TLR4基因敲除對小鼠內臟脂肪組織免疫細胞及脂肪因子的影響①

孟曉燕 張國俊 楊 燦 劉國燕 王秀麗 宋向鳳

(新鄉醫學院基礎醫學院/河南省分子診斷與醫學檢驗技術協同創新中心，新鄉453003)

TLR4基因敲除對小鼠內臟脂肪組織免疫細胞及脂肪因子的影響①

孟曉燕 張國俊 楊 燦 劉國燕 王秀麗 宋向鳳

(新鄉醫學院基礎醫學院/河南省分子診斷與醫學檢驗技術協同創新中心，新鄉453003)

目的：探討TLR4基因敲除對小鼠免疫細胞及脂肪因子的影響。方法：取20周齡的雄性野生型C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠的脾臟和附睪脂肪組織，分離細胞，用流式檢測F4/80、CD11b、CD11c、CD3、CD4、CD8分子的表達；qPCR檢測附睪脂肪組織內IL-6、HMGB1、TNF-α、脂聯素和抵抗素的表達。結果：與野生型C57BL/6小鼠相比，TLR4-/-小鼠脾臟和附睪脂肪組織中M1型(F4/80+CD11b+CD11c+)巨噬細胞比例上升(P<0.05)，M2型(F4/80+CD11b+CD11c-)巨噬細胞比例下降(P<0.05)，這種趨勢在附睪脂肪組織中表現更為顯著。同時發現附睪脂肪組織中CD4+T細胞比例下降(P<0.05)，CD8+T細胞比例上升(P<0.05)；IL-6、HMGB1、抵抗素表達升高(P<0.05)；TNF-α和脂聯素表達降低(P<0.05)。結論：TLR4基因敲除可導致內臟脂肪組織脂肪因子和免疫細胞的紊亂。

Toll樣受體4；脂肪因子；巨噬細胞；T淋巴細胞

肥胖相關的慢性炎癥是內臟脂肪組織發生胰島素抵抗的始動因素[1]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類主要的模式識別受體，目前在哺乳動物中已經發現的TLR有13種[2]。TLR4是最早發現也是研究最深入的TLR，主要分布在單核細胞、巨噬細胞、NK細胞和脂肪細胞的胞膜上[3]，與配體結合后可通過NF-κB信號途徑生成并釋放大量的促炎細胞因子。近年來研究表明食物中的飽和脂肪酸可通過與TLR4結合激活相關信號通路，若缺失TLR4基因，可緩解高脂飲食誘導的小鼠肥胖和胰島素抵抗的發生[4]。但TLR4基因缺失的小鼠其內臟脂肪組織中免疫細胞及脂肪因子如何改變少見報道，本研究探討TLR4基因敲除對小鼠附睪脂肪組織中免疫細胞及脂肪因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 FITC-anti-CD11b、APC-anti-F4/80、PE-anti-CD11c、PE-cy5.5-anti-CD4、V500-C-A-anti-CD8、PE-cy7-anti-CD3流式抗體購于達科為生物技術公司；膠原酶Ⅱ購于Sigma 公司；RPMI1640培養基購于Gibco；RNAiso Plus試劑和M-MLV逆轉錄酶購于TaKaRa公司；qPCR試劑盒購于Thermo fisher； 引物由Introvigen 公司合成；TLR4-/-小鼠由北京協和醫學院韓代書教授饋贈；小鼠常規飼養，保持室內溫度在22～26℃，濕度40%～60%，隨意自由飲水和給予標準飼料進食。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和qPCR 取0.1 g附睪脂肪組織于液氮預冷的研缽中，研磨成粉末狀，加入1 ml RNAiso Plus試劑研磨至液體，按照TaKaRa公司RNAiso Plus試劑說明書操作步驟提取總RNA；按照TaKaRa公司M-MLV逆轉錄酶試劑盒說明書操作步驟逆轉錄RNA獲取cDNA；應用SYBR Green 熒光嵌合法在ABI PRISM 7500 Real-time cycler 進行qPCR實驗。用相對定量的方法，測定目的基因及內參基因PCR產物熒光強度達到一定值所需Ct值，用2-ΔΔCt方法計算各基因相對表達量。

1.2.2 脂肪組織內細胞的分離及流式檢測 取小鼠附睪脂肪組織0.2 g，剪碎后加入1 mg/ml的Ⅱ型膠原酶2 ml，消化(37℃，1.5 h)，離心(4℃，1 000 r/min，5 min)，取沉淀中的細胞，用PBS洗滌2次，分別用F4/80、CD11b、CD11c、CD3、CD4、CD8抗體冰上孵育30 min，洗滌抗體，進行流式檢測。

1.2.3 脾臟內細胞的分離及流式檢測 取小鼠脾臟，用毛玻璃片研磨分離細胞，加4 ml RPMI1640培養基混勻，取100 μl細胞懸液，分別用F4/80、CD11b、CD11c抗體冰上孵育30 min，洗滌抗體，進行流式檢測。

2 結果

2.1 TLR4基因敲除對附睪脂肪組織內巨噬細胞的影響 與野生型C57BL/6小鼠相比，TLR4基因敲除小鼠附睪脂肪組織內M1型(F4/80+CD11b+CD11c+)巨噬細胞比例上升(P<0.05)，M2型(F4/80+CD11b+CD11c-)巨噬細胞比例下降(P<0.05，圖1)。

2.2 LR4基因敲除對附睪脂肪組織內T淋巴細胞 與野生型C57BL/6小鼠相比，TLR4基因敲除小鼠附睪脂肪組織內CD4+T細胞比例下降(P<0.05)，但CD8+T細胞比例上升(P<0.05，圖2)。

2.3 TTLR4基因敲除對脾臟巨噬細胞的影響 與野生型C57BL/6小鼠相比，TLR4基因敲除小鼠脾臟內M1型(F4/80+CD11b+CD11c+)巨噬細胞比例上升(P<0.05)，M2型(F4/80+CD11b+CD11c-)巨噬細胞比例下降(P<0.05,圖3A)；同時發現附睪脂肪組織中M1/M2比脾臟中M1/M2升高更顯著(圖3B)。

2.4 TLR4基因敲除對附睪脂肪組織內脂肪因子的影響 與野生型C57BL/6小鼠相比，TLR4基因敲除小鼠附睪脂肪組織內Resistin、IL-6和HMGB1表達升高(P<0.05)，TNF-α和Adiponectin表達降低(P<0.05)，見圖4。

圖1 TLR4基因敲除對附睪脂肪組織內巨噬細胞的影響Fig.1 Effect of TLR4 knockout on macrophages in epididymal adipose tissueNote: *.P<0.05 compared with WT mice.

圖2 TLR4基因敲除對附睪脂肪組織內T淋巴細胞亞群的影響Fig.2 Effect of TLR4 knockout on T cells in epididymal adipose tissueNote: *.P<0.05 compared with WT mice.

圖3 TLR4基因敲除對脾臟巨噬細胞的影響Fig.3 Effect of TLR4 knockout on macrophages in spleenNote: A.M1 and M2 macrophage in spleen;B.M1/M2 ratio in spleen and epididymal adipose tissue.

圖4 TLR4基因敲除對附睪脂肪組織內脂肪因子的影響Fig.4 Effect of TLR4 knockout on adiponeckines in epididymal adipose tissueNote: *.P<0.05 compared with WT mice.

3 討論

脂肪組織不僅是機體儲存能量的“倉庫”，而且能分泌大量的脂肪因子[5]。脂肪組織中也存在大量的免疫細胞，對維持脂肪組織的炎癥平衡具有重要的調節作用。T淋巴細胞和巨噬細胞是脂肪組織內兩群重要的免疫細胞。巨噬細胞根據其生物學作用可分為M1促炎型巨噬細胞和M2抗炎型巨噬細胞兩大類[6]。T細胞根據其表面分化抗原的表達可分為CD4+T細胞和CD8+T細胞[7]。我們的結果發現，TLR4基因敲除后，小鼠脾臟和附睪脂肪組織中的M1型巨噬細胞比例上升，M2型巨噬細胞比例下降，并且這種現象在附睪脂肪組織更為明顯。與野生型小鼠相比， TLR4-/-小鼠的附睪脂肪組織中CD4+T細胞減少，CD8+T細胞增多；IL-6的表達明顯上調，這些結果提示TLR4基因敲除可使機體尤其是內臟脂肪組織處于低度炎癥狀態，免疫細胞的數量和比例失調。脂聯素是脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性多肽或蛋白質，能改善小鼠的胰島素抗性和動脈硬化癥；抵抗素是由脂肪細胞分泌的一種多肽類激素，被認為可引起胰島素抵抗，與肥胖病、2型糖尿病的發病存在著密切關系[8]。本結果發現，TLR4基因敲除可使內臟脂肪組織內脂聯素表達下調、抵抗素表達上調。但有意思的是TNF-α的表達在TLR4-/-小鼠的內臟脂肪組織是下調的，這種機制值得進一步研究。

高遷移率族蛋白1(High mobility group,HMGB1)是高度保守的核蛋白，廣泛分布于哺乳動物細胞中。HMGB1是一種重要的晚期致炎因子，近年來已成為研究熱點之一[9,10]。目前研究顯示脂肪細胞可以產生HMGB1，在機體慢性低度炎癥的發生發展中發揮著至關重要的作用[11]，通過qPCR發現TLR4-/-小鼠的內臟脂肪組織中HMGB1的表達升高，這進一步提示TLR4基因敲除可影響炎癥因子的分泌，導致機體的內環境紊亂。HMGB1的受體之一是TLR4，那么TLR4的敲除對HMGB1-TLR4信號通路和肥胖的影響是下一步研究的方向。

[1] Jagannathan-Bogdan M,McDonnell ME,Shin H,etal.Elevated proinflammatory cytokine production by a skewed T cell compartm-ent requires monocytes and promotes inflammation in type 2 diabetes [J].J Immunol,2011,186(2):1162-1172.

[2] Hua Z,Hou B.TLR signaling in B-cell development and activation[J].Cell Mol Immunol,2013,10(2):103-106.

[3] Pahwa R,Devaraj S,Jialal I.The effect of the accessory proteins,soluble CD14 and lipopolysaccharide-binding protein on Toll-like receptor 4 activity in human monocytes and adipocytes[J].Int J Obes(Lond),2016,40(6):907-911.

[4] Pierre N,Deldicque L,Barbé C,etal.Toll-like receptor 4 knockout mice are protected against endoplasmic reticulum stress induced by a high-fat diet[J].PLoS One,2013,8(5):e65061.

[5] 馬祎喆，周紅文.免疫細胞在脂肪組織炎癥中的調控作用[J].南京醫科大學學報(自然科學版)，2016，36(1)：19-25.

[6] Wynn TA,Chawla A,Pollard JW.Macrophage biology in development, homeostasis and disease[J].Nature,2013,496(7446):445-455.

[7] Vieira Braga FA,Hertoghs KM,van Lier RA,etal.Molecular characterization of HCMV-specific immune responses: Parallels between CD8(+) T cells,CD4(+)T cells,and NK cells[J].Eur J Immunol,2015,45(9):2433-2445.

[8] Parvaresh Rizi E,Teo Y,Leow MK,etal.Ethnic differences in the role of adipocytokines linking abdominal adiposity and insulin sensitivity among asians[J].J Clin Endocrinol Metab,2015,100(11):4249-4256.

[9] Wang X,Xiang L,Li H,etal.The role of HMGB1 signaling pathway in the development and progression of hepatocellular carcinoma:a review[J].Int J Mol Sci,2015,16(9):22527-22540.

[10] Hu Z,Wang X,Gong L,etal.Role of high-mobility group box 1 protein in inflammatory bowel disease[J].Inflamm Res,2015,64(8):557-563.

[11] 張國俊，于莉莉，宋向鳳.HMGB1與脂肪組織炎癥[J].中國免疫學雜志，2016，32(8)：1228-1231.

[收稿2016-08-26 修回2016-10-31]

(編輯 許四平)

Effects of TLR4 knockout on immune cells and adipokines in mouse visceral adipose tissue

MENGXiao-Yan,ZHANGGuo-Jun,YANGCan,LIUGuo-Yan,WANGXiu-Li,SONGXiang-Feng.

SchoolofBasicMedicalSciences,XinxiangMedicalUniversity/HenanCollaborativeInnovationCenterofMolecularDiagnosisandLaboratoryMedicine,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China

Objective:To investigate the effects of TLR4 knockout on immune cells and adipokines in mouse visceral adipose tissue.Methods: Cells were isolated from the spleen and epididymal adipose tissue of 20-week-old male wild type mice C57BL/6 and TLR4-/-.The expression of F4/80,CD11b,CD11c,CD3,CD4 and CD8 in these cells were analyzed by flow cytometry.The expression of IL-6,HMGB1,TNF-α,adiponectin and resistin in epididymal adipose tissue were detected by qPCR.Results: Compared with wild type C57BL/6 mice,the percentage of M1 macrophage which marked F4/80+CD11b+CD11c+in spleen and epididymal adipose tissue of TLR4-/-mice increased(P<0.05) greatly,while that of M2 macrophage which marked F4/80+CD11b+CD11c-was decreased(P<0.05)significantly.This trend was more remarkable in epididymal adipose tissue than in spleen(P<0.05).In epididymal adipose tissue,the percentage of CD4+T cells decreased but that of CD8+T cells increased in TLR4-/-mice.Moreover,the high-level expressions of IL-6,HMGB1,resistin were found in epididymal adipose tissue of TLR4-/-mice.However,the expressions of TNF-α and adiponectin decreased obviously.Conclusion: TLR4 knock-out could lead to a disorder in adipokine and immune cells in visceral adipose tissue.

Toll like receptor 4;Adipokine;Macrophage;T lymphocyte cell

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.006

①本文為2015年地方高校國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201510472002)、河南省自然科學基金(162300410225)(14A310016)和河南省教育廳科學技術研究重點項目(14A310016)。

孟曉燕(1993年-)，女，主要從事代謝與免疫方面的研究，E-mail：858298626@qq.com。

及指導教師：宋向鳳(1970年-)，女，博士，教授，主要從事代謝與免疫的研究，E-mail：xiangfsong@163.com。

R392.11

A

1000-484X(2017)05-0665-03