紅景天內生真菌發酵產物對肺癌細胞Huh7生長抑制情況的研究

李燕++鄧倩++李小清++馬洪鑫++李彥斌++劉俊林

摘 要：目的 初步研究紅景天內生真菌不同菌株發酵產物對肺癌細胞（Huh7）生長的抑制情況，篩選出其發酵產物對肺癌細胞（Huh7）的生長有較大抑制作用而對BHK細胞生長有較小抑制作用的紅景天內生真菌菌株并且得到其抑制率。方法 采用液體發酵法、萃取法、冷凍真空干燥法提取紅景天內生真菌發酵產物，采用MTT法研究紅景天內生真菌發酵產物對肺癌細胞、BHK細胞生長的抑制效果。結果 實驗初步找到4株紅景天內生真菌其發酵產物對肺癌細胞生長的抑制率達到或超過50%，3株紅景天內生真菌其發酵產物對BHK細胞生長的抑制率不超過10%。結論 紅景天內生真菌發酵產物對肺癌細胞有抑制作用，有待于我們更多次的實驗來驗證此結論，在驗證過程中需要做到更加規范的實驗操作以及避免實驗過程中造成的污染問題。

關鍵詞：紅景天 內生真菌 肺癌細胞 BHK細胞 MTT

中圖分類號：R28 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2017）02（b）-0249-02

肺癌是一種常見的癌癥，肺癌一般指的是肺臟實質部分的癌變，根據全國腫瘤登記中心2014發布的數據，我們可以知道我國肺癌死亡人數達到48.66萬[1]， 2012年，美國新增肺癌患者22.6萬左右，因為肺癌死亡人數為16.0萬左右，調查顯示，肺癌也將成為我國腫瘤死亡主要原因之一[2]。目前治療肺癌的醫療方法依然是通過外科手術切除早期肺癌腫瘤，通過放療、化療等手段進行治療也是重要手段，但是放療、化療、外科手術對患者造成的不良反應非常大，尋找新型的治療肺癌的天然藥物顯得非常重要。雖然現在已經有許多關于肺癌治療的天然藥物、特效藥物的研發報道，但是沒有哪一種藥物是非常有效且無不良反應的。對治療肺癌的新型天然藥物的探索依然有許多困難亟待人們去解決。

紅景天是景天科多年生草本植物，紅景天具有抗氧化、抗疲勞、抗缺氧、抗輻射的功效，中醫里紅景天被用來治療多種疾病[1]。近年來的研究證明，紅景天的有效成分具有保護心腦血管系統、調節免疫功能、治療腫瘤等作用[3]。該研究初步研究紅景天內生真菌菌株發酵產物對肺癌細胞（Huh7）增殖的抑制情況，以期為今后相關的研究提供一定參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）紅景天內生真菌菌株：西北民族大學生命科學與工程學院生物與制藥實驗室保藏。

（2）癌細胞（Huh7）：西北民族大學實驗中心保藏細胞。

（3）試劑：瓊脂：天津市光復精細化工研究所；乙酸乙酯：煙臺市雙雙化工有限公司；葡萄糖：天津市北辰方正試劑廠；胰酶：取自中國農業科學院蘭州獸醫研究所；細胞培養液：取自中國農業科學院蘭州獸醫研究所；胎牛血清：杭州四季清生物制品公司；MTT：Solarbio DMSO：VETEV。

1.2 方法

1.2.1 液體PDA培養基制作

新鮮去皮馬鈴薯200 g，切碎，加蒸餾水煮沸30 min，然后用8層紗布過濾兩遍，留下過濾液備用，往過濾液里加入葡萄糖20 g，再用蒸餾水定容至1 000 mL，最后高溫高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻待用[2]。

1.2.2 內生真菌發酵產物提取

將活化的真菌菌株接種到PDA液體培養基中，于恒溫搖床上150 r/min，28 ℃發酵7～14 d，終止發酵。用8層紗布過濾發酵物，發酵液用乙酸乙酯萃取3次，混合提取液，冷凍真空干燥后得到發酵產物[3-6]。

1.2.3 細胞培養與MTT測試

細胞傳代培養時用胰酶消化一定時間，加入培養液吹打混勻細胞，培養BHK細胞的培養液中加入新生牛血清10%，培養肺癌細胞的培養液中加入10%的胎牛血清，于CO2恒溫培養箱培養，培養24 h觀察1次。將濃度為1.0×104個/ mL細胞懸液，用微量加樣器接種到96孔細胞培養板，每孔200 ?L，接種24孔，置CO2培養箱培養。從培養第24 h開始，每24 h分別于超凈工作臺上吸出3孔的細胞進行計數，計算其平均值。以細胞濃度為縱坐標、細胞生長時間為橫坐標繪制生長曲線。

將紅景天不同菌株的發酵產物用細胞培養液配置成濃度為5 ug/mL的實驗組液待用。取對數生長期細胞，消化后，以1×105細胞密度加入96孔板中，每孔100 uL，培養10 h后，分別加入實驗組用液100 uL，對照組加等量培養液，每組設置3個復孔，培養48 h后每孔加5 mg/mL的MTT 20 uL，繼續培養4 h，棄上清，加入200 uL的DMSO，輕輕震蕩，用酶標儀在570 nm波長處測每孔OD值，計算平均值，并且按以下公式計算抑制率：抑制率=（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值×100%[5-10]結果取整數。

實驗將得到的12株真菌菌株的發酵產物都對肺癌細胞進行MTT實驗，篩選出對肺癌細胞有較大抑制作用的真菌菌株，再將這些真菌菌株的發酵產物對BHK細胞進行MTT實驗，篩選出對肺癌細胞有較大抑制作用而對BHK細胞生長抑制作用較小的紅景天內生真菌菌株。

2 結果與分析

由表1可知：菌株HJT-16-3、HJT-16-14、HJT-16-17、HJT-16-23的發酵產物對Huh7細胞的抑制活性均達到和超過50%；其余11株菌株的發酵產物對Huh7細胞都顯示有抑制作用，但是其抑制率不超過5%，筆者認為這可能是在加入測試藥液后因為培養液成分的突然改變引起細胞死亡，并不是因為藥液對細胞的生長有抑制作用；菌株HJT-16-8、HJT-16-17、HJT-16-32的發酵產物對BHK細胞的抑制作用小，不超過10%，其余菌株發酵產物對BHK細胞的抑制率較大，在68%～84%之間；所有菌株中，HJT-16-17對肺癌細胞（Huh7）的抑制率為75%，而對BHK細胞的抑制率僅為9%，為該研究所要尋找的目標菌株。

3 討論

肺癌嚴重影響人類生存質量，當今治療肺癌的有效方法依然是外科手術切除或者化學治療、物理放射治療，這些治療方法都會對機體產生不良反應，而且不一定能夠治愈。目前，尋找治療癌癥的靶向藥物和天然新型藥物為研究的熱點。該研究采用液體發酵、液相萃取、冷凍真空干燥、MTT實驗方法初步研究紅景天內生真菌發酵產物對肺癌細胞生長的影響情況并且篩選出能夠發酵產生對肺癌細胞生長有較好抑制作用的物質的菌株，研究的目的是為了尋找對肺癌細胞有抑制作用的藥用物質，同時考慮到藥用物質應該對正常細胞無較大危害，所以該研究同時選取BHK細胞為代表，測試了發酵產物對正常BHK細胞生長的影響。該研究找到一株符合研究目標的菌株HJT-16-17，其發酵產物對肺癌細胞（Huh7）的抑制率為75%，而對BHK細胞的抑制率為9%。

該研究所用的紅景天內生真菌保藏菌株是還沒有進行過分子鑒定的菌株，而且該研究沒有對所得到的發酵產物進行成分和結構分析，沒有對所得到的發酵產物抑制Huh7增殖的機制進行研究，這些問題將在接下來的研究中去完成。

參考文獻

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