西南區應用的7個玉米骨干系與美國自交系的SSR標記分析

趙小敏， 柏光曉*， 任 洪，楊雯竹

(1.貴州大學 農學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省旱糧研究所，貴州 貴陽 550006；3.貴州省農作物種子總站，貴州 貴陽 5500012)

西南區應用的7個玉米骨干系與美國自交系的SSR標記分析

趙小敏1， 柏光曉1*， 任 洪2，楊雯竹3

(1.貴州大學 農學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省旱糧研究所，貴州 貴陽 550006；3.貴州省農作物種子總站，貴州 貴陽 5500012)

利用 41對玉米 SSR 引物對 49份美國玉米自交系和7份西南區骨干自交系進行遺傳多樣性分析，共檢測出169個等位基因有變異位點，每對引物檢測到等位基因2～10個，平均4.12個；每對SSR引物的多態信息量(PIC值)變化范圍為 0.299 ～0.885，平均值為 0.652。按UPGMA方法對供試自交系進行聚類，以遺傳距離0.572為基準，可將供試材料劃分為七類。56份自交系的SSR標記聚類分析表明，78%的美國自交系與西南區常用自交系之間也存在著較大的遺傳差異，被單獨聚為四類，而22%美國玉米自交系與西南區玉米自交系具有一定的同源性，被聚在第Ⅰ、Ⅳ和Ⅵ類。通過美國玉米種質和西南區應用種質的SSR標記分析，為加強西南區玉米育種材料的改良、創新和利用，以及品種選育提供參考。

西南區；美國玉米自交系；SSR 分子標記；聚類分析；改良利用

種質資源狹窄是當前我國玉米育種和生產的突出矛盾[1]。在過去五十多年里，我國玉米生產取得了很大進步，正逐步追趕世界先進水平，但與美國相比還有很大差距[2]。而西南區平均單產更是低于全國平均水平， 西南地區玉米育種缺乏優質、抗逆、高配合力和適應性廣的種質，已成為影響玉米商業育種進一步發展的“瓶頸”[3-6]。引進美國優異資源并加以改良、創新利用是解決種質資源狹窄的有效途徑，利用和導入外來種質，可以豐富玉米種質， 擴大遺傳基礎， 改進玉米的農藝性狀，尤其是機械化應用的性狀，拓寬適應性。

近年來，隨著玉米SSR引物的大量開發和應用，SSR標記技術已經被廣泛用于玉米種質遺傳多樣性的研究。Zheng等[7]利用SSR標記對中國和美國各18個自交系進行了遺傳多樣性分析以及雜種優勢類群劃分，發現25.5%和19.8%的等位基因在中國和美國的自交系中是特異的，并認為兩國的玉米自交系中存在著豐富的遺傳多樣性。遺傳多樣性分析為玉米種質資源保護和利用提供可靠的依據[8]，有利于育種材料的改良、創新和利用。

2012年國家玉米產業體系從美國農業部USDA-ARS引進160份解密的商業自交系，分發到全國各區域的綜合試驗點進行鑒定并對外開放考察。2014年，貴州大學玉米研究所從國家產業體系西南區的貴陽試驗點和遵義試驗點的田間開放材料地里，根據田間表現，選出表現較好的49份美國自交系。本研究利用SSR分子標記，對 49份美國玉米自交系和7份西南區應用的骨干自交系進行遺傳多樣性分析，對這些美國玉米自交系和西南區常用自交系進行比較分析，以期為加強西南區玉米育種材料的改良、創新和利用，以及品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

49份美國玉米自交系和西南區7個骨干自交系，各材料的名稱及系譜來源(見表1)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測 參考文獻[9]的 CTAB 法并加以改進。各取供試材料 20 粒種子于 25 ℃的恒溫培養箱中發苗至三葉一心期，每份自交系取 10 株同一心葉等量嫩葉混合，提取純化各個自交系的基因組 DNA。用紫外分光光度計(EV300，VSA)檢測DNA濃度和質量。用超純水將DNA樣品濃度稀釋至50 ng/μL，-20℃保存備用。

表1 56份自交系及其系譜來源Tab.1 The name and pedigree of 56 corn inbred lines

續表1

注：其中1-48和50為美國玉米自交系；49、51、52、53、54、55、56為西南區骨干自交系。

1.2.2 SSR引物的選擇 從180對SSR核心引物中，經初步篩選，確定多態性好且穩定的41對SSR核心引物。序列源自http：//www.Maizegdb.org，均勻覆蓋玉米全基因組，引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.2.3 SSR 分析 擴增反應在 DNA Engine 上進行。PCR 反應總體系為 10 μL組分配制(見表2)。反應液上加蓋一層石蠟油，以防止反應過程中水分蒸發，熱循環反應程序(見表3)。

反應產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。120 V恒壓電泳2 h后，進行固定，銀染，顯影和照相。

表2 PCR反應體系Tab.2 PCR system

表3 PCR擴增反應程序Tab.3 PCR thermo-cycle program

1.2.4 數據統計分析 SSR擴增產物以 0，1，9 統計建立數據庫，在相同的遷移位置上( 相同的分子量片段) 有帶記為 1，無帶記為 0，缺失記為 9。按 Nei 和Li[10]的方法計算自交系間的遺傳相似系數( GS) = 2Nij/ ( Ni+ Nj) 和遺傳距離( GD) = 1-GS。其中，Ni為 i 品種出現的譜帶數，Nj為 j 品種出現的譜帶數，按照 UPGMA 方法對各材料進行聚類作圖，數據處理由 NTSYS-P2.10e 軟件完成。

2 結果與分析

2.1 SSR分子標記遺傳分析

從均勻分別于染色體組的180對SSR引物中篩選出擴增條帶清晰穩定的41對引物(表4)。多數引物在供試自交系中擴增出兩條以上的條帶，如引物umc2293可檢測到10個等位基因變異，這可能與基因組內存在2個以上與引物結合的靶位點等因素有關。41對引物在56份供試材料上檢測出169個等位基因變異，每對引物檢測出2～ 10個等位基因，平均4.12個，片段大小介于100～ 600bp。41對引物位點的平均多態性信息量為0.661，變化范圍為0.299(umc2192)～0.885(umc2292)。圖1為引物umc2409在56個自交系中的擴增結果。

圖1 引物umc2409在56個玉米自交系中的擴增結果Fig.1 DNA fingerprints of 56 maize inbred lines using SSR primer umc2409

注：49、51、52、53、54、55、56號為西南區常用骨干自交系

表4 41對SSR引物在56份玉米自交系中 檢測到的等位基因數目及PIC值Tab.4 Alleles number and PIC of 56 maize inbred lines by 41 pairs of SSR

續表4

編號引物圖譜位置等位基因數信息量24umc20366.0120.42325dupssr136.0840.73126umc17417.0140.72627umc22107.0420.47728umc17287.0670.85429umc10338.0380.86430umc18678.0430.49831bnlg15838.0540.71832umc14948.0650.77833umc18588.0730.66134bnlg14519.0170.84535umc21759.0260.80036umc11969.0330.66737bnlg12039.0550.78438phi32315210.0530.62839bnlg39110.0140.71340bnlg117910.0530.56141umc139810.0730.617

2.2 SSR標記聚類分析

按UPGMA方法對供試自交系進行聚類，以遺傳距離0.572為基準，可較為清楚地按材料的特性將其劃分為七類(圖2)。Ⅰ類群包括PHK76、P200、1164、PH6WC、鄭58、WIL900、PHV07、PHW30、PHP55，為Reid種群，以西南區應用比較廣泛的3個自交系(鄭58、P200和1164)為代表。49個美國自交系中有12%聚在這一類群，與3個代表自交系間的相似系數變幅為0.5385～0.6746，平均為0.6017， 有較大的同源性；

第Ⅱ類群為Iodent

圖2 56份玉米自交系的UPGMA聚類圖Fig.2 56 UPGMA cluster map of Maize Inbred Lines

群，占37%，包括PHK42、PHJ89、LIBC4、S01250、J8606、BCC03、PHM10、PHW65、PHM49、PHP02、PHH93、PHJ90、PHJ31、PHM57、ICI740、LH213、LH212Ht、PHR58。Iodent群是先鋒公司獨有的重要雜種優勢類群，代表自交系為 PH207，它是當代美國最重要自交系的 7 個祖先種之一。第Ⅲ類群包括：PHV63、WIL500、PB80、912、PHW17、PHT55、2369、2FACC、LH195、PHR47、PHW52、FBLA、LH209、F118、ICI893、PHR55、PHW51，占35%，屬于衣阿華堅稈綜合種(BSSS)。衣阿華堅稈綜合種(BSSS)是衣阿華州立大學的George Sprague博士于 1932～1934 年人工合成的綜合群體，該綜合群體由 16 個自交系的互交群體組成，在第二輪選擇中又加入了 4 個自交系親本成分，總共含有 20 個自交系親本的血緣[11]。這些自交系血緣中多含有典型BSSS種B73的血緣，或者含有B73的衍生系，如含有LH195。B73是美國當代商業育種中重要玉米自交系，配合力高，應用十分廣泛。第Ⅳ類群包括：6M502、MBST、78551S、CS405、S909、S273和Y8201，其中S909和S273為蘇灣熱帶血緣，Y8201為巴西熱帶血緣，這三個自交系為西南區常用熱帶種質，因此，這一類群屬熱帶血緣。在這一類群中美國自交系與西南區常用熱帶種質間相似系數為0.5503～0.6450，平均0.5896。第Ⅴ群只有HB8299。Ⅵ類群為墨白熱帶血緣，包括MBUB和C171，兩者相似系數為0.645，同源性高；其中C171為墨西哥熱帶血緣。Ⅶ類群為LH65。其中HB8299和LH65分別單獨為一個類群，不能和其他自交系劃分到同一類群，說明這兩份材料與其他材料之間遺傳差異較大(見表5)。

3 結論與討論

3.1 結論

SSR分子標記能夠從本質上揭示玉米種質的遺傳規律[12]。本研究利用 41對 SSR分子標記對 56份自交系進行遺傳多樣性分析，每對引物檢測出 2 ～ 10個等位基因變異，平均為 4.12個； 每個位點的 PIC 變幅為 0.299 ～0.885，平值為 0.652。表明利用 SSR能夠較靈敏地檢測出供試自交系間的遺傳差異，結果高于楊留啟等[13](利用26 對SSR引物分析 13 個 o2 玉米自交系，平均等位基因變異 3.54 個，平均 PIC為 0.59) 和崔慶新等[14](利用 120 對SSR引物分析 10 個高油玉米自交系及其與 21 個屬于不同優勢類群普通玉米自交系間

表5 56 個玉米自交系 UPGMA 聚類結果Tab.5 Cluster results using UPGMA based on 41 SSRs among 56 maize inbred lines

的遺傳關系，平均等位基因變異3.56個，平均 PIC為 0.56) 的分析結果；低于韓萌[15](等利用23對SSR 引物分析101份貴州省玉米地方種質，平均等位基因變異11個，平均PIC為0.875) 的分析結果，原因與所選材料不同及引物的數量、種類有關。從實驗結果來看，56份供試自交系被分別分到了七個類群中，自交系SSR的聚類劃分與實際系譜基本一致，但有個別自交系存在一些差距，如：WIL500與WIL900屬于一個來源，卻被聚成了不同類群。這可能與系譜主觀性有關。由聚類結果可以看出，美國自交系間相似系數的范圍為0.369～0.9231，說明美國玉米種質存在較為廣泛的遺傳基礎。其中78%美國自交系與西南區自交系的遺傳基礎較遠，形成單獨的四個類群，因此，美國種質與西南區種質之間也存在著較大的遺傳差異。另一方面美國自交系中有22%與西南區應用廣泛的Reid和熱帶種具有一定的同源性，被聚在第Ⅰ、Ⅳ和Ⅵ類。

3.2 討論

瑞德×蘇灣雜種優勢利用模式是目前西南玉米育種區應用廣泛、成效顯著的一個優勢模式，已成功選育一大批優良的玉米雜交種在生產上推廣應用[16]。熱帶、亞熱帶種質具有豐富的遺傳變異性，子粒品質好、根系發達、持綠期長、抗多種病害，但也具有對光周期敏感、生育期較長、收獲時子粒含水量高等不良特性[17-20]。美國玉米種質具有莖稈堅韌、穗位低、耐密植、抗倒伏、籽粒含水量低和適應機械化等特點，可以將其與熱帶種質聚在同一類群，同源性較高的美國自交系作為非輪回親本對西南區常用的熱帶血緣系進行回交改良。也可以根據性狀特征和育種目標組成不同的群體，進行多次遺傳重組后作為父本群選系材料。同理，可用同種方法對西南區中Reid種群的代表自交系進行改良或遺傳重組，作為母本群選系材料。

隨著經濟的發展，勞動成本日益提高，土地流轉制度的改變和機械化應用于生產，西南區育種目標要由過去的高稈大穗改變為早熟耐密、抗逆性強、脫水快，收獲時子粒含水量低、便于機械化操作等特點。因此，引進美國種質并加以改良和利用顯得尤為重要，在考慮西南區的生態條件和地區的特殊性后，除了傳統的瑞德×蘇灣雜種優勢利用模式以外，我們還可以采用衣阿華堅稈綜合種(BSSS)×熱帶種質，或者用美國特有的Iodent群與西南區改良的瑞德進行組配，才能組配出高產，優質，多抗，適應性廣的組合。當然，不能完全依據分子標記結果來推斷玉米自交系間的雜種優勢，還應該結合自交系間的系譜、配合力以及田間表現來劃分合理的雜種優勢群，才能對自交系進行更適宜生產應用的改良和創新。

[1] 葉雨盛，宇文強，戴保威，等.地方種質資源在我國玉米育種中的應用[J].山地農業生物學報，2005，24(5):435-437.

[2] 張世煌.鄭單帶給我們的創新思路和發展機遇[J].玉米科學，2006，14(6)：4-6.

[3] 榮廷昭，李晚忱，潘光堂.新世紀初發展我國玉米遺傳育種科學技術的思考[J]. 玉米科學，2003(11)： 42-53 .

[4] 陳文俊.中國西南地區玉米生產和雜種優勢利用現狀及對策[J]. 玉米科學，2005，13(增刊)： 5-6.

[5] 楊克誠， 茍才明， 榮廷昭，等.西南地區玉米育種現狀及發展對策[J]. 玉米科學，2008， 16(3)： 8-11.

[6] 陳發波，楊克誠， 潘光堂， 等.西南及四川區試玉米組合主要性狀分析及育種對策探討[J]. 作物學報，2007，33(6)：991-998.

[7] Zheng DH，KyujungV，SukhaL .Molecular diversity and rela-tionship samonge lite maizeinbred from US and CIMMYT popu-lations and current the terotic groups in China[J].Hereditas，2008(145)：182-193.

[8] 孫友位，李明順，張德貴，等.利用 SSR 標記研究 85 個玉米自交系的遺傳多樣性[J]. 玉米科學，2007，15(6)：19-26.

[9] Saghai-Maroof M A，Soliman K M，Jorgensen R A，etal. W.Ribo-somal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inher-itance chromosomal location，and population dynamics[J]．Proceed-ingsoftheNationalAcademyofSciences，1984，81 ( 24 ) ： 8014 -8018．

[10] 8 Nei M，Li W H． Mathematical model for studying genetic variation i-tems of restriction endonucleases[J]．ProceedingsofNationalAcademofSciencesoftheUSA，1979(76)： 5269 - 5273．

[11] Hallauer A R， Russell W A， Smith O S. Quantitative analysis of iowastiff stalk synthetic[C].// In JP Gustafsen(ed) 15th Stadler Genet Symp Washington Univ， St Louis 12-16 June 1983 Univ. of Missouri AES，Columbia， 1983.

[12] 蘭琴英，陳澤輝，王安貴，等.優良玉米自交系 QB506 和 QR273及其改良系的遺傳多樣性分析[J].西南農業學報，2015，28(3)：967-973.

[13] 楊留啟，楊文鵬，王 偉，等．13 份 o2 玉米自交系的 SSR 標記遺傳多樣性分析[J].貴州農業科學，2011，39(3)：5-8.[14] 崔慶新，唐保軍，陳歡慶，等．利用 SSR 標記分析高油玉米與普通玉米自交系間的遺傳關系[J]．玉米科學，2011，19(3)：14 -18，24.

[15] 韓 萌，柏光曉.101份貴族玉米地方種質的SSR遺傳多樣性分析[J].山地農業生物學報，2012，31(1):5-8.

[16] 付 梅，任 洪，柏光曉.鐵7922改良效果及與蘇灣種質系的配合力研究[J]. 玉米科學， 2016，24(5)：1-7.

[17] 任 洪，鄭常祥，陳澤輝，等 . SUWAN 玉米種質的特點及在玉米育種中的利用[J] . 作物雜志，1998(增刊)：45-46 .[18] 陳澤輝，高 翔，祝云芳 . Suwan 與我國四大玉米種質的配合力和雜種優勢分析[J] . 玉米科學，2005，13(1)：5-9 .

[19] 沈建華，任 洪，徐如宏，等 . Suwan種質玉米自交系的配合力分析[J] . 貴州農業科學，2012，40(4)：14-16 .

[20] Sensern Jampatong， Chaba Jampatong. Genetic improvement of breeding materials in tropical and subtropical maize[J].Hereditas，2011， 33(12)： 1380-1392.

Analysis of SSR markers in seven southwest corn backbone inbred lines and 49 United States corn inbred lines

ZHAOXiao-min1，BAIGuang-xiao1，RENHong2，YANGWen-zhu3

(1.CollegeofAgricultural，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China; 2.GuizhouProvincialCropSeedrStation，Guiyang，Guizhou550001，China; 3.InstituteofUplandCrops，GuizhouAcademyofAgriculturalSciences，Guiyang，Guizhou550009，China)

41 SSR primers were applied to analyze genetic diversity in 49 U.S. corn inbred lines and 7 southwest backbone inbred lines. A total of 169 alleles were detected with an average of 4.12 per SSR primer pair， ranging from 2～10. The polymorphism information content (PIC) of SSR primers ranged from 0.299 to 0.885， with a mean of 0.652. According to the UPGMA method， the test inbred lines could be divided into seven groups by clustering with the genetic distance of 0.572 as the benchmark. Clustering analysis of SSR markers for 56 inbred lines showed that 78% of U.S. corn inbred lines and southwest backbone inbred lines had significant genetic differences， which were clustered into four groups. While 22% of U. S. corn inbred lines and southwest backbone inbred lines had certain homologous origin， which were clustered into three (Ⅰ， Ⅳ and Ⅵ) groups. Through the analysis of SSR marker of U.S. corn germplasm and southwest maize germplasm， the study can provide the reference for the improvement， innovation and utilization of maize breeding material in southwest China.

Southwest backbone inbred lines; U. S. corn inbred lines; SSR molecular marker; cluster analysis； use and improvement

2016-11-22；

2016-12-07

貴州省科技攻關項目[黔科合NY(2011)3014號]。

S513

A

1008-0457(2017)01-0024-06 國際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.01.004

*通訊作者：柏光曉(1962-)，女，教授，主要研究方向：玉米遺傳育種；E-mail： xiaobg06@163.com。