Notch通路對牙齦卟啉單胞菌脂多糖誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞表達(dá)RANKL/OPG的影響*

張馳 陳倩瑩 趙雅靜 高靂 趙川江

Notch通路對牙齦卟啉單胞菌脂多糖誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞表達(dá)RANKL/OPG的影響*

張馳 陳倩瑩 趙雅靜 高靂 趙川江

目的：探討牙齦卟啉單胞菌(Porphy romonas gingivalis，Pg)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodon tal ligam ent cells，hPDLCs)后Notch信號通路的表達(dá)及其對RANKL/OPG表達(dá)的影響。方法：酶消化法結(jié)合組織塊法原代培養(yǎng)hPDLCs，取第三代至第五代細(xì)胞給予0．1、1、10μg /m l Pg-LPS刺激72h，Real-time PCR檢測RANKL/OPG m RNA的表達(dá)，并選擇最佳誘導(dǎo)濃度1μg/m l組，采用Real-time PCR檢測Notch通路Notch1-2、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL-1以及Hey-1表達(dá)受體配體及目的基因表達(dá)。隨后，以γ-分泌酶抑制劑DAPT預(yù)處理hPDLCs 1h，予1μg /m l Pg-LPS刺激72h后，Real-tim e PCR、W estern-B loting檢測Notch通路目的基因Hey-1及RANKL/OPG m RNA、蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果：1μg/m l Pg-LPS可顯著上調(diào)hPDLCs RANKL、Notch通路受體Notch4、配體DLL-1、Jagged-1及目的基因Hey-1的表達(dá)(P＜0．05)；而對OPG、Nocth1-2、Jagged-2 m RNA水平表達(dá)無明顯影響(P＞0．05)。此外，γ-分泌酶抑制劑DAPT可抑制Pg-LPS誘導(dǎo)RANKL及Hey-1 mRNA及蛋白的表達(dá)上調(diào)，而僅對OPG m RNA表達(dá)有影響(P＜0．05)。結(jié)論：Notch信號通路參與調(diào)控Pg-LPS誘導(dǎo)的h PDLCs RANKL/OPG表達(dá)。

牙齦卟啉單胞菌;脂多糖；RANKL/OPG; Notch通路

牙周炎是一種慢性感染性疾病，在老年人群具有很高的發(fā)病率，嚴(yán)重影響老年人的口腔和全身健康。牙菌斑生物膜是牙周炎的始動因子，其主要病理特征為牙槽骨破壞吸收等[1]。骨代謝相關(guān)蛋白核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand ，RANKL)是與骨吸收密切相關(guān)的破骨因子，在牙周炎癥反應(yīng)中發(fā)揮誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的作用[2],多種原因可導(dǎo)致牙周組織中RANKL水平發(fā)生變化[3]。脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)是牙周炎主要致病菌牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)最重要的致病因子，可促進(jìn)淋巴細(xì)胞炎癥因子分泌上調(diào)，激活破骨因子表達(dá)，導(dǎo)致牙槽骨破壞吸收[4,5]。有文獻(xiàn)報道：Pg-LPS可上調(diào)牙周膜細(xì)胞、成骨細(xì)胞RANKL的表達(dá)[6]，但是其調(diào)控機(jī)制尚未明確。近期研究發(fā)現(xiàn)，Notch通路參與調(diào)控RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成過程[7],但Notch通路是否在Pg-LPS誘導(dǎo)的牙周炎癥破骨免疫中發(fā)揮作用仍缺乏報道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬檢測Pg-LPS作用于hPDLCs后Notch通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，并進(jìn)一步分析該通路對Pg-LPS誘導(dǎo)hPDLCs RANKL/OPG表達(dá)的影響，以初步探討Notch通路在牙周炎癥性骨破壞中作用的相關(guān)機(jī)制。

1．材料和方法

1．1 主要材料、試劑和儀器胎牛血清(Gibco，USA)；胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗(Sigma，USA)；α-MEM培養(yǎng)基、I型膠原酶(Gibco，USA)；Pg-LPS (Invivogen，USA); DAPT(Sigm a，USA)；Trizol(Invitrogen，USA)；PCR引物(Life Technologies，USA)；Hey-1單克隆抗體(Abcam，UK)、RANKL單克隆抗體(San ta-Cruz，USA)、OPG單克隆抗體(Abcam，UK)；抗細(xì)胞角蛋白單克隆抗體，抗波形絲蛋白單克隆抗體(武漢博士德生物公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，Japan)；多功能酶標(biāo)儀(Tecan，UK);NanoDrop-2000微量紫外分光光度計(jì)(Therm o，USA)；Ligh t Cycler R○ 480 SYBR Green I MasteLigh t Cycler R○ 480 PCR 儀Roche，Sw iss)。

1．2 人牙周膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)選擇中山大學(xué)附屬口腔外科門診因正畸治療拔出的健康雙尖牙或智齒，所選牙無齲壞、無根尖周病及牙周炎，患者近三個月內(nèi)未使用抗生素，無糖尿病史，吸煙史。年齡為12-25歲，且征得患者本人及家屬同意。該實(shí)驗(yàn)已通過中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會審核批鑒：口腔[2015]倫審第(13)號。將外科門診收取的離體牙用含雙抗的PBS反復(fù)沖洗，采用刀片刮取根中1/3部位的牙周膜組織于含有3mg/m l的I型膠原酶中，消化30m in，10%含F(xiàn)BS α-MEM培養(yǎng)基終止消化，將懸液接種于含20%FBS，2%青鏈霉素雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中，過夜翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞爬滿瓶底約70%，棄培養(yǎng)基，0．25%胰蛋白酶消化，傳代，取第三代至第五代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1．3 免疫組織化學(xué)染色法鑒定取第三代hPDLCs，以2×104/m l接種于12孔板，取爬片置于12孔板中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。細(xì)胞融合率達(dá)50%棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定20m in，PBS漂洗三次，0．1%Triton-X100室溫通透，3%過氧化氫孵育，5%BSA封閉30m in后，分別滴加1∶100稀釋的一抗Vim itin和CK,陰性對照滴加PBS，濕盒4℃過夜。PBS振洗后加入二抗，DBA顯色，樹膠封片，拍照。

1．4 實(shí)驗(yàn)分組

1．4．1 濃度梯度實(shí)驗(yàn)分組(1)空白對照組：只加α-MEM培養(yǎng)基；(2)0．1μg/m l Pg-LPS組；(3)1μg/m l Pg-LPS組；(4)10μg/m l Pg-LPS組。

1．4．2 阻斷實(shí)驗(yàn)分組(1)空白對照組：只加α-MEM培養(yǎng)基；(2)Pg-LPS組：予1μg/m l Pg-LPS刺激hPDLCs；(3)DAPT阻斷組：10μM Notch 通路阻斷劑DAPT預(yù)處理hPDLCs1h，隨后加入1μg/m l Pg-LPS刺激hPDLCs。

1．5 細(xì)胞處理及培養(yǎng)取第三代至第五代hPDLCs以5×104/m l密度接種于6孔板中，待24h貼壁完全后換液，按照分組給予刺激，于5% CO2，37℃飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞72h。

1．6 Real-time PCR檢測使用Trizol法提取總RNA，以Nanodrop2000微量紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度。采用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。委托廣州英濰捷基生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)、合成引物。引物見表1。根據(jù)羅氏Ligh t Cycler480 SYBR Green I M aster試劑盒說明書，采用20μl反應(yīng)體系: DEPC水6μL、2μL cDNA模板、2μL 3R+5F、10μL SYBR Green I。反應(yīng)條件如下：激活酶活性：95℃5m in；變性：95℃10s；退火：60℃20s；延伸：72℃20s，循環(huán)40次；溶解曲線：95℃5s，65℃1m in，97℃。

表1 合成引物序列

1．7 W estern blot 檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)RIPA裂解液提取蛋白，BCA法檢測各組蛋白濃度，上樣質(zhì)量40μg, 10%SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂牛奶常溫封閉1h，根據(jù)分子量大小剪膜，搖床孵育一定稀釋度一抗4℃過夜，TBST洗膜，孵育二抗室溫1h，TBST洗膜后ECL發(fā)光檢測，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間在方差齊性的基礎(chǔ)上使用單因素方差分析, 最小顯著差法(least significant difference，LSD)進(jìn)行組內(nèi)兩兩比較，P＜0．05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，運(yùn)用Graphpad Prism 6．0軟件制圖。

2．結(jié)果

2．1 人牙周膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定倒置顯微鏡下觀察：原代細(xì)胞培養(yǎng)約一周左右, 可見細(xì)胞由組織塊中爬出。傳代后細(xì)胞生長旺盛，狀態(tài)良好，細(xì)胞呈現(xiàn)典型星形或梭形，胞體豐滿，胞漿均勻，細(xì)胞核呈圓形或者軟圓形，具有成纖維細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定顯示：細(xì)胞抗波形絲蛋白染色陽性，細(xì)胞漿呈棕黃色；抗角蛋白染色陰性，細(xì)胞漿不著色。證實(shí)細(xì)胞來源于中胚層的成纖維樣細(xì)胞。

圖1 倒置顯微鏡下h PDLCs形態(tài)及免疫組化染色圖像

2．2 不同濃度Pg-LPS對hPDLCs RANKL/ OPGmRNA表達(dá)的影響0．1、1、10μg/m l Pg-LPS均可上調(diào)hPDLCs RANKLmRNA的表達(dá)。1、10μg/m l濃度組RANKLm RNA顯著上調(diào)，且1μg/m l組RANKLmRNA上調(diào)最明顯(P＜0．05);而0．1μg/m l組與對照組無顯著差異(P＞0．05)。表明Pg-LPS具有上調(diào)RANKLmRNA表達(dá)的作用，且刺激濃度為1μg/m l時上調(diào)作用最明顯。對于OPGmRNA的表達(dá)水平，0．1、1μg/m l兩濃度組與對照組比較無明顯差異(P＞0．05)，10μg/m l Pg-LPS可顯著下調(diào)OPGm RNA水平(P＜0．05)。

圖2 0、0．1、1、10μg/m l Pg-LPS刺激hPDLCs對RANKLm RNA及OPGmRNA的表達(dá)影響

2．3 Pg-LPS作用hPDLCs后Notch通路相關(guān)受體、配體及靶基因的表達(dá)Real-time PCR結(jié)果顯示，Notch通路受體Notch4、配體Dll-1、Jagged-1以及靶基因Hey-1表達(dá)相較于對照組均顯著上調(diào)(P＜0．05)，而Notch1、Notch2、Jagged-2的表達(dá)無明顯改變(P＞0．05)。

2．4 DAPT阻斷劑對Pg-LPS調(diào)控RANKL/ OPG的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，10μM DAPT預(yù)處理hPDLCs后，Hey-1 mRNA及RANKL mRNA的表達(dá)顯著下降(P＜0．05)，而OPGm RNA的表達(dá)上調(diào)(P＜0．05)。

圖3 1μg/m lPg-LPS作用h PDLCs對Notch信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

圖4 DAPT阻斷Notch通路后對Pg-LPS誘導(dǎo)RANKL/OPG及Hey-1的作用影響

Western blot結(jié)果顯示，Pg-LPS刺激可顯著上調(diào)RANKL、Hey-1蛋白的表達(dá)水平(P＜0．05)，而OPG蛋白表達(dá)水平雖稍有降低，但與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)。DAPT預(yù)處理hPDLCs 1h后，RANKL及Hey-1的蛋白水平表達(dá)均顯著下調(diào)(P＜0．05)；而OPG蛋白表達(dá)水平有所上調(diào)，但與Pg-LPS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)。

圖5 DAPT阻斷Notch通路對Pg-LPS調(diào)控RANKL/OPG蛋白表達(dá)及Hey-1的影響

3．討論

牙齦卟啉單胞菌是牙周炎主要致病菌，脂多糖是其最主要的毒力因子，可刺激RANKL表達(dá)上調(diào)，參與牙槽骨破壞[6]。RANKL是腫瘤壞死因子超家族的成員，可與受體RANK結(jié)合，促進(jìn)破骨前體細(xì)胞分化成熟，激活骨吸收。而溶性誘騙受體骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG )可競爭性結(jié)合RANKL以阻斷RANKL-RANK通路，抑制RANKL所介導(dǎo)的破骨作用，起到骨保護(hù)作用[2]。現(xiàn)已明確：在牙周組織中RANKL主要表達(dá)在成骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞中，而在牙周膜成纖維細(xì)胞、牙齦成纖維細(xì)胞中也有表達(dá)。牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周膜的主要成分，在牙周炎癥環(huán)境下具有破骨向分化的能力，對于維持牙周組織骨平衡、調(diào)控牙周炎發(fā)生發(fā)展的過程中有重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇hPDLCs作為研究對象，在體外使用Pg-LPS加以刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0．1、1μg/m l Pg-LPS可上調(diào)RANKL的表達(dá)，且呈濃度依賴形式，但對OPG表達(dá)的刺激作用不明顯。上述結(jié)果一方面進(jìn)一步證實(shí)了hPDLCs是牙周炎癥環(huán)境中RANKL的重要來源細(xì)胞之一，另一方面也表明Pg-LPS可改變hPDLCs表達(dá)RANKL/OPG的比率，干擾RANKL/OPG的平衡，從而在牙周炎癥性破骨免疫中發(fā)揮一定的作用。此外，本實(shí)驗(yàn)中10μg/m l Pg-LPS作用于hPDLCs后RANKL和OPG mRNA表達(dá)較1μg/m l明顯下調(diào)，這與李新月等[8]研究結(jié)果存在差異。分析其原因一方面可能與實(shí)驗(yàn)使用培養(yǎng)基不同，以及h PDLCs來源不同存在遺傳異質(zhì)性有關(guān)；另一方面可能是由于高濃度Pg-LPS對hPDLCs有一定的毒性作用，對細(xì)胞增殖存在抑制。因此，高濃度Pg-LPS對hPDLCs RANKL/OPG表達(dá)的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)相關(guān)報道，本實(shí)驗(yàn)使用1μg/m l Pg-LPS作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)濃度。

Notch信號是由一系列蛋白分子組成，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)四種同源性受體(Notch1-4)和五種配體Jagged-1、Jagged-2、Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4。該通路通過γ-分泌酶(γ-secretase)切割釋放Notch的胞內(nèi)活性片段N ICD(The in tracellu lar dom ain of Notch)直接入胞核，結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄因子RBP-J促進(jìn)靶基因Hes-1和Hey-1的表達(dá)，激活下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。在與牙周炎具有相似病理病因的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Notch1、Jagged-1以及DLL-1明顯上調(diào)[9]。體外實(shí)驗(yàn)中，Tsao等[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞依賴JNK信號通路高表達(dá)Notch1、DLL-4、Jagged-1。此外，研究表明Pg-LPS可促進(jìn)前成骨細(xì)胞Notch1、Hey-1的表達(dá)上調(diào)參與阻斷細(xì)胞成骨過程[11]。為進(jìn)一步探索牙周致病菌作用下Notch通路是否被激活，本實(shí)驗(yàn)使用1μg/m l Pg-LPS刺激hPDLCs，發(fā)現(xiàn)Notch通路目的基因Hey-1在蛋白水平及基因水平表達(dá)均上調(diào)，提示Pg-LPS刺激hPDLCs后Notch信號被激活。現(xiàn)已知Notch通路在促進(jìn)破骨生成作用過程中依賴于配體受體間的相互作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞、大鼠巨噬細(xì)胞主要上調(diào)Notch1、Notch2不同，經(jīng)Pg-LPS刺激誘導(dǎo)的hPDLCs上調(diào)Notch4最顯著，而Notch1、Notch2上調(diào)作用不明顯。同時，Notch通路配體DLL-1、Jagged-1也表達(dá)上調(diào)，而Jagged-2表達(dá)無明顯改變。Sekine等[12]報道：在破骨前體細(xì)胞中DLL1/Notch2具有促進(jìn)破骨生成作用，而Jagged-1/Notch1可抑制破骨前體細(xì)胞破骨向生成，且DLL1/Notch2的正向破骨調(diào)控作用占主導(dǎo)地位。以上研究表明炎癥環(huán)境下不同細(xì)胞Notch通路受體及配體表達(dá)具有差異，而細(xì)胞表達(dá)不同受體配體在破骨分化過程也發(fā)揮不同作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Pg-LPS可激活hPDLCs Notch通路, Notch通路參與牙周免疫炎癥反應(yīng)。而在牙周炎癥環(huán)境下不同受體及配體間的相互作用是否發(fā)揮不同甚至相反的作用，尚需更進(jìn)一步的研究。

近年來Notch通路在骨免疫炎癥相關(guān)研究中備受矚目。K ikuta等[13]通過大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)報道Notch通路阻斷劑DAPT可阻斷牙周膜細(xì)胞通過RANKL及IL-6介導(dǎo)的牙根吸收。Manokaw inchoke等[14]使用Fc Jagged-1顯著下調(diào)hPDLCs OPG/RANKL的比例，經(jīng)Fc Jagged-1處理后的hPDLCs明顯促進(jìn)破骨生成，表明Notch通路可上調(diào)RANKL/ OPG表達(dá)參與破骨生成。但與之相反的是，Osathanon等[15]報道Jagged-1可促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞(Hum an periodontal ligam en t stem cell，hPDLSCs)的成骨作用, 提示Notch通路可能具有促進(jìn)細(xì)胞成骨向分化作用。上述研究結(jié)果表明Notch通路在參與炎癥性骨免疫中可能發(fā)揮成骨破骨雙向作用。為明確Notch通路在牙周致病菌作用下是否參與RANKL介導(dǎo)的破骨作用，本實(shí)驗(yàn)使用Notch通路阻斷劑DAPT預(yù)處理Pg-LPS誘導(dǎo)的hPDLCs，發(fā)現(xiàn)Notch通路Hey-1mRNA及蛋白水平均表達(dá)下調(diào)，表明DAPT可有效抑制h PDLCs Notch通路。此外，經(jīng)Pg-LPS誘導(dǎo)上調(diào)的RANKL在mRNA水平及蛋白水平均下調(diào)，這提示Pg-LPS誘導(dǎo)的RANKL上調(diào)依賴于Notch信號通路，證實(shí)Notch通路在牙周致病菌作用下具有促進(jìn)破骨生成作用。然而，本研究僅局限于體外Notch通路對牙周膜細(xì)胞的破骨免疫研究，尚需更多研究明確Notch通路在牙周炎發(fā)生發(fā)展中是否發(fā)揮作用。此外，經(jīng)DAPT處理后hPDLCs OPG m RNA水平雖然顯著上升，但是蛋白水平未發(fā)生明顯改變。OPG m RNA和蛋白表達(dá)不一致其原因可能是OPG在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平過程中存在時間間隔或由于OPG表達(dá)受其他通路及炎性因子共同介導(dǎo)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Pg-LPS可上調(diào)hPDLCs RANKL/OPG的表達(dá)。在此過程中，Notch通路被激活，參與Pg-LPS調(diào)控的RANKL/ OPG上調(diào)，提示Notch在牙周炎癥破骨免疫中發(fā)揮一定作用。然而在復(fù)雜的牙周炎癥環(huán)境下，多種免疫細(xì)胞及大量炎癥因子共存，Notch通路在牙周炎癥下發(fā)揮骨免疫作用的確切機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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Role of Notch pathway in RANKL/OPG expression induced by Porphyromonas gingivalis L ipopolysaccharidein human periodontal ligament cells

ZHANG Chi,CHENQian-ying,ZHAO Ya-jing,GAO Li,ZHAOChuan-jiang(Departmentof Periodontology,Guanghua School of Stomatology,Hospital of Stomatology,Sun Yat-sen University&Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology,Guangzhou 510055,China)

Objective:To detect the expression of Notch signaling factors in human periodontal ligament cells(hPDLCs) treated w ith Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (Pg-LPS), and further exp lore their roles involving in the expression of RANKL/OPG. M ethods:Primary hPDLCs were cultured using combined methods of tissue explant and enzymatic digestion. Passage third-fifth cells were treated w ith 0.1、1、10μg /m l Pg-LPS, and the expression of RANKL/OPG in hPDLCs was detected by Real-time PCR after 72h. Meanwhile, the expressions of DLL-1, Hey-1, Notch4, Jagged1-2, Notch1-2 were assessed in hPDLCs treated with 1μg/m l LPS. Furthermore, hPDLCs were pretreated with the γ-secretase inhibitor, namely DAPT, for 1 hour, and then co-cultured w ith 1μg/m l Pg-LPS for 72 hours, the expression of RANKL/OPG and Hey-1 were measured using western-blotting and real-time PCR. Resu lts:The mRNA expression of RANKL, as well as DLL-1、Jagged-1、Notch4 and Hey-1 were significantly elevated in hPDLCs stimulated w ith 1μg /m l Pg-LPS (P＜0.05).After blocking the notch signaling pathway with DAPT, both mRNA and protein levels of RANKL and Hey-1expression were down-regulated as comparing w ith control hPDLCs treated w ith Pg-LPS (P＜0.05). Conclusion:Notch signaling pathw ay is involved in the Pg-LPS induced RANKL/OPG expression in human periodontal ligament cells.

Porphyromonas gingivalis; Lipopolysaccharide; RANKL/OPG; Notch signaling pathway

R781

A

1672-2973(2017)02-0097-06

2016-10-23)

張馳 中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院·廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室碩士生廣東510055

陳倩瑩 中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院·廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室碩士生廣東510055

趙雅靜 中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院·廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室碩士生廣東510055

高靂 中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周科博士廣東510055

趙川江 通訊作者中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周科副教授廣東510055