小膠質細胞對缺血性腦卒中的雙重作用

范麗楨，陶文淵，張 曦，韓沁煜，徐 運

（南京大學醫學院附屬鼓樓醫院神經內科，江蘇南京 210008）

腦卒中是全球致殘和致死的最常見疾病，分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中占70%～80%。缺血性腦卒中可引發缺血級聯反應，最終導致神經元功能障礙和死亡［1］。缺血級聯反應通過破壞血腦屏障（blood brain barrier，BBB），促進腦免疫炎癥反應等引起卒中后腦損傷，并在亞急性期加重腦水腫和神經功能損害［2］，而這些早期的分子事件與慢性期的病情恢復和預后相關。缺血性腦卒中發生時，腦部損傷區域主要分成兩種，一種為核心梗死區域，細胞即刻凋亡并壞死，此為不可逆過程；另一種為缺血半暗帶，該區域細胞將要發生凋亡但尚可逆［3］，故有望通過逆轉缺血半暗帶細胞凋亡過程來治療缺血性腦卒中。

小膠質細胞是神經系統中參與免疫反應的重要細胞，在大腦中分布廣泛，占腦內膠質細胞總數的5%～20%［4］，分為M1型和M2型，M1型為經典激活型，主要表達CD80、CD86和主要組織相容性復合體Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ）等表面抗原，并可分泌白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等促炎因子，促進誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）合成，對神經元產生細胞毒性作用［5］。而M2型為替代激活型，主要表達Ym-1和CD206等表面抗原，并可分泌IL-10、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、IL-4、IL-3和胰島素樣生長因子-1（insulin like growth factor-1，IGF-1）等抗炎因子［6］，抑制炎癥反應，M2型小膠質細胞同時還能分泌各種神經營養因子，在大腦缺血低氧時起神經保護作用。M2型又分為M2a，M2b和M2c，M2a型主要參與細胞再生，而其他兩型主要參與吞噬和清除壞死組織［7］。將小膠質細胞分為M1型和M2型雖過于簡單，但這種分類方法有利于理解小膠質細胞在各種腦部疾病中的功能［8-9］。

1 缺血性腦卒中后小膠質細胞的活化

1.1 小膠質細胞的活化機制

當大腦受到缺血損傷的刺激時，小膠質細胞轉化為阿米巴狀，胞體變大，突起及分支增多，具有吞噬功能，并可吞噬血管內皮細胞［10］。這種形態改變被認為是一種高度激活狀態，代表著小膠質細胞對卒中免疫應答事件的啟動。引發小膠質細胞活化的因素十分廣泛，如脂多糖、ATP以及iNOS等，這些配體與細胞表面受體結合，激活小膠質細胞，并產生吞噬作用及一系列細胞因子，從而介導炎癥反應［11］。另外，某些配體還能改變小膠質細胞的分化方向。神經元可溶性Fas配體（Fas ligand，FasL）在缺血性腦損傷后促進小膠質細胞向M1型分化。動物實驗和細胞實驗同時證明可溶性FasL能誘導小膠質細胞向M1型分化［12］。當發生缺血性腦損傷后，FasL基因突變能減少動物模型募集外周炎性細胞，抑制小膠質細胞等固有膠質細胞的活化，抑制Jun氨基端K激酶（Jun N-terminal K-kinase，JNK）信號通路。阻斷FasL有望抑制小膠質細胞活化，并改善卒中患者的長期預后［13］。

目前研究較多的小膠質細胞活化受體是Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）家族。有研究顯示，缺血性腦卒中患者血漿TLR2和TLR4表達水平顯著增高，而TLR水平升高往往與不良預后密切相關［14］。應用TLR4抑制劑TAK-242可顯著減輕腦缺血動物模型神經功能缺損［15］。除此之外，其他TLR同樣參與了卒中后的炎癥反應。動物實驗表明，腦缺血再灌注后神經元和小膠質細胞TLR9表達水平顯著上調［16］。小膠質細胞也表達其他細胞因子受體，如TNF受體，而TNF受體激活會觸發NF-κB信號通路，促進小膠質細胞分泌TNF-α，并進一步活化小膠質細胞［17］。

當發生缺血性腦卒中時，損傷區域的小膠質細胞遷移至損傷處，并分化為M1型和M2型二大類型，M1型，分泌IL-1，IL-6，TNF-α和IFN-γ等促炎因子，促進炎癥反應對神經組織的損傷［5］；M2型分泌IL-10，TGF-β，IL-4，IL-3，TGF-β和IGF-1等抗炎因子，以及腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和神經生長因子（nerve growth factor，NGF）等營養因子［6］，抑制炎癥反應的同時，促進神經組織修復過程（圖1）。小膠質細胞的活化調控機制還有待進一步研究。

圖1 缺血性腦損傷中小膠質細胞的活化過程.IL：白細胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IFNγ：干擾素-γ；TGF-β：轉化生長因子β；BDNF：腦源性神經營養因子；NGF：神經生長因子.

1.2 小膠質細胞活化的時序性

小膠質細胞的活化在缺血性腦卒中的炎癥反應中是一個動態過程，并有一定的時序性。小膠質細胞的活化是炎癥反應的第一步，幾分鐘內即可發生，缺血后2～3 d內小膠質細胞的活化和增殖狀態將達到頂峰，隨后的幾周內持續下去［18］。相關研究顯示，發生缺血性腦卒中后，損傷區域內活化的小膠質細胞和巨噬細胞在早期主要表達M2信號基因，而在損傷后期它們主要表達M1信號基因。因此，小膠質細胞在卒中后不同時間內表現出不同的分化趨勢。在缺血性腦卒中急性期，小膠質細胞主要向M2型轉化，但在亞急性和慢性期，則主要向M1型轉化［19］，但具體的分化機制有待進一步研究。小膠質細胞在急性期參與炎癥反應對神經細胞的存活是有利的［20］，而在慢性期，由于小膠質細胞長期過度激活，引起慢性炎癥反應，會造成神經組織損傷，導致神經退行性疾病的發生以及認知障礙［21］。

1.3 小膠質細胞活化的異位性

缺血性腦卒中發生后，不同病變部位的小膠質細胞活化不盡相同。在核心梗死區域，24 h內若損傷區域獲得再灌注，小膠質細胞發生活化和表型改變，若24 h內未進行再灌注治療，活化的小膠質細胞很少，并表現出很強的吞噬作用［22］。而24 h后，M2型的表面抗原Ym-1和CD206表達增加，小膠質細胞參與損傷組織的修復過程［23］。當缺血性腦卒中情況惡化時，于72 h后小膠質細胞數量減少并開始發生破碎，動物實驗已驗證這一過程。利用化學誘導法建立持續性局灶腦缺血小鼠模型，7 d后小鼠的腦內核心梗死區域小膠質細胞發生崩解破碎，而此時缺血半暗帶的小膠質細胞數量增加［24］。在卒中發生后3～7 d內，缺血半暗帶的小膠質細胞數量逐漸增加，以CD68和MHCⅡ表面抗原陽性的小膠質細胞為主［25］。可見小膠質細胞干預療法治療缺血性腦卒中應考慮不同的腦損傷區域。

2 小膠質細胞對缺血性腦卒中的神經保護作用

2.1 小膠質細胞減輕炎癥反應和繼發性腦損傷

已有研究表明，小膠質細胞是腦內炎癥反應的重要調節器。選擇性消除大腦中動脈閉塞（middlecerebral artery occlusion，MCAO）小鼠的增殖狀態小膠質細胞，小鼠的腦梗死面積增加，且IGF-1等抗炎因子的水平降低［18］。Szalay等［26］通過快速體內雙光子活體鈣成像實驗發現，選擇性清除小膠質細胞會顯著增加梗死面積。另一項研究結果顯示，將培養的小膠質細胞移植入缺血損傷腦組織內可減輕缺血性腦損傷和增強神經修復的功能［27］。這些結果說明，小膠質細胞能減輕梗死區域的炎癥反應和組織損傷。

小膠質細胞對于缺血性腦卒中的神經保護作用主要依靠M2型小膠質細胞。M2型小膠質細胞可分泌神經營養因子，如BDNF，TGF-β和NGF［28］。研究表明，發生缺血性腦卒中后，小膠質細胞可通過分泌BDNF來發揮神經保護作用。BDNF主要通過絲裂原活化蛋白激酶通路及磷酯酰肌醇3激酶通路發揮作用［29］。BDNF通過增加神經元內的Ca2+結合蛋白的表達來抑制Ca2+內流，減少細胞內Ca2+濃度，抑制Ca2+超載和神經元凋亡，進而減輕腦水腫和縮小腦梗死體積。TGF-β是一種多功能細胞因子，有3種亞型，其中TGF-β1分布廣泛且可調控機體多種細胞的生長、分化、遷移、凋亡和細胞外基質生成。在生理狀態下，中樞神經系統（central nervous system，CNS）中TGF-β1含量較少，發生缺血性腦卒中后，TGF-β1顯著增加，既可促進微血管再生和神經組織重塑，也可通過抑制炎癥因子的釋放從而減輕CNS的炎癥反應，減輕腦水腫［30］。

2.2 小膠質細胞促進神經組織修復

研究表明，小膠質細胞對缺血性腦卒中后的神經保護作用不僅僅在于抑制炎癥反應和減輕腦組織損傷，同時也能刺激神經組織修復和缺血后神經元的再生。迄今為止，臨床治療只能通過減輕缺血性腦卒中后的腦損傷來改善預后，腦損傷的核心梗死區域凋亡的神經元雖無法修復，但缺血半暗帶的神經元尚可進行修復，還可挽救其神經元功能。

多項研究發現，大腦在廣泛的神經元死亡后能自行修復，而在腦卒中后也會出現代償性神經元修復［31-32］。一般認為，神經元多發生于海馬體的顆粒下層和側腦室周圍的室管膜下層［33］。當神經元大量損傷時，來源于顆粒下層和室管膜下層的神經母細胞需要遷移到損傷區域并不斷分化為有功能的神經元［34］。相關研究發現，腦卒中后，激活的小膠質細胞會伴隨神經母細胞共同遷移至損傷區域［35］，在腦卒中患者的缺血半暗帶區域發現新生的神經元和小膠質細胞［36］，動物實驗也得出類似的結果［37-38］。因此，小膠質細胞與神經元的神經交互作用可能在神經修復的過程中發揮了重要作用。體外模型同樣能觀察到小膠質細胞對神經元的保護作用，并確定了TGF-β2是參與神經保護的重要因子［20］。由此可見，小膠質細胞的遷移以及神經母細胞的交互作用是小膠質細胞發揮神經元保護作用的基礎，但具體機制尚未有明確定論。

此外，小膠質細胞還能維持受損區域的微環境穩態。M2型小膠質細胞表達特定的細胞表面因子，如精氨酸酶-1，CD206和Ym1，可阻止細胞質基質的降解［39］，在缺血性腦卒中小鼠模型中CD206和Ym1與腦組織修復有關［23］。研究發現，M2型小膠質細胞也可通過與Th2細胞的交互作用促進神經組織的修復。M2型小膠質細胞產生抗炎因子并可促進Th2細胞分泌IL-10和IL-13，為神經組織修復提供了微環境。與M1型小膠質細胞相比，M2型小膠質細胞具有更高的吞噬活性［39］，因此它可有效地消除細胞碎片，恢復受損組織內穩態，減輕炎癥反應，促進組織再生和修復以及細胞外基質的重建。Wake等［40］發現，在缺血期間，小膠質細胞突起與突觸的接觸時間更長，隨后其中一些突觸被清除，表明小膠質細胞能監測突觸的功能狀態，并可能有助于清除喪失功能的突觸。

3 小膠質細胞對缺血性腦卒中的神經損害作用

3.1 小膠質細胞促進炎癥反應和增強細胞毒性作用

經典激活的M1型小膠質細胞可分泌多種促炎因子，如IL-1，IL-6，TNF-α和IFN-γ等。其中，TNF-α在炎癥過程中發揮重要作用。在局部腦損傷區域，TNF-α主要由小膠質細胞分泌，是介導缺血低氧損傷的重要因子，能刺激中性粒細胞等炎癥細胞促進炎癥反應［41］。TNF-α主要通過以下3種途徑促進炎癥反應并增強細胞毒性作用：①激活JNK通路，使c-Jun的Ser63和Ser73末端磷酸化，促進c-myc和p53的活性，介導細胞凋亡。②促進內皮細胞和白細胞表面的黏附分子表達增高，加強內皮細胞和白細胞之間的黏附作用，導致血管通透性增強，加重腦水腫，同時細胞毒性因子更易進入，進一步加重損傷。③與p55和p75這2種TNF細胞表面受體（通常稱為TNFR1和TNFR2）發揮作用，TNFR1和TNFR2在神經元和小膠質細胞上均可表達，尤其是缺血性卒中發生后數小時內，兩者的表達增加。另外，藥物、中和抗體或可溶性受體可抑制TNF-α信號傳導，并可減少模型動物腦損傷體積［42］。

腦缺血時，小膠質細胞表面的嘌呤受體P2X7與積聚在細胞外的ATP結合，使小膠質細胞活化，并通過胱天蛋白酶1通路促進小膠質細胞分泌大量促炎因子IL-1β，導致更多神經細胞死亡［43］。死亡的神經細胞可釋放ATP，與P2Y12受體相互作用以誘導小膠質細胞活化，小膠質細胞可通過ATP的自分泌信號傳導進一步放大活化過程。這種正反饋環將增加IL-1β和TNF-α的表達［44］，并加劇炎癥反應。

3.2 小膠質細胞引起血腦屏障通透性改變

小膠質細胞也能釋放基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP），主要包括MMP-3和MMP-9兩種。MMP能降解多種細胞外蛋白并參與細胞外基質重塑，主要以非活性形式存在于細胞液中，并參與膠原蛋白的降解。當缺血性腦損傷發生時，MMP分泌增加，可引起CNS細胞外基質的降解，使BBB通透性增加，導致缺血性腦卒中后損傷加重［45］。相關研究發現，敲除小鼠MMP-3和MMP-9基因，并在急性期給予MMP抑制劑后，小鼠腦梗死面積減小，腦水腫程度減輕，神經功能損傷減輕［46］。最新研究表明，在缺血性腦卒中期間，小膠質細胞能活化組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，tPA）介導的血小板源性生長因子-CC，并提高BBB的通透性，增加腦損傷［47］。

3.3 小膠質細胞的遷移作用加劇神經元損傷

當發生缺血性腦損傷時，小膠質細胞受到缺血刺激活化并能遷移到腦損傷區域［48］。大腦和部分外周器官均能表達單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等趨化因子，并促進小膠質細胞和白細胞遷移到缺血區，從而誘發炎癥反應。凋亡神經元釋放的趨化因子CX3CL1和ATP，與小膠質細胞的表面受體結合誘導小膠質細胞遷移。此外，在大腦中動脈閉塞模型中，缺血部位的MCP-1表達水平升高，在2～3 d達到峰值。與此同時，缺血部位的小膠質細胞的表達水平也開始出現峰值，說明MCP-1在一定程度上可誘導小膠質細胞遷移［49］。MCP-1基因敲除小鼠的缺血性損傷較輕，說明缺乏MCP-1能減少小膠質細胞遷移至缺血部位，相應地減輕炎性損傷。

4 小膠質細胞干預治療缺血性腦卒中

使用tPA進行溶栓治療是迄今缺血性卒中唯一成功的治療方法，但存在治療時間窗（4.5 h）窄和安全性不穩定等問題［50］，僅有不到5%患者能接受溶栓治療［51］。目前尚無針對卒中后免疫應答的特定治療方法，小膠質細胞的雙重作用使其成為潛在的治療靶點。

4.1 作用于小膠質細胞的抗炎治療

目前，所有小膠質細胞激活的靶向藥物僅用于實驗研究或臨床前試驗。盡管其中一些已被用于治療自身免疫性疾病（例如TNF-α拮抗劑），但對于調節卒中后小膠質細胞活化的有效藥物的探索性研究仍處于起步階段。

實驗研究發現，腺苷酸活化蛋白激酶激活劑二甲雙胍可通過誘導小膠質細胞向M2分化來促進卒中小鼠功能恢復和組織修復［52］。二甲雙胍通過抑制NF-κB介導的炎癥信號傳導，使小膠質細胞/巨噬細胞向M2表型轉化。他汀類藥物是一類降膽固醇藥物，在缺血性卒中中具有抗炎和保護作用。辛伐他汀能以膽固醇依賴方式改變小膠質細胞因子（IL-1β和TNF-α）和BDNF的分泌。吲哚美辛是一種非甾體類抗炎藥物，可明顯減少小膠質細胞的活化數量，在卒中后7 d可促進神經母細胞增殖［53］。頭蛋白（noggin）是一種骨形態發生蛋白的內源性拮抗劑，可以預防缺血性腦損傷，這種作用可能與調節小膠質細胞M1/M2活化有關。它可降低M1標志物（IL-1β，TNF-α，IL-12，CCL2和CD86）的表達，導致小膠質細胞向M2分化［54］，使M2標志物（IL-1Ra，IL-10，Arg-1，CD206和Ym1）升高。IL-13基因免疫治療是在神經炎癥過程中調節小膠質細胞活化的潛在治療方法。在多發性硬化的小鼠模型中，慢病毒載體介導的IL-13調節小膠質細胞向M2表型分化［55］。

中藥在缺血性腦損傷中發揮有效的抗炎作用，并能在炎癥級聯期激活神經保護轉錄因子。穿心蓮內酯是來自穿心蓮的主要活性化合物，可防止腦梗死，可以改善24 h動物中動脈缺血模型的神經功能缺損。穿心蓮內酯通過抑制局部缺血區的小膠質細胞激活和小膠質細胞介導的IL-1β和TNF-α的表達而發揮神經保護作用［56］。葛根中分離的總異維生素可以顯著降低缺血2 h和再灌注48 h的腦梗死體積，小膠質細胞在刺激下轉化為M2型，并分泌各種細胞因子以修復缺血性損傷，其作用涉及小膠質細胞活化和抑制小膠質細胞介導的IL-1β在缺血皮質中的表達［57］。在中國草本植物坡壘中提取了一種天然抗氧化劑，稱為Malibatol A，能減少MCAO動物模型的腦梗塞面積并減輕腦缺血損害。并且，Malibatol A能降低M1型小膠質細胞標志物（CD86等）的表達，升高M2型標志物（CD206，Ym-1）的表達，還能促進PPAPγ核受體的激活，以此來抑制炎癥反應［58］。

4.2 細胞療法

目前尚缺乏有效的藥物來提高卒中后亞急性期和慢性期患者的生存率或改善生活質量，大量研究聚焦到細胞療法。使用M2型小膠質細胞療法可能是針對卒中的保護性治療策略，原因有三：首先，M2型小膠質細胞分泌保護性重構因子，從而通過組織（包括神經元）和血管重塑促進神經元網絡恢復；其次M2型小膠質細胞可通過BBB或脈絡叢遷移到局部損傷區域；第三，在適當的時機進行干預，M2型小膠質細胞可減輕炎癥誘導的繼發性腦損傷。

研究表明，慢性卒中患者接受髓鞘內注射自體骨髓單個核細治療后可明顯改善步態和手部功能，加速康復進程［59］。腦卒中患者接受鞘內注射21.9×106個自體M2小膠質細胞治療后，NIHSS評分在治療6個月后從11降至6，此外，患者體內IL-8，IL-10和IL-4水平升高，IL-1b，TNF-α，IFN-γ和IL-6水平降低。由此可見，腦卒中患者鞘內給予自體M2小膠質細胞治療是有一定療效的，但效果因人而異，往往與患者的自身免疫反應水平有關，內源性免疫抑制機制較差、促炎反應活躍的患者療效相對較好［60］。

5 結語

綜上所述，小膠質細胞的異常活化與缺血性腦卒中存在著緊密聯系，對缺血性腦卒中的發生發展具有雙重作用。主要表現在M1型通過增加促炎因子的釋放，產生細胞毒性作用，并可改變BBB，從而加重缺血腦組織神經損傷；而M2型則通過分泌抗炎及神經營養因子，從而起到了促進神經元修復和再生的作用。因此，調節小膠質細胞的功能性分化至關重要，這包括抑制小膠質細胞向M1型分化，誘導其向M2型分化，促進M1型向M2型逆轉等，不僅能減少M1型小膠質細胞對腦組織的免疫損傷，而且能增強M2型小膠質細胞的抗炎能力，促進神經元修復和再生，這可能成為臨床治療缺血性腦卒中的新策略和補充。然而缺血性腦卒中后小膠質細胞的活化和調控機制異常復雜，還需要更多的研究進一步明確兩者關系。

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