過表達Oct4B1誘導結直腸癌SW480細胞發生上皮間質轉化①

陳奕霖 文坤明 胡水清 陳正權 曾慶良

(遵義醫學院附屬醫院胃腸外科，遵義563000)

過表達Oct4B1誘導結直腸癌SW480細胞發生上皮間質轉化①

陳奕霖 文坤明 胡水清 陳正權 曾慶良

(遵義醫學院附屬醫院胃腸外科，遵義563000)

目的：探討Oct4B1基因過表達是否誘導人結直腸癌SW480細胞發生上皮間質轉化(EMT)及其可能的機制。方法：用帶G418抗性的Oct4B1基因過表達質粒及陰性對照質粒轉染人結直腸癌SW480細胞株，分別稱為實驗組(SW480-Oct4B1)及對照組(SW480-NC)，轉染成功后用G418篩選建立穩定轉染的細胞株，對兩種穩定轉染細胞進行如下檢測：① RT-qPCR檢測Oct4B1的mRNA水平；②劃痕實驗和Transwell小室實驗檢測遷移和侵襲能力；③Western blot檢測EMT相關標記物E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表達；④RT-qPCR和Western blot檢測EMT轉錄因子Twist的mRNA及蛋白表達。 結果：穩定轉染細胞株建立后，實驗組與對照組比較：Oct4B1基因表達水平明顯升高(P<0.01)；細胞遷移明顯增強(P<0.01)；細胞侵襲能力明顯提高(P<0.01)；上皮標記物E-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)；而間質標記物N-cadherin及Vimentin蛋白表達量明顯上調(P<0.01)；Twist 的mRNA及蛋白表達量均明顯升高(P<0.01)。結論：過表達Oct4B1基因可誘導人結直腸癌SW480細胞發生EMT，增強細胞遷移及侵襲能力，其分子機制可能與提高Twist表達有關。

結直腸癌細胞；Oct4B1；上皮間質轉化；Twist

Oct4不但是調控胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ES)特性的重要轉錄因子[1]，研究還發現Oct4參與腫瘤干細胞(Cancer stem cells，CSCs)及腫瘤細胞上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transitions，EMT)過程的調控[2,3]。Oct4B1作為Oct4重要的亞型，在結直腸癌及胃癌等腫瘤細胞中高表達，具有抗腫瘤細胞凋亡的作用[4,5]，Oct4B1是否調控腫瘤細胞EMT過程，目前鮮見文獻報道。本研究擬過表達人結直腸癌SW480細胞中的Oct4B1基因，明確Oct4B1基因是否能夠誘導人結直腸癌SW480細胞發生EMT及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結直腸癌SW480細胞株購于中國科學院上海細胞庫；L-15培養基購于北京邁晨生物有限公司;胎牛血清(FBS)購于美國 Hyclone公司；帶G418抗性的Oct4B1過表達質粒及陰性對照質粒于上海吉凱基因化學技術公司構建；LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司；Transwell小室購于加拿大Biofil公司；Matrigel膠購于美國Clontrch公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR TAQ Real time試劑盒購于大連TaKaRa公司；細胞全蛋白提取試劑盒購于南京凱基公司；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimenti、Twist一抗購于美國Eptomics公司；G418購于美國Sigma公司；鼠抗人GAPDH一抗及山羊抗兔、山羊抗鼠二抗購于北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 瞬時轉染實驗 轉染步驟：①將人結直腸癌SW480細胞于含10%FBS的L-15培養基中培養，待細胞生長狀態良好時，用于轉染實驗；②將呈對數生長期的SW480細胞1×106/孔接種于6孔板，按說明書用LipofectamineTM2000 轉染試劑盒將帶G418抗性的Oct4B1過表達質粒及陰性對照質粒轉染到該細胞中分別得到實驗組(SW480-Oct4B1)與對照組(SW480-NC)；③轉染后48 h收集兩組細胞，提取RNA并逆轉錄成cDNA，用RT-qPCR檢測Oct4B1 mRNA的表達水平(具體方法見1.2.5)，確定Oct4B1過表達質粒的瞬時轉染效果。

1.2.2 構建穩定轉染細胞株 (1)因質粒帶G418抗性基因，在構建穩定轉染細胞株前首先檢測G418對SW480細胞的最佳作用濃度：①將SW480細胞接種于24孔板(1×105個/孔)中培養，待融合度達80%用于最佳G418濃度的篩選；②用含10%FBS的 L-15 培養基配制成含不同濃度梯度的G418培養基(0、200、400、800及1 600 μg/ml)分別加入到各孔中，觀察細胞凋亡情況，確定最佳的G418濃度。(2)用前述最佳作用濃度的G418加入到瞬時轉染質粒后的兩組細胞的培養液中，未轉染的細胞因G418作用而凋亡，成功轉染的細胞因帶G418抗性而存活下來，逐步篩選得到的穩定轉染的細胞株，用于后續實驗，所有實驗均重復3次以上。

1.2.3 細胞遷移能力檢測 將穩定轉染后的細胞株接種于6孔板(1×106個/孔)中培養，待鋪滿孔板后用針頭(1 ml注射器)垂直劃出間距約0.5 mm均勻直線，用PBS清洗后繼續培養，觀察12 h和24 h后細胞在劃線處傷口愈合的情況，用愈合率來反映細胞的遷移能力。

1.2.4 細胞侵襲能力檢測 實驗前12 h用無血清培養兩組細胞使其處于饑餓狀態，按說明書用無血清培養基把Matrigel膠稀釋為2 mg/ml，把Transwell小室放于24孔板后在小室中加入100 μl稀釋后的Matrigel膠，于37℃培養箱中靜置4 h，在24孔板(下室)加入含20%FBS的L-15培養基600 μl，在Transwell小室(上室)中加入用無血清培養基制備好的細胞濃度為1×105個/ml的細胞懸液250 μl，培養24 h后取出Transwell小室去掉基質膠表面殘留的細胞，用2%結晶紫染色，在顯微鏡下隨機觀察四個視野求得每個視野穿膜細胞數平均值，通過穿膜細胞數反映其侵襲能力。

1.2.5 RT-qPCR 細胞刮刮取兩組細胞，RT-qPCR 法檢測目的基因的mRNA水平：①按說明書用RNA提取試劑盒提取細胞的RNA；②逆轉錄合成cDNA；③SYBR Green染料法進行實時定量PCR反應。反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，59℃ 30 s，40個循環；65℃ 5 s，95℃ 5 min；繪制熔解曲線，每次檢測設立3個復孔，重復3次。選擇GAPDH基因為內參，運用2-ΔΔCt法確定目的基因的相對表達水平[3]。引物序列見表1，由大連寶生物公司設計并構建。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達 細胞刮刮取兩組細胞，Western blot法檢測相應蛋白表達：①按說明書用全蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，-80℃凍存備用；②每孔上樣量均為40 μg, 根據目的蛋白的分子量予以相應濃度SDS-PAGE膠分離蛋白，用濕法轉膜(1 kD/min)將目的蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后用PBST洗滌3次，加入一抗稀釋液(目的蛋白稀釋比例均為1∶2 000，內參GADPH為1∶1 000)，4℃過夜孵育；次日用PBS洗膜后加入相應的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗稀釋液(二抗均為1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h后PBS洗膜，用ECL發光并拍照。采用Image-Pro Plus軟件對條帶的吸光度值進行半定量分析。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GeneUpstreamDownstreamOct4B15'-AATCCCGAATGGAAAGG-3'5'-GGAACCCACCAAATAGAAC-3'Twist5'-AGCAAGATTCAGACCCTCAAGC-3'5'-CTCCATCCTCCAGACCGAGAA-3'GAPDH5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'5'-TGAGAAAGGAGACCCAGCAG-3'

2 結果

2.1 RT-qPCR檢測瞬時轉染后兩組細胞Oct4B1 mRNA表達情況 瞬時轉染后48 h，采用RT-qPCR檢測兩組細胞中Oct4B1 mRNA表達水平，結果實驗組較對照組提高了1.3倍，提示瞬時轉染成功。

2.2 穩定轉染株的構建 G418對SW480細胞的最佳作用濃度為800 μg/ml，在含10%FBS的 L-15 培養基中加入該濃度的G418篩選瞬時轉染成功的兩組細胞，經篩選成功建立了穩定轉染細胞株(見圖1A)。穩定轉染細胞株建立后，實驗組較對照組細胞的Oct4B1 mRNA表達水平提高了1.8倍，實驗組明顯高于對照組(P<0.01)，見圖1B。

2.3 細胞遷移能力檢測結果 實驗組與對照組12 h 在劃線處傷口愈合率分別為(45.0±1.2)%和(34.3±1.2)%，繼續培養至24 h在劃線處傷口愈合率分別為(54.0±1.0)%和(42.0±1.5)%，發現實驗組傷口愈合率均明顯高于對照組(P<0.01)，見圖2，提示實驗組遷移能力明顯強于對照組。

圖1 RT-qPCR檢測穩定轉染后兩組細胞Oct4B1 mRNA表達情況Fig.1 Expression of Oct4B1 mRNA in two groups after stable transfection was detected by RT-qPCRNote: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

2.4 細胞侵襲能力檢測結果 培養24 h后發現實驗組和對照組穿膜細胞數分別為(568.7±20.2)和(398.0±11.0)，實驗組穿膜細胞數明顯高于對照組(P<0.01)，見圖3，提示實驗組細胞侵襲能力強于對照組。

2.5 Western blot檢測EMT標記物蛋白表達水平 實驗組和對照組中E-cadherin蛋白表達分別為(0.39±0.01)和(0.55±0.02)，N-cadherin蛋白表達分別為(0.89±0.03)與(0.61±0.02)，Vimentin蛋白表達分別為(1.16±0.04)與(0.68±0.03)，實驗組上皮標記物E-cadherin蛋白表達量明顯低于對照組(P<0.01)，而間質標記物N-cadherin及Vimentin表達量顯著高于對照組(P<0.01)，見圖4，以上結果提示實驗組相對于對照組細胞發生EMT。

2.6 RT-qPCR檢測穩定轉染后Twist mRNA表達情況 穩定轉染細胞株建立后，實驗組較對照組細胞的Twist mRNA表達水平提高了2.1倍，實驗組明顯高于對照組(P<0.01)，見圖5。

圖2 劃痕實驗檢測12 h和24 h兩組細胞的愈合率(×100)Fig.2 Healing rate of two groups of cells was detected by scratch test after 12 h and 24 h(×100)Note: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

圖3 Transwell小室檢測兩組細胞24 h細胞穿膜細胞數(×100)Fig.3 Cell transmembrane number of two groups of cells was detected by transwell assay after 24 h(×100)Note: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

圖4 Western blot檢測兩組細胞E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表達Fig.4 Expression of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein in two groups of cells was detected by Western blotNote: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

圖5 RT-qPCR檢測穩定轉染后兩組細胞Twist mRNA表達情況Fig.5 Expression of Twist mRNA in two groups after stable transfection was detected by RT-qPCRNote: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

圖6 Western blot檢測兩組穩定轉染細胞Twist蛋白表達Fig.6 Expression of Twist protein in two groups of cells was detected by Western blotNote: Compared with SW480-NC，*.P<0.01.

2.7 Western blot檢測Twist蛋白表達情況 穩定轉染細胞株建立后，實驗組和對照組中Twist蛋白表達相對水平分別為(0.68±0.02)與(0.40±0.02)，實驗組較對照組顯著增高(P<0.01)，見圖6。

3 討論

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是發病率及死亡率均較高的惡性腫瘤[6]，術后復發、轉移是其治療失敗的主要原因。研究發現EMT與惡性腫瘤復發、轉移密切相關[7]。EMT指的是一個復雜的分子和細胞程序，在這一過程中，上皮細胞失去細胞的極性及細胞間黏附能力，且使得細胞缺乏運動的特性，而獲得間質細胞的特性，如運動能力、侵襲力及抗凋亡的能力[8]。EMT的發生由腫瘤微環境中的間質細胞釋放相關信號激活EMT轉錄因子而觸發。參與EMT的轉錄因子包括Snail、Slug、Twist等[9]。EMT的主要特征是上皮表型的缺失及間質特性的獲得。上皮細胞的標記物包括E-cadherin、Claudin-1等，而間質的標記物有：N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等[9]。

Oct4對ES及CSC均有維持其干細胞特性的作用[1,2]，研究還發現Oct4也參與腫瘤EMT過程的調控：Yin等[2]發現在肝癌細胞中Oct4可協同Nanog通過激活STAT3/Snail信號通路增強其遷移、侵襲及增殖的能力，EMT轉錄因子Twist、Snail及Slug蛋白表達升高，上皮標記物E-cadherin蛋白表達下調，而間質標記物N-cadherin 及Vimentin蛋白表達上調，誘導了EMT發生；Dai等[10]發現在CRC SW620細胞中沉默Oct4基因表達可減弱其遷移和侵襲能力，使E-cadherin蛋白表達上調，vimentin蛋白表達下調，發生了EMT逆轉。人Oct4基因按所編蛋白N端差異把它分為3個主要的亞型Oct4A、Oct4B和Oct4B1，之前對Oct4的研究集中在Oct4A上，Oct4B1是最近才發現的Oct4的轉錄本， Papamichos等[11]認為Oct4B1在維持ES干細胞特性方面的作用比Oct4A更強。研究發現Oct4B1在胃癌、結直腸癌等惡性腫瘤中表達，具有抗腫瘤細胞凋亡的作用[4,5]。而Oct4B1是否在腫瘤細胞EMT過程中起調控作用，目前鮮見文獻報道。

為了明確Oct4B1是否誘導結直腸癌細胞發生EMT，我們實施了下列實驗：首先用帶G418抗性的Oct4B1過表達質粒及陰性對照質粒轉染結直腸癌SW480細胞，瞬時轉染成功后，予G418篩選成功建立穩定轉染的細胞株，用RT-qPCR檢測發現實驗組(穩定轉染Oct4B1過表達質粒)Oct4B1的mRNA水平表達明顯高于轉染陰性對照質粒的對照組(P<0.01)(見圖1B)，提示我們所建立的Oct4B1過表達穩定轉染細胞株是成功的；接下來研究發現，劃痕實驗中實驗組傷口愈合率明顯高于對照組(P<0.01)(見圖2)，Transwell小室實驗中實驗組細胞穿膜數顯著高于對照組(P<0.01)(見圖3)，提示過表達Oct4B1基因增強了SW480細胞遷移和侵襲能力；進一步研究發現，Western blot檢測實驗組上皮標記物E-cadherin蛋白表達明顯低于對照組(P<0.01)，而間質標記物N-cadherin和Vimentin蛋白表達均明顯高于對照組(P<0.01)(見圖4)。以上實驗結果表明過表達Oct4B1基因可誘導人結直腸癌SW480細胞發生EMT，細胞遷移和侵襲能力提高可能與EMT發生有關。我們進一步采用RT-qPCR及Western blot檢測EMT轉錄因子Twist mRNA及蛋白的表達，結果實驗組Twist的mRNA及蛋白水平均明顯高于對照組(見圖5、6)。提示過表達Oct4B1基因誘導SW480細胞發生EMT，其機制可能與提高Twist表達有關。

綜上所述，我們的研究顯示過表達Oct4B1基因可誘導人結直腸癌SW480細胞發生EMT，增強細胞遷移及侵襲能力，其分子機制可能與提高Twist表達有關。

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[收稿2016-11-03]

(編輯 倪 鵬)

Overexpression of Oct4B1 induces epithelial mesenchymal transition in colorectal cancer SW480 cells

CHENYi-Lin,WENKun-Ming,HUShui-Qing,CHENZheng-Quan,ZENGQing-Liang.

DepartmentofGastrointestinalSurgery,theAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China

Objective:To investigate whether the overexpression of Oct4B1 gene induces epithelial mesenchymal transition in human colorectal cancer SW480 cells and its possible mechanism.Methods: Experimental group(SW480-Oct4B1)：Transfection of SW480 cell lines in colorectal cancer with Oct4B1 overexpression plasmid;Control group(SW480-Oct4B1):negative control plasmid with G418 resistance.Stably transfected cell lines were obtained by G418 culture medium.The two groups were compared with：①Detection of Oct4B1 gene expression in stably transfected cell lines by RT-qPCR；②Scratches and Transwell assays were used to estimate migration and invasion;③Detection of EMT related markers E-cadherin，N-cadherin and Vimentin protein expression by Western blot assay;④Detection of Twist gene and protein expression by RT-PCR and Western blot assays.Results: The transient transfection was confirmed by RT-qPCR and the stable transfected cell lines were obtained from two groups of cells transfected with G418 culture medium.Compared with the control group:①RT-qPCR revealed increased expression of Oct4B1 gene in the experimental group(P<0.01);②Cell migration and invasion were significantly increased(P<0.01);③Epithelial marker:the expression of E-cadherin protein was significantly decreased (P<0.01),interstitial marker:the expression of N-cadherin and Vimentin protein was significantly increased (P<0.01);④Twist mRNA and protein expression were significantly increased(P<0.01).Conclusion: Overexpression of Oct4B1 gene can induce epithelial mesenchymal transition in human colorectal cancer SW480 cells，its molecular mechanism may be related to the promotion of Twist expression.

Colorectal cancer cells;Oct4B1;Epithelial-mesenchymal transitions;Twist

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.004

①本文受國家自然科學基金(No.81260369)和貴州省科技廳科學技術基金[黔科合(J)字(2012)2365]資助。

陳奕霖(1988年-)，男，碩士，住院醫師，主要從事大腸癌基礎與臨床方面研究，E-mail：254575402@qq.com。

及指導教師：文坤明(1978年-)，男，博士，教授，主要從事大腸癌基礎與臨床方面研究，E-mail：381224619@qq.com。

R735.3+5

A

1000-484X(2017)05-0656-05