大腸癌組織與癌旁正常組織基因差異表達圖譜及信號通路研究

洪朝金 盧麗琴 郭勇 欽志泉

大腸癌組織與癌旁正常組織基因差異表達圖譜及信號通路研究

洪朝金 盧麗琴 郭勇 欽志泉

目的 篩查人大腸癌腫瘤組織與相應癌旁正常組織差異表達基因。方法 應用NimbleGen基因芯片檢測4例大腸癌腫瘤組織及相應癌旁正常組織基因表達譜，并以RT-PCR技術對部分基因芯片檢測結果進行驗證，利用生物信息學方法對檢測結果進行分析。結果 大腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織差異表達基因共5 042條，其中表達水平上調3 399條，下調1 643條，這些基因涉及多個信號通路。結論 本研究結果可為尋找大腸癌分子標記物和探索大腸癌發生的分子機制提供實驗依據。

大腸癌 基因芯片 基因表達譜 生物信息學

大腸癌是人類高發惡性腫瘤之一，近年來其發病率和死亡率在我國呈上升趨勢，患者趨于年輕化，因此，研究其發病機制顯得尤為重要。本研究采用基因芯片技術檢測大腸癌腫瘤組織與癌旁正常組織的基因表達差異，并利用生物信息學方法對檢測結果進行分析，探討大腸癌的發病機制,尋找大腸癌分子標記物和探索大腸癌發生的分子機制提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2011年8至10月在浙江省人民醫院手術治療的4例大腸癌患者的組織標本。術前均經腸鏡檢查明確診斷并經術后病理檢查證實，均為中分化結腸腺癌，其中，48歲男性患者為乙狀結腸腺癌（pT4aN1M0/ⅢB期），62歲女性患者為乙狀結腸腺癌（pT3N2aM0/ⅢB期），62歲男性患者為乙狀結腸腺癌（pT3N0M0/ⅡA期），68歲女性患者為橫結腸腺癌（pT3N1M0/ⅢB期），診斷標準參照中華人民共和國衛生部醫政司制定的《中國常見惡性腫瘤診治規范》（2011版），TNM臨床分期采用AJCC制定的標準（2007年版）。

1.2 主要儀器及試劑 微量紫外分光光度計（NanoDropRND-1000）；羅氏 NimbleGen芯片雜交系統（Roche NimbleGen Hybridization System）；美國 ABI 9700型PCR基因擴增儀（Geneamp PCR System 9700）；生物芯片掃描儀（GenePix 4000B）；Trizol試劑（英杰公司）；Invitrogen Superscript雙鏈cDNA合成試劑盒（英杰公司）；Nimblegen單色DNA標記試劑盒（羅氏公司）；NimbleGen芯片雜交試劑盒（羅氏公司，批號：05223474001）；Nimblegen HX12 mixe（r羅氏公司，批號：05223768001）；Nimblegen洗滌緩沖試劑盒（羅氏公司，批號：05223504001）。

1.3 檢測方法

1.3.1 組織標本采集 經手術切取大腸癌腫瘤組織及癌旁正常組織（距腫瘤組織邊緣1cm以上，病理檢查顯示無腫瘤細胞浸潤），一部分用生理鹽水清洗后置于RNAlater中，放入凍存管中迅速投入液氮中保存，以備基因芯片研究；另一部分置于甲醛溶液中以做病理切片檢查。將4例中分化腺癌組織作為芯片檢測“腫瘤組”樣品池，各例相應癌旁正常組織等比例混合組成1個“正常組”樣品池，重復兩次實驗并利用RT-PCR驗證實驗結果。

1.3.2 RNA提取和質量控制 采用Trizol方法抽提總RNA；NanoDropRND-1000測定RNA濃度和純度；瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度及完整性。樣本質量合格的判定標準為：吸光度（OD）A260與A280比值在1.95～2.05，電泳RNA的28S和18S條帶清晰，28S條帶亮度約是18S條帶的2倍。

1.3.3 熒光標記 用NimbleGen單色DNA試劑盒標記ds-cDNA。

1.3.4 雜交與清洗 將標記好的樣品與雜交buffer（3× SSC，0.2%SDS，50×Denhart’s，25%甲酰胺）混勻后，注到已經與相應混合物黏合的芯片上，采用RocheNimble－Gen Hybridization System雜交儀42℃雜交16～20h。雜交結束后，去除混合物，分別用洗液I、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ清洗芯片，甩干，掃描。

1.3.5 芯片掃描、圖像采集分析 使用Axon GenePix 4000B微陣列掃描儀陣列掃描，Gene Pix proV6.0軟件對芯片圖像進行分析，并檢索互聯網生物學公共數據庫基因銀行（GeneBank），獲得每條基因的名稱和其他基本信息。

1.3.6 RT-PCR驗證部分基因芯片檢測結果 選擇甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參基因，在基因芯片篩選的結果中，選擇4條差異表達基因TNFSF13、IFG1R、HSP90A、IL1R2為待測基因，通過GeneBank查詢待測基因及內參基因的堿基序列，應用Primer5.0設計引物，產物或引物跨越外顯子，以保證擴增結果真實而無DNA干擾。經局部序列比對基本檢索工具（BLAST）驗證未見非目的基因擴增，不形成二聚體，各基因引物見表1。

1.3.7 芯片數據分析 使用AgilentGeneSpringGXv11.5.1軟件進一步分析數據。對芯片的歸一化強度（Normalized Intensity）、差異倍數（Fold-Change）進行分析，取Normalized Intensity作t檢驗，設定判斷差異基因表達的標準為：Fold-Change＞2.0，P＜0.05為顯著表達差異基因。對顯著表達差異基因進行生物信息學分析，檢索數據庫，進行細胞信號轉導通路（Pathway）分析。

表1 各基因引物

2 結果

2.1 樣本組織總RNA純化及質檢 腫瘤組織和癌旁正常組織的總RNA經NanoDrop ND-1000核酸定量分析儀檢測，RNA的OD（A260/A280）均在2.0左右，說明提取的RNA純度較高，見表2。

表2 NanoDrop ND-1000測定RNA濃度和純度

經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，28S和18S兩條帶清晰可見，且無拖尾現象，示完整性好，質量合格，總量夠用，可用于芯片實驗研究，見圖1。

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖（編號1～4為大腸癌腫瘤組織標本，5～8為大腸癌癌旁正常組織標本）

2.2 芯片掃描結果及分析 得出大腸癌腫瘤組織組和癌旁正常組差異表達基因共5 042條，其中，表達水平上調3 399條，下調1 643條，這些基因在大腸癌腫瘤組織組與癌旁正常組織組的表達有明顯區別，見圖2。

圖2 大腸癌腫瘤組織組與癌旁正常組織組間差異基因的火山圖（水平線代表2.0倍,垂直線代表P值為0.05,圖中的紅點表示基因表達差異有統計學意義）

2.3 RT-PCR檢測結果 與癌旁正常組織組相比較，大腸癌腫瘤組織組中TNFSF13、HSP90A、IL1R2基因表達上調，而IFG1R基因表達下調，提示與疾病相關基因在兩組大腸組織中的表達情況，與基因芯片的檢測結果基本吻合，驗證了基因芯片部分表達結果可靠，見圖3-7。

圖3 RT-PCR GAPDH擴增曲線（水平線代表循環數，垂直線代表熒光相對強度，據圖可以看出待測樣品的重復性較好，PCR擴增效果較好，下同）

2.4 芯片信號轉導通路分析結果 Pathway分析結果如圖8、9。

圖4 RT-PCR TNFSF13擴增曲線

圖5 RT-PCR IGF1R擴增曲線

圖6 RT-PCR HSP90A擴增曲線

圖7 RT-PCR IL1R2擴增曲線

圖8 上調基因主要信號轉導通路

圖9 下調基因主要信號轉導通路

由圖8、9可見，在大腸癌腫瘤組織中，上調的3 399條差異基因主要涉及36個信號通路，其中最為富集的為DNA修復通路（DNA replication），有21條基因的表達發生變化；其次是細胞周期通路（Cell cycle）及嘌呤代謝通路（Purine metabolism），分別有38及41條基因的表達發生變化；其余變化顯著的依次為葉酸一碳庫(One carbon pool by folate）、類固醇生物合成（Steroid biosynthesis）、錯配修復（Mismatch repair）、嘧啶代（Pyrimidine metabolism）、p53信號通路（p53 signaling pathway）、基底切除修復（Base excision repair）。下調的1 643條基因主要uscle contraction），有20條基因的表達發生變化；其次是補體和凝血級聯通路（Complement and coagulation cascades）及焦黏附通路（Focal adhesion），分別有14及26條基因的表達發生變化；其余變化顯著的信號依次是百日咳（Pertussis）、腫瘤途徑（Pathways in cancer）、金黃色葡萄球菌感染途徑（Staphylococcus aureus infection）涉及45個信號通路，其中最為富集的為血管平滑肌收縮信號（Vascular smooth m）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、基底細胞（Basal cell carcinoma)、黑素生成癌（Melanogenesis）、Wnt信號通路（Wnt signaling pathway）等。

4 討論

癌癥差異表達基因一般是指通過比對癌組織與正常組織的基因表達狀態所獲得的 P＜0.05、Fold-Change＞2的基因[1]。基因芯片技術具有高通量、快速、準確、靈敏的特點，是近年來在分子生物學及醫學檢驗診斷技術領域中又一項創新研究手段，它綜合利用分子生物學、半導體微電子技術、激光化學、計算機科學等眾多學科領域的相關技術，突破了傳統分子生物學方法只能對某一個或某幾個基因進行研究的局限，可同時檢測數百乃至上萬個基因。

本研究利用基因芯片技術對來源于4例大腸癌腫瘤組織及癌旁正常組織的基因表達譜進行了檢測，結果與癌旁正常組織相比較，在大腸癌腫瘤組織中差異表達基因5 042條，上調基因3 399條，下調基因1 643條。在差異表達基因中，部分癌基因呈持續激活的狀態。例如IGF1R，IGF1與IGF1R結合后，通過自身磷酸化，啟動細胞內相關信號轉導途徑，依次激活胞質內的磷脂酰肌醇3激酶、胰島素相關底物-I、Src-同源域／膠原蛋白酪氨酸等，發揮誘導細胞分化、促增殖、抗凋亡的生物學效應[2-3]。在多種腫瘤組織中可以檢測到IGF1R的表達，在大腸癌中IGF1R的表達與分期、分級有關[4]。阻斷IGF1R的傳導通路可能成為大腸癌治療的途徑之一[5]。TNFSF13是增殖誘導配體（APRIL），TNFSF13在正常組織有少量表達，而在多種腫瘤特別是消化道腫瘤（包括直腸、結腸、十二指腸、胃）中高表達，與TNFSF13具有促腫瘤細胞增殖的作用有關，TNFSF13可作為判斷5-FU療效及預后的血清學標記物[6-8]。

Pathway是指蛋白間相互作用，從而影響細胞生物學功能的過程[9]。Pathway分析可以篩選出在兩個實驗之間具有顯著差異的信號轉導通路。目前，Pathway主要來自KEGG公共數據庫，我們利用KEGG數據庫嘗試闡述大腸癌腫瘤組織與癌旁正常組織之間具有顯著差異的信號轉導通路。

本研究通路富集結果顯示，腫瘤組織中差異表達基因涉及多條與癌癥發生、發展相關的通路，如Cell cycle、DNA replication、Purine metabolism、Mismatch repair、p53 signaling pathway、MAPK signaling pathway及Wnt signaling pathway等。下面對主要通路分述如下：

Cell cycle上調38條主要差異表達基因：ANAPC1，BUB3，CCNB1，CCNB2，CCND1，CCND2，CCNE1，CDC20，CDC25A，CDC6，CDC7，CDK2，CDK6，CDK7，CHEK1，CHEK2，E2F1，E2F3，E2F4，E2F5，MAD2L1，MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6，MCM7，MYC，PCNA，PLK1，PRKDC，PTTG1，RBL1，SKP2，TFDP1，TP53，YWHAE，YWHAZ。Cell cycle受機體調節系統的影響而使細胞能正常增殖，但對于癌細胞，由于宿主失去對癌細胞生長的調控，癌細胞能夠克服細胞周期，實現快速迭代和生長，從而形成惡性腫瘤。

MAPK signaling pathway下調28條主要差異表達基因：CACNA1H，CACNA2D2，CD14，DUSP22，DUSP3，FGFR1，FGFR2，FLNA，FLNC，HSPA6，IL1R1，JUN，MAP2K5，MAP3K14，MAPK8IP2，MKNK1，NFKB2，PDGFB，PDGFRA，PPP3CB，PPP3CC，PRKACB，RAP1A，RPS6KA2，RPS6KA5，RRAS，SRF，TGFB3。MAPK signaling pathway是一個典型的在核內激活轉錄因子的級聯反應通路。MAPK家族的信號通路主要包括4條，即ERK、JNK／SAPK、p38MAPK以及ERK5/BMK1。研究證實，MAPK信號通路激活后具有促進血管內皮細胞增殖和新生血管生成加速的作用。新生血管可為腫瘤細胞提供更多的營養支持，從而促進腫瘤增長，加快癌細胞擴散速度[10-12]。

Wnt signaling pathway下調28條主要差異表達基因：CAMK2B，CAMK2G，DAAM2，DVL1，FZD4，FZD8，JUN，PLCB1，PPP2R5C，PPP3CB，PPP3CC，PRICKLE1，PR－KACB，ROCK1，TCF7L1，WNT2B，WNT5B，WNT6，GAS1，GLI1，GLI2，GLI3，PRKACB，WNT2B，WNT5B，WNT6。Wnt signaling pathway是一條十分保守的信號傳導通路。目前認為Wnt signaling pathway的組成主要包括:細胞外因子（Wnt）、跨膜受體（frizzled）、胞質蛋白（β-catenin）及核內轉錄因子（TCF）等一系列蛋白。當細胞外因子與受體結合后，通過一系列胞質蛋白的相互作用使β-catenin蛋白在胞質內累積進而入核與轉錄因子TCF共同作用激活靶基因的轉錄。Wnt signaling pathway的下游靶基因多數是參與細胞增生與凋亡的基因，如cylinD1、c-myc等。越來越多的研究結果表明，Wnt signaling pathway與許多人類腫瘤的發生、發展也具有密切關系[13]。

以上結果充分證明，大腸癌的發生、發展是多基因及多通路參與的分子病理過程，只有對這些基因及信號通路功能以及它們之間的相互作用進行深入系統的研究，才有可能全面闡明大腸癌的發病機制。本研究得到的差異表達基因圖譜中的若干重要基因及信號轉導通路，對于今后的研究工作具有一定的指導和借鑒作用。

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Differentially expressed genes in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues

HONG Chaojin,LU Liqin,GUO Yong,et al.Department of Oncology,Zhejiang Province People′s Hospital,Hangzhou 310014,China

Colorectal cancer Gene chips Gene expression profiles Bioinformatics

2016-11-15）

（本文編輯：沈叔洪）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.9.2016-1908

浙江省醫學會臨床科研基金項目（2015ZYCB1）；浙江省中醫藥科技計劃重大項目（2007ZA007）

310014 杭州，浙江省人民醫院腫瘤內科（洪朝金、盧麗琴、欽志泉）；浙江省中醫院腫瘤內科（郭勇）

洪朝金，E-mail：hongcjhz@163.com

【 Abstract】 Objective To screen the differentially expressed genes in human colorectal cancer(CRC)tissue. Methods NimbleGen gene expression array information were used to detect the gene expressions of CRC tissue paired with normal colorectal tissue.The microarray findings were confirmed by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR).The results were analyzed by bioinformatic technique. Results Compared with normal tissues,a total of 5042genes with more than 2-fold differential expression were detected in CRC tissues,of which 3399 genes were up-regulated and1643 genes were down-regulated.These genes involved multiple signaling pathways. Conclusion The results may provide experimental basis to seek for molecular markers and to investigate the molecular mechanism of colorectal cancer.