測器（LC-UVD）以及液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）等。

為評價各儀器對氟胺氰菊酯的檢測效果，試驗中分別配置了氟胺氰菊酯的系列標準溶液，其中GCECD和GC-MS采用正己烷稀釋，LC-UVD和LC-MS/ MS采用甲醇水溶液稀釋。試驗結果見表1。

表1 氟胺氰菊酯標準溶液在各儀器上的響應情況

表1中的結果表明，對于氟胺氰菊酯的測定，GCECD和LC-MS/MS具有更佳的靈敏度，線性范圍也足以滿足檢測工作的需求。但考慮到GC-ECD在各類實驗室配置比例更高，選其作為氟胺氰菊酯的檢測儀器，有助于提高方法的適用性。因此，最終本方法采用GCECD作為檢測儀器。

3.2 提取溶劑的選擇與優化

綜合《SN/T 2575-2010進出口蜂王漿中多種菊酯類農藥殘留量檢測方法》[14]、《農業部781號公告-9-2006蜂蜜中氟胺氰菊酯殘留量的測定氣相色譜法》[10]和《SN/T 0213.5-2002出口蜂蜜中氟胺氰菊酯殘留量檢驗方法液相色譜法》[17]等標準方法及《氣相色譜法測定蜂王漿中氟胺氰菊酯殘留量》[11]、《蜂王漿中氟胺氰菊酯與氟氯苯氰菊酯殘留的提取凈化及超高效液相色譜測定方法研究》[19]、《氣相色譜法同時檢測蜂蜜中溴螨酯、蠅毒磷、氟胺氰菊酯和氟氯苯氰菊酯殘留》[13]等相關文獻方法的結果表明，正己烷+丙酮（1+1，V/V）、正己烷+二氯甲烷（1+1，V/V）和乙腈是蜂蜜或蜂王漿中氟胺氰菊酯提取的常用溶劑。

試驗中，首先進行了提取液溶劑用量試驗。在蜂蜜和蜂王漿試樣中添加適量的氟胺氰菊酯標準溶液，獲得添加水平為50 μg/kg的待測樣品。隨后以3×20 ml提取液進行三階段提取，并各自進行后續的分析過程。試驗結果表明：三種提取液的結果基本一致。大部分氟胺氰菊酯被第一階段20 ml提取液有效提取，第二階段20 ml可將剩余氟胺氰菊酯完全提取，第三階段20 ml提取液中無氟胺氰菊酯殘留檢出。即2×20 ml提取液可將試樣中的可提取氟胺氰菊酯殘留完全提取。試驗隨即開展了上述溶劑對蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯提取效率的研究，試驗結果詳見表2。

表2 蜂蜜、蜂王漿中氟胺氰菊酯以不同提取液提取的回收率和變異系數（n=6）

結果顯示：對于蜂蜜而言，三種提取液均可得到良好的提取效果；對于蜂王漿而言，僅有正己烷+丙酮（1+ 1，V/V）能高效、穩定的提取蜂王漿中的氟胺氰菊酯，正己烷+二氯甲烷（1+1，V/V）和乙腈的提取效率均偏低，且乙腈作為提取液時發現提取效率以及穩定性都較差。其中蜂王漿試驗中正己烷+二氯甲烷（1+1，V/V）與乙腈的提取回收率偏低，可能源于提取過程中形成的膠狀體，剩余的氟胺氰菊酯殘留被膠狀體所包覆而無法完全提取。

3.3 凈化方式的選擇和優化

根據現有的文獻及標準方法，選用HLB（500 mg,6 ml,Waters）和弗羅里硅土（1 g,6 ml,Agela）固相萃取柱作為凈化萃取柱，并重點考察淋洗液種類及體積對樣品回收率及凈化效果的影響。

3.3.1 淋洗曲線

在經預淋洗的小柱上加入1 ml正己烷稀釋的氟胺氰菊酯標準溶液，分別以下列凈化方式開展淋洗曲線試驗。

凈化方式1：HLB柱，以正己烷+二氯甲烷（1+1，V/ V）洗脫；凈化方式2：弗羅里硅土柱，以正己烷+乙醚（9+1，V/V）洗脫；凈化方式3：弗羅里硅土柱，以正己烷+丙酮（9+1，V/V）洗脫；凈化方式4：弗羅里硅土柱，以正己烷+丙酮（95+5，V/V）洗脫；凈化方式5：弗羅里硅土柱，以正己烷+丙酮（98+2，V/V）洗脫。

結果顯示：凈化方式1～5分別需要2 ml、24 ml、10 ml、10 ml和20 ml洗脫液，考慮節約溶劑及實驗室時間的考慮，排除了凈化方式2和5，后續在凈化方式1、3和4的基礎上進行方法優化。

3.3.2 最佳比例洗脫液的確定

分別以凈化方式1、3和4做回收實驗，添加濃度為50 μg/kg，以考察其回收率，確定最佳比例洗脫液（結果見表3）。

表3 不同凈化方式的回收情況(n=3)

表4 方法回收率和精密度

根據表3的結果顯示，三種凈化方式的回收率和變異系數均在《GBT 27404-2008實驗室質量控制規范食品理化檢測》[22]附錄F要求范圍內，即均可滿足本法的的需求。考慮到凈化方式4的變異系數以及譜圖相對更為干凈，最終選擇正己烷-丙酮（95+5，V/V）作為洗脫液，洗脫體積為10 ml。

3.4 方法的線性范圍和靈敏度

以正己烷分別配置1.00 μg/L、2.00 μg/L、5.00 μg/ L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100 μg/L、200 μg/L和500 μg/L的系列標準工作液溶液，經氣相色譜電子捕獲檢測器檢測，結果表明，氟胺氰菊酯的儀器響應在10.0~500 μg/L范圍內呈線性，回歸方程為y=3291x-10612，相關系數（R2）為0.999。

實驗通過在樣品中添加系列濃度并進行回收測定的方式確定方法的檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。結果表明，在實驗條件下，本方法檢出限分別為蜂蜜中2 μg/kg、蜂王漿中4 μg/kg，方法定量限分別為蜂蜜中5 μg/kg、蜂王漿中10 μg/kg，結果見表4。

考慮到國內外蜂蜜和蜂王漿中氟胺氰菊酯的最大殘留限量分別為20~50 μg/kg和50 μg/kg，因此本方法的定量限足以滿足蜂蜜和蜂王漿在我國日常監管和國內外貿易中的需求。

3.5 方法的準確度和精密度

本方法以添加回收的方式考察了方法的準確度和精密度。在空白樣品稱取后，加入0.1 ml相應濃度的氟胺氰菊酯標準溶液，渦旋1min混勻，靜置半小時，使標準溶液被樣品充分吸收，然后按本方法進行檢測，試驗結果表明，蜂蜜的方法回收率90.6~95.7%，蜂王漿的方法回收率在95.9~110%，相對標準偏差均小于10%，準確度和精密度均達到殘留分析方法的要求，代表性圖譜見圖1。

圖1 蜂蜜和蜂王漿的空白和添加圖譜

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[3]農業科技通訊編輯部.新型高效殺蜂螨制劑-螨撲的試制與推廣[R].農業科技通訊.1997:33.

[4]歐盟委員會官網.內分泌干擾物研究優先列表.[查詢時間2016-09-17].

[5]日本肯定列表.農產品中氟胺氰菊酯限量 [OL].[查詢時間2016-09-17].

[6]歐盟食品安全委員會農藥殘留數據庫 [OL].[查詢時間2016-09-17].

[7]農業部235號公告.動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].

[8]美國政府出版辦公室.蜂蜜中氟胺氰菊酯限量 [OL].[查詢時間2016-09-17].

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The determination of Tau-fluvalinate residue in Honey and Royal jelly by Gas Chromatography

Wang Xiangyun1，2,Jin Yinyin2,Wang Zhiwei2,Zhang Qian2,Wang Xinquan2,Min Shungen1
(1 College of Science,China Agricultural University,Beijing 100094;2 State Key Lab Breeding Base for Zhejiang Sustainable Plant Pest Control;MOA Key Lab for Pesticide Residue Detection;Institute of Quality and Standard for A－gro-products,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences;Hangzhou 310021)

Tau-fluvalinate,an synthesized pyrethrin,was the most popular miticide in bee industry and then caused the residue risk in the honey and royal jelly.A method was developed to determine the residue of Tau╞fluvalinate in honey and royal jelly.The residue was extracted by n-hexane and acetone mixture,cleaned by a florisil column, detected by a gas chromatography with electron capture detector and calculated with external standards.At fortification levels 5~100 μg/kg,the recoveries ranged from 90.6~110%and the relative standard deviation was less than 10%.The quantitation limits of method were 5 μg/kg for honey and 10 μg/kg for royal jelly,which were sensitive enough compared to the MRLs set by governments around the world.

honey;royal jelly;tau-fluvalinate;gas chromatography with electron capture detector

浙江省自然科學基金（LQ14B070004）

王祥云（1983-），副研究員，博士研究生，從事農產品中農藥等污染物研究。

閔順耕（1963-），教授，博導，從事農產品營養品質與農藥殘留快速分析技術，minsg@263.net。