高通量免疫組庫測序技術在血液系統腫瘤中的應用進展

沈鳳嬌++高清平++葉柏新

[摘要] 高通量免疫組庫測序技術是通過對B細胞受體（BCR）或者T細胞受體（TCR）的互補決定區（CDR）進行深度測序，借助相關數據分析方法，全面解析T或B細胞識別抗原的多樣性，從而衍生為一種從組學角度理解適應性免疫機制的研究方法，其在抗體研發、感染免疫、腫瘤免疫等領域有重要的應用價值。在惡性T或B淋巴細胞腫瘤表面表達單克隆TCR或BCR分子，利用高通量免疫組庫測序技術系統性分析TCR或BCR，發現特定的CDR基因序列，從而為T或B淋巴細胞腫瘤診斷、微小殘留病灶監測提供一種新方法，此外，高通量免疫組庫測序技術也為造血干細胞移植后免疫重建評估提供一種新的方法。本文就高通量免疫組庫測序技術在血液系統腫瘤中的應用作一綜述。

[關鍵詞] 免疫組庫測序技術；血液系統腫瘤；微小殘留病灶；造血干細胞移植

[中圖分類號] R733 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（b）-0030-05

[Abstract] High-throughput immune repertoire sequencing technology makes systemic analysis of the diversity of T or B cell recognizing antigen through deep-sequencing the complementarity determining regions （CDRs） of B cell receptor （BCR） or T cell receptor （TCR）， in virtue of related data analysis method， thus derived for a study method for understanding the immunity from the omics angle， which plays an important role in the areas of antibody discovery， infection and cancer immunity. Generally， T or B cell-malignancies originate from a single clone which expresses a TCR or BCR. High-throughput immune repertoire sequencing can be used to make systemic analysis of TCR or BCR， and identify the specific CDR sequence， thus to provide a novel method for the diagnosis of T or B cell malignancies and the monitor of minimal residue diseases. In addition， high-throughput immune repertoire sequencing technology also provides a novel method for the evaluation of immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation. This paper reviews the application of high-throughput immune repertoire sequencing in hematological malignancies.

[Key words] Immune repertoire sequencing technology； Hematological malignancy； Minimal residual disease； Hematopoietic stem cell transplantation

免疫組庫是指在任何特定的時間內，機體所有有功能的B細胞和T細胞的總和[1]。人體的適應性免疫系統主要依靠于T淋巴細胞和B淋巴細胞表面的T細胞受體（TCR）和B細胞受體（BCR）上的互補決定區（CDR）與MHC-抗原肽分子進行識別并特異性結合。由于人體基因組有限，不能編碼足夠數量的受體基因來對外界各種各樣的抗原產生免疫保護作用[2]，但編碼T細胞表面TCR上的CDR區VDJ基因發生重排，B細胞在接受抗原刺激后經歷VDJ基因重排、體細胞高頻突變、抗體類別的轉換，形成了TCR和BCR的多樣性[3]，這一方面形成了機體對外來多種抗原具有免疫性的結構基礎，另一方面也對系統及全面解析TCR及BCR庫產生了巨大的挑戰。惡性B或T淋巴腫瘤細胞表面表達單克隆性BCR或TCR受體，有研究表明對BCR或TCR進行測序可用于診斷B或T淋巴細胞惡性腫瘤及追蹤治療后效果[4]，因此利用免疫組庫測序技術分析機體免疫系統多樣性及疾病發生發展過程具有重要意義。近年來，利用高通量免疫組庫測序技術對BCR或TCR上的CDR3區重排基因序列進行深度測序，從而為T或B淋巴細胞白血病及淋巴瘤的診斷、微小殘留病灶的監測以及造血干細胞移植術后免疫系統重建評估提供了一種新的方法。

1 免疫組庫及免疫組庫測序技術

1.1 免疫組庫介紹

人體正常的免疫系統依賴于B細胞或T細胞表面BCR（TCR）對抗原特異性識別并結合。BCR是由兩條相同重鏈和兩條相同輕鏈構成[8]（圖1），Ig輕鏈和重鏈及其C區和V區分別由定位于不同染色體的多個不連續基因片段所編碼：C基因片段編碼恒定區；V基因片段編碼可變區，V區由3個互補決定區（CDR1、CDR2和CDR3）組成，CDR區基因組成和排列順序呈現高度多樣性，在同一個體內，這種多樣性可達109～1012，構成容量巨大的BCR庫。正是由于這種重大BCR庫才使機體對眾多外來異物有免疫性[5]。TCR包括TCRαβ和TCRγδ兩類，分別由α、β、γ、δ鏈組成，α和β鏈的V區包含3個互補決定區CDRs和4個框架區FRs，其中CDR區是細胞的高變區，與抗原特異性結合，CDR1、CDR2由V基因編碼，而CDR3由VDJ三個基因編碼，在免疫細胞成熟過程中VDJ基因發生重排從而形成了TCR多變性[6]。據理論上估計，TCRαβ受體在胸腺中超過1018，考慮到體細胞高頻突變，BCR受體更加多樣化[7]。正是由于BCR及TCR的多樣性，因此在正常免疫系統中，機體對外來多種抗原分子及腫瘤抗原產生免疫作用。而在惡性B或T淋巴細胞腫瘤中，通過對CDR3區基因序列的研究，可對疾病診斷、監測、預后具有重要意義。

1.2 免疫組庫測序技術發展

在20世紀90年代，免疫掃描譜型分析被用來對BCR和TCR進行研究[9]，Gorski利用免疫掃描譜型分析技術來分析TCRbeta鏈基因多樣性，并指出其多樣性與機體的免疫功能狀態相關。而利用B細胞或T細胞V-J基因配對組合，可測出CDR3的長度[10]，雖然價格相對便宜，但是對CDR3序列研究仍然相對模糊。隨后出現了Sanger測序是對編碼BCR或TCR上可變區的DNA片段進行測序，但測序的數量相對有限，制約了該技術的應用與推廣。流式免疫分析技術及CDR3掃描分析技術可將B細胞或T細胞分開，進而彌補了Sanger測序在數量上受限的不足，隨后研究通過有限稀釋方法，將單個B細胞抗體基因克隆并表達，研究特定抗體的特性和功能，進而分離疾病相關抗體，特別是分離出與病原體相關抗體[12]。而相比Sanger測序技術，以Roche454[13]、Illuminasolexa[14]為代表的二代高通量測序技術目前應用最廣，其主要依賴DNA模板PCR擴增，以增強熒光捕捉信號，利用二代高通量免疫組庫測序技術，可得到難以預測的深度、分辨度和精度，但二代測序技術需要逆轉錄及PCR擴增[15]。而隨后出現的以Helicos[16]單分子測序為代表的三代測序方法，是不需要進行PCR擴增，直接檢測單個堿基信號，相比于二代測序技術，三代測序技術準確率更高。這些免疫測序技術用于VDJ基因裝配和CDR識別，通過對基本數據的統計如：Highv-QUEUST[17]、免疫組庫對比分析、對CDR序列堿基片段插入、缺失分析，并將CDR序列翻譯成肽段，并構建免疫組庫表達譜，繪制V/J或者V/D/J表達的2D、3D圖譜[18]。

二代高通量測序技術具有較高的敏感性、特異性，并同時監測多個克隆基因序列的表達，其應用最廣，近年來利用高通量免疫組庫測序技術在血液系統腫瘤中應用取得了一些新的進展，從而為血液系統腫瘤診斷、監測提供了一種新的方法。此外，高通量免疫組庫測序技術也被應用于感染免疫、自身免疫性疾病[19]、抗體研發等方面。

2 免疫組庫測序技術在血液系統腫瘤中的應用

2.1 免疫組庫測序技術在血液系統腫瘤的診斷中的應用

血液系統腫瘤是由于基因發生突變引起的，在不同表型基礎上，基因發生已知或未知的突變，從而造成血液系統腫瘤的發生[20-22]。而利用高通量測序技術對B或T淋巴細胞CDR3基因序列進行深度測序，可對血液系統腫瘤進行診斷。急性B淋巴細胞白血病是一類來源原始幼稚B淋巴細胞的惡性克隆性疾病[23]，早前的研究[24]已經證實了在急性B淋巴細胞白血病患者中克隆性免疫球蛋白基因序列演變進展，B細胞在發生惡變后可能經歷了免疫球蛋白重鏈基因重排，在緩解期對克隆性免疫球蛋白重鏈重排基因序列的監測有助于對急性淋巴細胞白血病的診斷及藥效評估。Gawad等[25]利用高通量免疫組庫測序技術及IMGT數據分析技析，發現43例患兒克隆性免疫球蛋白重鏈基因發生重排，其中每例患兒克隆性免疫球蛋白基因序列表型從0到4024不等，也證實了克隆性免疫球蛋白重鏈基因重排序列為白血病患兒特定的克隆性基因序列，而這可能為白血病診斷以及微小殘留病灶的監測提供一種新的方法。Oki等[26]利用高通量免疫組庫測序技術對17例經典霍奇金淋巴瘤進行基因測序，在12例已經組織活檢確診為淋巴瘤的患者中找到了淋巴細胞特定的基因序列，而這些患者中11例可找到外周血樣本，其中的8例患者在外周血樣本中找到了腫瘤細胞特定的基因序列，這些數據也表明了利用高通量測序技術對腫瘤細胞特定的基因檢測的可行性，而且對未來霍奇金淋巴瘤的診斷及治療提供了一種新的方法。

2.2 免疫組庫測序技術在微小殘留病灶的監測中的應用

在急性淋巴細胞白血病中，微小殘留病灶作為公認的最好的獨立預后因素[27]，而起初定義微小殘留病灶是用它來評估治療效果，后來被用來監測腫瘤早期復發[28]。當前對急性淋巴細胞白血病的監測方法包括利用流式免疫方法對白血病異常免疫表型的監測，其敏感性高達0.01%，利用等位基因特異性寡核苷酸聚合酶鏈式反應（ASO-PCR）對免疫球蛋白及和TCR基因檢測，其敏感性高達0.001%[28]，雖然這些方法在臨床上證明可行，但是利用流式免疫技術及多重聚合酶鏈反應在白血病治療過程中監測不同白血病亞克隆發展有一定局限或者是不能檢測出，因而可能會導致錯誤的結果。而利用高通量免疫組庫測序技術對克隆性免疫球蛋白或TCR重排基因序列（白血病特定的基因序列）進行監測有助于急性淋巴細胞白血病微小殘留病灶診斷，Faham等[32]利用高通量免疫組庫測序技術對106例急性B淋巴白血病患者進行微小殘留病灶監測，實驗監測微小殘留病灶金標準是利用流式免疫細胞術和ASO-PCR技術，研究發現高通量測序技術檢測出微小殘留病灶的28例患者在利用流式免疫細胞術也證實為陽性，也發現了高通量測序技術檢測出的36例患者中利用ASO-PCR技術診斷35例陽性，在另外10例和3例患者中利用流式細胞術及ASO-PCR均未檢測出微小殘留病灶，而利用高通量免疫組庫測序技術卻檢測出，從而證明了免疫組庫測序技術對淋巴細胞惡性腫瘤的微小殘留病灶檢測具有高度敏感性及準確性。同時也有研究證明利用高通量免疫組庫測序技術可對急性T淋巴細胞白血病微小殘留病灶監測[33]。惡性B細胞表面的BCR分子充當細胞表面標志物，通過對外周血、骨髓中抗體組庫可變區基因序列研究，對腫瘤的早期診斷、病情發展以及復發均有重要意義。

2.3 免疫組庫測序技術在評價骨髓移植后免疫重建過程中的應用

造血干細胞移植是血液系統腫瘤最有效的治療方法，一方面移植后的骨髓造血干細胞能重建免疫功能，來抵抗異常的腫瘤細胞，另一方面移植后的T細胞能夠識別腫瘤相關抗原，并將這些異常的腫瘤細胞清除[34]。近年來，利用TCR或免疫球蛋白基因測序研究可用來評估造血干細胞移植術后T細胞和B細胞免疫重建狀況。van Heijst等[35]利用測序技術對28例造血干細胞移植術后的進行TCR多樣性監測，6個月后，對臍血移植受者TCR多樣性進行檢測，其多樣性接近于正常人，而T細胞耗盡的外周血造血干細胞移植患者CD4和CD8T細胞多樣性是較低時的28倍和14倍，一年后，移除T細胞患者的CD4T細胞TCR受體多樣性提高，但CD8T細胞多樣性并未提高，因此對造血干細胞移植后TCR的監測有助于評價患者移植后免疫重建情況，進而對移植后腫瘤復發及感染風險進行有效的監測。Logan等[36]利用高通量免疫組庫測序技術通過對移植后慢性粒細胞白血病患者外周血免疫球蛋白重鏈VJ重組基因序列研究發現在移植后56、180、365、550 d后，腫瘤惡性克隆基因表型數量越來越低，從而證明了利用高通量免疫組庫測序技術對造血干細胞移植術后免疫球蛋白重鏈基因測序分析可定量評估移植術后免疫系統重建，也證實了對免疫組庫多樣性定量評估對臨床上移植術后免疫組庫重建分析有重要的意義，這種免疫組庫重建與疾病預后、生存期、移植物抗宿主病及感染密切相關，因此利用高通量免疫組庫測序技術對血液系統腫瘤患者造血干細胞移植后免疫系統重建狀況進行有效的評估，從而對腫瘤的復發及感染等疾病具有重要的意義。

3 總結與展望

從傳統的流式細胞術、免疫掃描譜系分析技術再到高通量測序轉變，免疫組庫測序技術發生了革命性發展，隨著擴增技術、測序技術和數據分析技術不斷進步，免疫組庫測序技術將在血液系統腫瘤早期診斷、治療及評價中發揮越來越重要的作用，通過對TCR及BCR受體庫分析，從DNA分子水平對腫瘤發生發展進行解讀，進而能為腫瘤復發、微小殘留病、造血干細胞移植后免疫重建評估帶來了新的希望。但由于BCR和TCR重排復雜性和CD受體庫多樣性，高通量測序的深度及對龐大數據解讀和應用研究，會有很多難題，因此免疫組庫技術目前應用較少，還未用于臨床診療疾病。

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（收稿日期：2016-12-28 本文編輯：張瑜杰）