小兒哮喘患者血清中LncRNA BCYRN1的表達及臨床意義

馮明玉++韋平++倪瓊秀++楊玲蓉

[摘要]目的 探討LncRNA BCYRN1在小兒哮喘患者血清中的表達及對小兒哮喘病情及預后的影響。方法 選擇2012年1月～2015年12月于我院隨訪的120例穩定期哮喘患兒（間歇發作30例、輕度持續發作30例、中度持續發作30例、重度持續發作30例）和30例健康對照兒童的血清樣本，采用實時熒光定量PCR（QRT-PCR）檢測血清中LncRNA BCYRN1與炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表達水平，分析LncRNA BCYRN1的表達對患兒預后的影響及其與TNF-α、IL-4、IgE的表達的相關性。結果 LncRNA BCYRN1在哮喘患兒血清中的表達較健康對照兒童明顯增高，LncRNA BCYRN1表達隨轉歸加重呈升高趨勢，差異有統計學意義（P<0.05）。LncRNA BCYRN1隨轉歸加重呈升高趨勢，差異有統計學意義（P<0.05）。LncRNA BCYRN1的表達與炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表達成正相關（r=0.712、0.770、0.748，均P<0.001）。結論 LncRNA BCYRN1表達水平與小兒哮喘病情嚴重程度有關，可作為判斷預后的指標，對臨床小兒哮喘預后的判斷具有一定作用。

[關鍵詞]小兒哮喘；LncRNA BCYRN1；預后

[中圖分類號] R725.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（b）-0009-04

Expression and clinical significance of LncRNA BCYRN1 in serum of children with asthma

FENG Ming-yu1 WEI Ping1 NI Qiong-xiu1 YANG Ling-rong2▲

1.Department of Pediatrics，Shuangliu District Hospital of Traditional Chinese Medicine in Chengdu City，Sichuan Province，Chengdu 610200，China；2.Department of Pediatrics，the Third People′s Hospital of Sichuan，Chengdu 610000，China

[Abstract]Objective To investigate the expression of serum LncRNA BCYRN1 in children with asthma and the influence on the situation and prognosis.Methods Serum samples of 120 children with stable asthma from January 2012 to December 2015 in our hospital （including 30 cases of intermittent episodes，30 cases of mild sustained episodes，30 cases of moderate sustained episodes，30 cases of severe persistent episodes） and 30 cases of healthy children as health control were collected.The expression levels of LncRNA BCYRN1 and TNF-α，IL-4，IgE were detected by real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） and the effect of LncRNA BCYRN1 expression on the prognosis were also analyzed.Meanwhile，the relationship between serum LncRNABCYRN1 expression and inflammatory factors IgE，IL-4 and TNF-α were analyzed.Results The expression of LncRNA BCYRN1 in the serum of asthmatic children was significantly higher than that in the children of health control （P<0.05）.The expression level of LncRNA BCYRN1 increased gradually with the aggravation of the disease （P<0.05）.A positive correlation was also found between LncRNA BCYRN1 expression and inflammatory factors TNF-α，IL-4，IgE （r=0.712，0.770，0.748，all P<0.001）.Conclusion The expression of LncRNA BCYRN1 level associated with children asthma.LncRNA BCYRN1 can be as a predict biomarker of prognosis in children asthma.

[Key words]Children asthma；LncRNA BCYRN1；Prognosis

哮喘是兒童最為常見的慢性炎癥性疾病之一，主要以反復發作的氣道梗阻、支氣管高反應性、氣道炎性細胞浸潤為主，主要表現為反復發作性喘息、胸悶、咳嗽、胸部緊迫感和氣促等癥狀[1-2]。近年來，小兒哮喘的發病率逐年增加。美國報道其小兒哮喘及喘息癥狀的發病率高達9.4%（約為7百萬），每年哮喘相關的死亡達7000人[3]。香港13～14歲兒童哮喘發病率最高約為11.0%，北京地區高達10.7%，嚴重影響小兒的身心健康。其發病機制包括遺傳因素及環境中的變應原等[4]。目前雖然對于小兒哮喘防治有一些有效的治療措施，但哮喘發病率依然逐年升高，且哮喘發生的危險因素及其具體機制不清楚。近年來的研究表明，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNAs）在哮喘的發病過程中發揮著重要的作用[5]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，Lnc RNA）是長度在200個核苷酸以上的非編碼RNA。近年來的研究主要集中在LncRNA作為癌癥的生物標志物，研究發現LncRNA可以作為癌癥的早期篩選、診斷、預后評估生物標志物[6-7]。然而關于LncRNA在哮喘中的研究很少，LncRNA對這種不使用病理檢驗進行診斷的疾病，提供一種在體液中即可進行早期篩選的分子標志物將對哮喘疾病的診斷提供重要意義[8]。研究報道，LncRNA BCYRN1作為microRNA海綿影響支氣管平滑肌的功能[9]，然而關于LncRNA BCYRN1在哮喘患兒血清中的表達及與臨床預后的關系目前國內外尚未見相關報道。本研究將進一步檢測正常及哮喘患兒血清中LncRNA BCYRN1的表達，分析其與哮喘早期診斷及臨床預后評估的關系。

1對象與方法

1.1對象

選擇2012年1月～2015年12月于我院隨訪的120例穩定期哮喘患兒，其中男65例，女55例；平均年齡（8.3±3.7）歲；間歇發作30例[男性16例，女性14例，平均年齡（8.0±3.2）歲]，輕度持續發作30例[其中男性17例，女性13例，平均年齡（7.9±3.9）歲]，中度持續發作30例[男性18例，女性12例，平均年齡（8.0±4.0）歲]，重度持續發作30例[男性17例，女性13例，平均年齡（8.0±3.0）歲]。同時選擇30例健康兒童作為健康對照進行研究，其中男17例，女13例，平均年齡（8.0±4）歲。哮喘患兒與對照組兒童之間性別構成、年齡差異均無統計學意義（P>0.05）。間歇、輕度持續發作、中度持續發作及重度持續發作組患兒年齡、性別構成比之間差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。各組患兒及健康對照兒童之間均無其他基礎性疾病及合并癥。收集兒童血液標本進一步研究。本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有患兒的家屬均簽署了知情同意書。患兒其他情況無特殊。轉歸及隨訪治療2年以上患兒無哮喘發作視為完全緩解。未完全緩解者按照哮喘控制標準[10-11]歸類為好轉、持續和加重。采用電話及門診復診的方法進行隨訪，電話隨訪時間為3個月1次，1年隨訪4次。隨訪期間120例哮喘患兒中完全緩解28例，好轉42例，持續25例，加重25例。納入標準：①診斷均符合中華醫學會兒科學分會呼吸學組制定的支氣管哮喘防治常規診斷標準[12]。②實驗前2周內均未使用過茶堿、丙種球蛋白、糖皮質激素、色甘酸鈉、白三稀拮抗劑等免疫調節藥物。排除標準：①伴有其他心肺疾病患者、患有自身免疫性疾病史、腫瘤等惡性病史的患兒予以排除；②自身過敏及過敏性家族史的患兒予以排除。

1.2方法

1.2.1標本采集和處理 符合入選標準的患兒分別于首診時或治療前24 h內及經過3～6個月的控制治療后患兒清晨空腹肘靜脈血3～5 ml，4℃，3000 r/min，離心10 min，取上層血清。取到上層血清之后加入Trizol混勻后置于-80℃冰箱保存，以備提取RNA。

1.2.2采用雙抗夾心ELISA法測定炎性因子的表達 患兒均在入院的第2天清晨空腹抽靜脈血3 ml，置于4℃冰箱內約30 min，血液凝集后3000 r/min，離心15 min，分離血清，取血清，測定患兒的血清4℃水平，采用雙抗夾心ELISA法測定TNF-α、IL-4、IgE的表達，具體測定步驟均按照試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）提供的步驟進行。

1.2.3實時熒光定量PCR分析miRNAs的表達 根據Trizol試劑盒（Invitrogen公司，美國）提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒（Takala，大連寶生生物）和實時熒光定量PCR試劑盒（Takala，大連寶生生物）進行逆轉錄和PCR擴增。逆轉錄反應參照AMV逆轉錄試劑盒說明，在20 μl體系中加2 μg總RNA進行cDNA的合成。逆轉錄反應程序為：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 10 min。結束后立即將cDNA產物取出，置于-20℃冰箱備用。Real-time PCR采用2×SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA作為摸板，引物濃度0.4 μmol/L，15 μl體系進行擴增，每個待測樣本設置3個平行樣，PCR反應在ABI 7500實時定量PCR反應儀上進行，程序為（95℃，3 min）；40 cycles×（95℃ 12 s，62℃ 1 min）；95℃ 15 s。反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR定量時制作標準曲線等。3次獨立實驗后得到的數據運用公式2-△△Ct進行分析。

1.3統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗；非正態分布者組間比較采用Wilcoxon非參數秩和檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis非參數檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 LncRNA BCYRN1在不同哮喘狀態及健康對照兒童中的差異的表達

QRT-PCR檢測LncRNA BCYRN1在不同哮喘狀態患兒以及健康對照兒童血清中的表達，結果顯示LncRNA BCYRN1在健康對照兒童中的表達為1.007±0.034，較哮喘患兒中的表達明顯降低，LncRNA BCYRN1表達隨轉歸加重呈升高趨勢，LncRNA BCYRN1在間歇發作期、輕度持續發作、中度持續發作及中度持續發作期的表達分別為3.750±0.200、5.450±0.450、8.230±0.034、14.890±0.770，與健康對照比較差異有統計學意義（P<0.01）（圖1）。

2.2 LncRNA BCYRN1在不同轉歸患兒血清中的表達情況

QRT-PCR檢測LncRNA BCYRN1在不同轉歸患兒血清中的表達，結果提示隨訪2年期間120例哮喘患兒中完全緩解28例（其中男性15，女性13例），好轉42例（其中男性20，女性22例），持續25例（其中男性15，女性10例），加重25例（其中男性15，女性10例）。LncRNA BCYRN1隨轉歸加重呈升高趨勢，差異有統計學意義（P<0.05）（圖2）。

2.3 LncRNA BCYRN1的表達與炎性因子IgE、IL-4和TNF-α的相關性

哮喘患兒血清中LncRNA BCYRN1的表達與炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表達成正相關（r=0.712，P<0.001；r=0.770，P<0.001；r=0.748，P<0.001）（圖3）。

3討論

哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，其特征是反復發作性喘息、可逆的氣道梗阻和氣道重塑。哮喘發生的根本原因尚不明確，治療以對癥治療為主。哮喘發病機制涉及組織學、分子和基因變化及蛋白表達，近年來非編碼RNA（ncRNA）在哮喘病因學的研究中也逐漸受到重視，其可能為哮喘的病理研究和治療方法帶來根本性改變[13-15]。

LncRNA是真核細胞中的一類轉錄本長度超過200 nt的非編RNA，無蛋白編碼功能，在哺乳動物基因組中普遍被轉錄[16]。LncRNA曾被認為是轉錄過程中的副產物，不具有生物學功能。但目前越來越多的研究證實LncRNA具有重要的生物學功能，其在劑量補償效應、表觀遺傳調控、細胞分化和細胞周期調控等生命活動中發揮重要作用[17-18]。LncRNA具有多樣生物學功能：參與X染色體失活，調控mRNA降解，構成細胞核亞結構骨架，作為染色質重塑的調控因子等，并且與人類疾病的發生發展有密切關系[19-21]。研究表明LncRNAs具有多樣的生物學功能，其機制主要有染色質重塑、基因印記、細胞周期調控和翻譯調控等[22]，然而正因為LncRNAs作用機制的多樣性和復雜性，目前對于LncRNAs的作用機制的了解也只是冰山一角，對于其調控與被調控機制仍需要進一步的研究。目前的研究多集中在腫瘤方面，關于LncRNA與小兒哮喘的關系目前國內外報道尚少。本研究選擇2012年1月～2015年12月隨訪的120例穩定期哮喘患兒（間歇發作30例、輕度持續發作30例、中度持續發作30例、重度持續發作30例）和30例健康兒童作為對照進行研究。采集各組研究對象入組時及隨訪結束時的血清樣本采用實時熒光定量PCR檢測哮喘患兒及健康對照兒童血清中LncRNA BCYRN1的表達水平，分析LncRNA BCYRN1的表達對患兒預后的影響，重在探討小兒哮喘中LncRNA的炎癥調控機制。結果發現LncRNA BCYRN1在哮喘患兒血清中的表達較對照組明顯增高，LncRNA BCYRN1隨病情加重表達水平逐漸升高，LncRNA BCYRN1隨轉歸加重呈升高趨勢，LncRNA BCYRN1的表達與炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表達成正相關。

綜上所述，LncRNA BCYRN1表達水平與小兒哮喘病情有關，可作為判斷預后的指標，對臨床小兒哮喘預后的判斷具有一定作用。但由于本研究的臨床病例有限，關于LncRNA BCYRN1對小兒哮喘的影響尚需擴大樣本量及分子生物學實驗進一步研究。

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（收稿日期：2017-01-03 本文編輯：任 念）