微小RNA-155在系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞中的表達

李 莉，李淑敏，張志濤，王衛遠

(1.邯鄲市傳染病醫院 檢驗一科，河北 邯鄲056000;2.邯鄲市中心醫院 風濕免疫科)

微小RNA-155在系統性紅斑狼瘡外周血單個核細胞中的表達

李 莉1，李淑敏1，張志濤1，王衛遠2

(1.邯鄲市傳染病醫院 檢驗一科，河北 邯鄲056000;2.邯鄲市中心醫院 風濕免疫科)

目的 探討系統性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血單個核細胞(PBMC)中miRNA-155的表達水平及其對SLE預后的意義。方法 收集我院2013年9月-2016年3月確診并治療的SLE患者61例，根據SLE疾病活動指數分為輕度組26例，中重度組35例，同期選擇30例健康體檢者作為對照組。應用實時熒光定量PCR技術對入選者PBMC中miRNA-155的表達水平進行檢測，對比分析各組表達情況。結果 與對照組相比，輕度活動組的miRNA-155表達水平無統計學差異(P>0.05)；中重度活動組miRNA-155水平明顯高于對照組(P<0.05)。抗dsDNA抗體、24 h尿蛋白與SLE患者miRNA-155表達水平顯著相關(P<0.05)；與無狼瘡腎組相比，狼瘡腎陽性組SLE患者miRNA-155水平顯著升高(P<0.05)；與血液系統正常組SLE患者相比，異常組miRNA-155水平顯著升高(P<0.05)。結論 中重度活動SLE患者PBMC中miRNA-155表達升高；miRNA-155表達與抗dsDNA抗體及24 h蛋白尿相關；miRNA-155在狼瘡腎、血液系統異常中呈高表達。

系統性紅斑狼瘡；外周血單個核細胞；miRNA-155

(ChinJLabDiagn,2017,21:0833)

近年來，越來越多的研究表明系統性紅斑狼瘡(SLE)患者普遍存在miRNA異常，miRNA可能通過調節免疫細胞信號轉異、免疫細胞分化等精細微調影響機體免疫功能[1]。經mircroRNA芯片技術發現miRNA-155在SLE患者外周血中顯著高于健康個體，但對SLE活動度的評估尚不明確[2]。本次研究擬對miRNA-155在外周血單個核細胞(PBMC)相對表達量與患者臨床特征關系進行觀察，為評估SLE病情、預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇我院風濕免疫科2013年9月-2016年3月收治的SLE患者61例，根據SLE疾病輕重度分為兩組：輕度組、中重度組。輕度組26例：男8例，女18例；年齡19-46歲，平均32.16±11.06歲；病程2-48個月，平均23.16±6.13個月；口腔潰瘍9例，皮疹24例，頭痛10例。中重度組35例：男12例，女23例；年齡18-48歲，平均32.98±12.06歲；病程3-47個月，平均24.02±7.18個月；口腔潰瘍16例，皮疹32例，頭痛12例，腎損傷(出現有白細胞尿、蛋白尿、血尿、腎功能異常)35例。同時選擇在我院進行體檢的健康人群30例作為對照組。各組年齡、性別無顯著統計學差異(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準，入選者或家屬知情同意，符合醫學倫理學標準。

1.2 納入與排除標準

診斷標準：符合1997年美國風濕病學會推薦的SLE分類標準中的4項或4項以上者，特別是免疫學異常、高滴度抗核抗體異常者即可診斷。病情輕重度的評估：①輕型：高度懷疑或診斷明確的SLE患者，臨床無明顯內臟損害，SLE疾病活動指數(SLEDAI)<10分；②中重型：具有明顯重要臟器累及且需要治療者，SLEDAI≥10分[3]。排除感染、心臟病、高血壓、糖尿病、腫瘤、其他結締組織病；妊娠期、哺乳期婦女；凝血功能異常者。

1.3 檢測方法

1.3.1 主要試劑 人淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)、miRNA提取試劑盒(miRNAVanna PARIS Kit，Ambion)、TaqMan miRNA反轉錄試劑盒(美國應用生物系統公司)、miRNA檢測試劑盒(TaqMan microRNA Assay Kit，美國應用生物系統公司)、Taqman通用PCR混合物(美國應用生物系統公司)。

1.3.2 PBMC分離 采集入選者肘部外周靜脈血2 ml，應用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-k2)抗凝，置于-80℃保存，將4 ml淋巴細胞分離液先注入滅菌的15 ml離心管內，取2 ml EDTA-k2抗凝血緩慢加入淋巴細胞分離液液面上(盡量不摻入到淋巴細胞分離液層中)，進行離心(室溫，2 000 r/min)20 min，取1 ml白細胞層與1 ml生理鹽水混勻，再加入2 ml淋巴細胞分離液面，再次離心(室溫，2 000 r/min)25 min，吸取云霧層，加入eppendorf管(1. 5 ml)中，之后離心(室溫，7 000 r/min)10 min，丟棄上清。

1.3.3 mRNA反轉錄為互補脫氧核糖核酸(cDNA) 應用miRNA反轉錄試劑盒的操作說明對總RNA的miRNA反轉錄成cDNA。miRNA-155逆轉錄反應條件：16℃、42℃分別為30 min，85℃5 min；小分子RNA U6逆轉錄反應條件：37℃30 min、85℃5 min。將逆轉錄產物置于-20℃環境中備用。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR) 應用美國應用生物系統公司定量PCR儀(7300型)，以小分子RNA U6為內參，取20 μl反應體系進行PCR測定，每個標本做3個復孔，取miRNA-155的各標本平均循環閾值(cycle threshold,Ct)后減去U6 Ct值作為測評值(△CT)，該值越高則表達水平越低，該值越低則表達水平越高。由于樣本間存在一定的不一致因素，因此需要對PCR結果進行分析，計算標準化后的2-△CT作為miRNA的相對表達量。

MiRNA-155正向引物序列(5’-3’)為CGTrAATGCTAATCGTGATAG，大小為21 bp；U6正向引物序列(5’-3’)CTcGCTTcGGcAGcACA，大小為17 bp；miRNA通用反向引物序列(5’-3’)物GCAGGGTCCGAGGT，大小為14 bp。

1.3.5 其他檢測 按照院內常規方法測定血常規、尿24 h蛋白定量、尿常規、血清補體、自身抗體等。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 健康對照組與SLE患者PBMC中miRNA-155表達水平

標準化后的miRNA-155相對量：健康組為130.87±67.16，輕型組為141.26±63.17，中重度組為181.16±72.33。輕型組略高于健康組(t=0.59，P=0.56)；中重度顯著高于健康組(t=2.89，P=0.01)；中重度組顯著高于輕度組(t=2.25，P=0.03)。

2.2SLE患者miRNA-155表達水平與臨床表現的關系

對入選的61例SLE患者實驗室檢查項目與標準化miRNA-155水平進行相關性分析，結果顯示:抗dsDNA抗體、24h蛋白尿與miRNA-155呈正相關，且關系緊密(P<0.05)，詳見表1。以SLE疾病活動評分>7分、白細胞或血小板降低，采血前24h糖皮質激素用量≥1mg·kg-1·d-1這三項作為劃分依據，滿足上述三項者為SLE陽性組，不滿足者為陰性組；；以補體C3<0.8g/L、C4<0.2g/L來劃分是否為低補體血癥；以是否具有狼瘡腎劃分；以是否具有白細胞、血小板降低定義血液系統異常與否；分別比較陰性組、陽性組的miRNA-155水平，結果見表2。

表1 SLE臨床特征與miRNA-155相關性

表2 SLE臨床表現與miRNA-155水平關系

3 討論

在我國的一份大樣本一次性調查中顯示，SLE患病率為70/10萬人，其中女性患病率較高，為113/10萬[4]。從本次觀察的61例SLE患者的性別比例來看，女性占67.21%，符合本病的發病人群特點。有學者認為雌激素具有促進體液免疫反應的作用，因此SLE的女性發病率較男性高[5]。

miRNA是一類非編碼RNA，具有高度保守性，通過與靶基因mRNA互補配對來降解mRNA或抑制翻譯，進而負性調節轉錄后基因的表達。miRNA-155是位于人類21號染色體上的B細胞整合簇(B-cell integration cluster，bic)基因的第三外顯子內，是典型的多功能基因，可以活化T細胞、B細胞、巨噬細胞等免疫相關細胞，其表達水平受bic基因的轉錄水平、其他miRNA加工調控[6]。miRNA-155存在于多種人類惡性腫瘤中， miRNA-155失調控也與SLE、類風濕性關節炎、多發性硬化癥等自身免疫性疾病相關[7]。

從本次研究的結果來看，miRNA-155在健康人與輕度SLE患者的表達水平不存在顯著差異，說明miRNA-155對SLE診斷敏感性較弱，但是中重度組的miRNA與對照組、輕度組的顯著性差異，提示miRNA-155對于靶器官損害與否的敏感性較好，推測miRNA-155在SLE靶器官損害中或發揮著一定作用。miRNA-155是BIC基因的表達產物，與B細胞的分化、增殖關系密切，同時也可活化T細胞分泌的細胞因子，能夠抑制BMP信號及BMP介導的EBV重新激活，而這些導致的T、B細胞失調控則會促進自身抗體的產生[8]。在本次研究中，抗dsDNA抗體與miRNA-155表現出了顯著的相關性，進一步證實了miRNA-155在SLE自身抗體產生中的作用。陳京京等對比了59例SLE患者、25例健康人的PBMC的miRNA-155、21的表達水平，結果顯示與無狼瘡腎炎組相比，狼瘡腎炎組SLE患者miRNA-155、21表達水平明顯升高(P<0.05)[9]。這與本次觀察的結果一致，說明miRNA-155對SLE腎臟損害較為敏感，根據陳京京的研究結果推測miRNA-155可能參與了BMP通路，進而在狼瘡腎的發生發展中發揮著作用。尹志華等對20例SLE患者和15例健康者的外周血分離PBMC、血漿中miRNA-155分別進行對比時顯示，SLE患者PBMC中miRNA-155的表達水平是健康者的3.07倍，差異顯著(P<0.05)，抗dsDNA抗體、C3下降、尿蛋白陰性組、陽性組間PBMC中未表現出miRNA-155水平差異(均P>0.05)[10]。尹氏研究結果表明PBMC中miRNA-155對SLE診斷的敏感性較好，這與本次研究結果基本一致，SLE臨床指標上的差異或許是由于入選SLE患者活動程度不同、入選者數量較少等因素造成。

miRNA-155幾乎參與了B細胞成熟的每個過程，因此在彌漫大B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、B細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等中均有表達上調的表現[11]。薛華等研究認為，miRNA-155是一種表達在造血細胞的miRNA，通過影響細胞分化、增殖、凋亡的細胞信號轉導途徑來影響血液系統[12]。本次觀察結果中miRNA-155水平在血液系統異常陽性組呈顯著高表達，提示miRNA-155對血循環的影響明確，或可作為SLE是否累及血系統的觀測指標。

有研究顯示，SLE治療過程中腎功能異常、心血管疾病、惡性腫瘤、骨質疏松等發生率不斷增加，這些均可導致患者生活質量明顯下降甚至死亡。國內的一項SLE5年期生存率及預后因素分析指出，腎功能衰竭、感染是最常見死因[13]；SLE患者亞臨床和臨床心血管疾病風險顯著增加[14]；而SLE本身具有促進肺癌、淋巴瘤、肝膽管癌等惡性腫瘤發生的作用[15]。有學者認為SLE的早期治療應以誘導疾病緩解為目的，而遠期治療則應注重減少器官損傷，從而提高患者生活質量[16]。可見，監測SLE發生發展情況，對改善患者預后生活質量具有重要意義，從本次觀察的結果來看，miRNA-155在SLE侵犯腎、循環系統具有較好的敏感度，為早期診斷、治療提供了一定參考，為及時采取治療措施提供客觀依據，這對改善SLE的預后情況具有積極意義。

綜上所述，miRNA-155在PBMC中的表達水平對于SLE活動度的程度判斷具有指導價值，高miRNA-155表達與狼瘡腎、血系統異常、尿蛋白陽性的發生關系密切。本次研究SLE病例數較為有限，對SLE累及器官未做細致的分類miRNA-155水平的觀察，這些均有待下一步研究探討。

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Expression of minRNA-155 in peripheral blood mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients

LILi,LIShu-min,ZHANGZhi-tao,etal.

(HandanInfectiousDiseaseHospital,Handan056000,China)

Objective To investigate the Expression of minRNA-155 in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of systemic lupus erythematosus(SLE) patients and the the impact on prognosis.Methods 61 patients were selected from September 2013 to March 2016,who meet the diagnostic criteria of SLE from our hospital.According to SLE disease activity index 61 cases were divided into mild activity group 26 cases,moderate and severe activity group 35 cases.30 healthy persons were selected as control group.miRNA-155 expressions in PBMC was examined by real-time PCR.Results Compared with the control group,there was no significant difference in miRNA-155 expression of mild activity group(P>0.05).The levels of miRNA-155 in the moderate and severe activity group were significantly higher than those in the control group(P<0.05).The levels of dsDNA expression and 24h were significantly correlated with the levels of miRNA-155 expression in SLE patients(P<0.05).Patients with lupus nephritis had higher expression levels of miRNA-155 than thoses without(P<0.05).Patients with abnormal blood had higher expression levels of miRNA-155 than thoses without(P<0.05).Conclusion The moderate and severe activity SLE patients have higher expression of miRNA-155 in PBMC.The expression of miRNA-155 was associated with the urine of anti dsDNA and 24h proteins.MiRNA-155 was highly expressed in the abnormal renal and hematological abnormalities of lupus.

systemic lupus erythematosus；peripheral blood mononuclear cells；miRNA-155

1007-4287(2017)05-0833-04

R593.24

A

2016-08-13)