Th22細胞及其功能分子IL-22在狼瘡性腎炎中的作用研究

顧麗萍 楊貴麗 陳幼發 陶書超

(武漢科技大學醫院內科，武漢430065)

Th22細胞及其功能分子IL-22在狼瘡性腎炎中的作用研究

顧麗萍 楊貴麗①陳幼發②陶書超③

(武漢科技大學醫院內科，武漢430065)

目的：觀察狼瘡性腎炎(LN)患者外周血中的Th22細胞及其功能分子白細胞介素(IL)-22的表達，并探討其意義。方法：選擇系統性紅斑狼瘡患者(無腎臟受累)38例，狼瘡性腎炎患者32例，健康志愿者10例，分別作為SLE組、LN組和健康對照組(HC組)。應用流式細胞儀檢測其外周血中Th22細胞，酶聯免疫吸附實驗檢測患者血清中IL-22的水平。比較三組Th22細胞和血清中IL-22水平差異，分析LN組Th22細胞和IL-22與SLE 疾病活動指數評分(SLEDAI)的相關性。結果：SLE組和LN組患者外周血中Th22細胞較健康對照組明顯升高(P<0.01)，血清中IL-22水平也較健康對照組明顯升高(P<0.01)；Th22和IL-22在LN組較SLE組要稍微高表達，但差異均無統計學意義(P>0.05)；LN組患者Th22細胞比例和IL-22水平與對應患者的疾病活動性評分SLEDAI呈正相關。結論：Th22細胞和其功能分子IL-22參與SLE和LN的發病和進展。

Th22細胞；IL-22；狼瘡性腎炎

系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種自身免疫炎癥性疾病，多發于青年女性，其病因目前尚未完全確定，其臨床癥狀表現多樣，可侵襲機體多個器官組織，腎臟是 SLE 侵襲的主要器官之一，腎臟受累后多表現為腎炎，該疾病稱為狼瘡性腎炎(Lupus nephritis,LN)[1]。LN是SLE的主要并發癥和致死因素之一，發病期間，腎小球系膜細胞大量增生，眾多細胞因子在發病過程中參與并發揮了重要作用[2]。由于LN 發病機制錯綜復雜，有效評價LN 活動性，并給予正確對應的治療方法對于改善患者預后，提高患者生存率極為重要。目前，診斷LN 及判斷其活動性的檢測金標準是腎穿刺活檢病理檢查，但由于其為有創方式，對患者存在或多或少的損害，或由于患者自身條件限制，不能進行廣泛、反復應用。因此，尋找能有效評判LN 活動性的新型指標尤為重要。Th22細胞是一類輔助性T細胞，當機體發生炎癥或被感染時，能產生細胞因子IL-22[3]，作用于組織細胞，誘導產生急性期蛋白，輔助機體產生防御作用。IL-22屬于IL-10家族細胞因子，其受體包括IL-10R2和IL-22R1兩條鏈組成[4]，IL-22結合特異性由IL-22R1決定[4]。IL-22作為一個獨特的細胞因子，多作用于機體組織細胞[4]。因其在自身免疫性疾病與炎性疾病中發揮著重要作用，近年來愈加受到研究者的重視，針對Th22及其細胞因子IL-22在皮膚病(如銀屑病、異位性皮炎等)[5]、炎性腸道疾病(克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎等)[6,7]、感染[8]、腫瘤[9]等疾病中的作用已開展相關性研究，而關于Th22細胞和IL-22在SLE 和LN 中的作用研究尚不多見。故本次研究通過檢測SLE患者外周血Th22和Th17細胞及其相關的細胞因子IL-17和IL-22的水平，并分析它們與疾病的關系，從明確Th22在狼瘡性腎炎中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 收集2014年12月～2015年12月醫院腎臟內科、風濕科、皮膚科共 70例 SLE 住院患者血清，男18例，女52 例，年齡17～51歲?；颊咴\斷參照 2009年美國風濕病協會(ACR)修訂的 關于SLE 的診斷標準[10]，評分標準選用2000年SLE活動指數(SLE disease activity index,SLEDAI-2000)[11]。70 例患者中有 32 例經腎活檢確診為LN且每例腎組織切片中至少有8個腎小球，設為LN組，其余38例患者設為SLE組。收集 10 例門診健康體檢者(各項生化指標正常，自身抗體陰性，無腎臟疾病、皮膚病、糖尿病、高血壓、風濕免疫等疾病)作為健康對照組(HC組)，其中男 2例，女 8例，年齡 20～ 45歲。所有患者及健康志愿者3個月內無免疫試劑使用史，研究對象均簽署知情同意書。本實驗符合道德倫理委員會的要求，并均采集外周靜脈血以備實驗。

1.1.2 實驗試劑 鼠抗人 IFNγ-FITC、鼠抗人IL-17-Alexa Fluor(美國 BD 公司)；鼠抗人 CD4-PerCP(美國 Becton Dickinson)；鼠抗人IL-22-PE(美國 minneapolis)；人IL-22 ELISA 試劑盒(美國 R&D 公司)；淋巴細胞分離液(中國科學院生物工程研究所-灝洋生物)。

1.1.3 臨床資料收集 收集受試對象一般臨床資料，具體包括性別、年齡、發熱、皮疹、雷諾現象、關節疼痛等基本情況，SLEDAI 評分以及實驗室檢測項目的檢測結果。實驗室檢測項目包括：血常規、尿常規、抗雙鏈DNA 抗體(anti-double-stranded DNA，dsDNA)、抗 Sm 抗體、抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)、超敏 C反應蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)、血清補體 C3、C4、免疫球蛋白等。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細胞亞群檢測 采集SLE患者和健康志愿者2 ml肘靜脈血，用新鮮肝素鈉抗凝，1 500 r/min離心5 min去除血漿，吸取淋巴細胞分離液4 ml 放入10 ml 離心管中，1 700 r/min離心30 min后，吸取中間白膜層(即單核細和淋巴細胞富集層)，放入恒溫箱繼續孵育 4 h。然后加入熒光標記的表面抗體 anti-CD4-PerCP 4 μl，避光孵育30 min后去上清液，再向兩試管中分別加入破膜劑 B 50 μl，熒光標記的抗體：anti-IFNγ-FITC、anti-IL-22-PE、anti-IL-17-Alexa Fluor 各 1 μl，24 h內使用FACSCalibur流式細胞儀檢測。Th22細胞的標記為IFN-γ-IL-17-IL-22+CD4+，Th1細胞標記為 IFN+CD4+。

1.2.2 細胞因子檢測 采用 ELISA(酶聯吸附法)檢測各組患者血清IL-22的含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 各組樣本的基本信息 HC組、SLE患者和LN患者的一般信息和臨床特點見表1。3組患者年齡、性別比較差異不明顯(P>0.05)，SLE組和LN組CRP、ESR、WBC顯著高于HC組，而C3、C4顯著低于HC組，差異均有統計學意義(P<0.05)，而SLE組和LN組兩組間上述指標比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組患者Th1和Th22細胞測定結果 利用流式細胞術檢測LN組、SLE組和健康對照組患者外周血Th1和Th22細胞的流式計數。SLE患者、LN患者以及健康對照組代表性流式圖及設門見圖1A。結果表明SLE組、LN組和健康對照組患者Th1細胞表達頻率分別為(SLE：10.07±0.27，LN：10.86±0.27，HC：10.13±0.45)，3組之間差異無明顯統計學意義；而Th22在LN組較SLE組要稍微高表達(6.92±0.47 vs 5.87±0.36，P=0.056)，差異無統計學意義，兩組患者Th22的表達頻率均較健康對照組(2.69±0.23)要高表達，差異有明顯統計學意義(P<0.001)，見圖1B。

表1 各組患者的臨床和實驗室基本信息

Tab.1 Clinical and laboratory characteristics of subjects

ClinicalandlaboratorycharacteristicsHC(n=10)SLE(n=38)LN(n=32)Sex(M/F)2/87/3111/21Years(y)33.24±13.6735.67±10.2337.23±8.34SLEDAI(score)ND28±6.5133±10.24Anti-dsDNAnegative(n)ND3432Anti-Smnegative(n)ND1013ANAnegative(n)ND3028CRP(mg/L)7.2±3.4045.67±25.861)48.24±30.781)ESR(mm/h)2±1.8056±381)63±321)C3(U/ml)0.9±0.340.32±0.351)0.25±0.311)C4(U/ml)0.31±0.210.08±0.071)0.09±0.041)Whitebloodcell(×109L-1)4.24±2.317.28±3.651)8.56±4.311)

Note：Compared with HC group,1)P<0.05.

圖1 Th1和Th22細胞在SLE、LN和健康對照組外周血中的表達Fig.1 Frequencies of peripheral blood Th1 and Th22 cells in patients with SLE，LN and healthy controls

圖2 各組患者血清IL-22的表達Fig.2 Plasma level of IL-22 in patients with LN，SLE and healthy controls

2.3 各組患者血清IL-22水平 ELISA測定3組患者血清IL-22的表達，見圖2。結果表明，LN組患者血清IL-22較SLE組升高，差異沒有明顯統計學意義(59.92±2.69 vs 52.51±2.45，P=0.05)；LN組和SLE組患者血清IL-22水平均較HC組(40.43±2.98)明顯升高，差異有明顯統計學意義(P<0.05)。

2.4 Th22細胞與IL-22相關性分析 將LN患者Th22細胞表達頻率與血清IL-22的水平進行相關性分析，結果發現LN患者Th22細胞比例與血清IL-22水平呈正相關(r=0.80，P<0.001)，見圖3。

圖3 Th22細胞與血清IL-22水平相關性分析Fig.3 Correlation between Th22 cells and plasma IL-22 level in patients with LN

圖4 Th22細胞比例和血清IL-22水平與患者SLEDAI評分相關性分析Fig.4 Correlation between Th22 or plasma IL-22 level and SELDAI in patients with LN

2.5 Th22細胞和IL-22與SLEDAI評分相關性分析 我們進一步對LN患者Th22細胞比例和IL-22血清水平與患者對應的SLEDAI評分進行相關性分析，結果表明Th22細胞比例與IL-22血清水平和SLEDAI評分均呈正相關(r=0.34、0.45，P<0.05)，結果見圖4。

3 討論

SLE是一種累及多系統、多器官的自身免疫性疾病，身體的各個部位均可受損害，腎臟作為自身免疫性疾病的靶向器官，由于血管豐富，在血管壁上引起炎性反應，使腎臟成為SLE最易受累的臟器，形成LN[12]。目前，臨床上LN的治療主要采用給予激素和免疫抑制劑的方式，但只能使病情得到一定的緩解，而且有較大的毒副作用。因此，明確LN的發病機制，借此尋求有效治療措施有著重要的社會意義。

LN是由多種免疫復合物沉積和激活而引發的一種腎炎。之前很多研究發現,LN患者機體的免疫炎癥反應主要是由機體炎癥因子和免疫因子共同激活引起的[13,14]。另外之前的研究發現，由于疾病導致機體免疫炎癥紊亂，Th 細胞及其分泌的相應功能性因子激活進一步引起反應性 B 細胞活化，致病性自身抗體和炎癥因子大量產生，最終導致患者組織和器官的損傷[15]。Th22細胞是學者們最近新發現的一種獨立Th 細胞亞群，能夠分泌功能性細胞因子IL-22[16]。Th22細胞在自身免疫病和炎癥性疾病中發揮重要作用，主要通過Th22細胞激活后分泌大量的IL-22實現[17,18]。IL-22作用靶器官主要為患者皮膚和腎臟等，例如在銀屑病中，IL-22介導了患者的皮膚病病灶組織中的免疫細胞與角質形成細胞等上皮細胞間的相互作用[19]。根據以上理論基礎，本課題比較了SLE、LN患者與健康對照之間Th22細胞及相關細胞因子IL-22表達水平的差異；分析了LN 患者Th22與相關細胞因子、疾病活動性和患者臨床指標之間的相關性。

我們的研究發現SLE患者和LN患者外周血中Th22細胞的表達頻率均明顯高于健康對照組。另外我們發現LN患者外周血中Th22細胞的比例較SLE患者要有所增高，目前的樣本分析差異沒有明顯統計學意義。然而這也提示我們Th22細胞的表達頻率與SLE患者疾病的進展和活動度有一定的關系。進一步我們分析LN患者Th22細胞比例與對應患者的疾病活動性評分SLEDAI之間呈正相關。同時我們檢測其功能分子IL-22，發現SLE、LN患者血清中IL-22的水平較健康對照組明顯升高，相應的IL-22的血清水平在LN患者中較SLE患者要高。我們分析LN患者IL-22的水平與SLEDAI的相關性，發現IL-22的血清水平與SELDAI呈正相關。這些結果與Qin等[20]的研究一致。且這些研究告訴我們Th22細胞及其功能分子IL-22參與了SLE和LN疾病的發生和進展機制。

綜上所述，本次研究初步分析了Th22細胞與IL-22在LN患者中的表達，并且進一步分析了Th22和IL-22與LN患者臨床疾病活動度SEDAI的關系，我們的研究為LN的發病機制提供了一些免疫方向的思索。接下來我們會進一步研究是否能夠通過調節Th22細胞和IL-22改變 LN患者發病時以及疾病加重時異常的免疫狀態，為 SLE或者LN 的防治提供新的治療靶點。

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[收稿2016-10-26]

(編輯 倪 鵬)

Study on role of Th22 cells and its functional cytokine IL-22 in lupus nephritis

GULi-Ping,YANGGui-Li,CHENYou-Fa,TAOShu-Chao.

DepartmentofInternalMedicine,HospitalofWuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430065,China

Objective:To observe the expressions of Th22 cells and IL-22 in peripheral blood of patients with Lupus nephritis (LN) and explore its significance.Methods: Patients of systemic lupus erythematosus (SLE) with no renal involvement (n=38),lupus nephritis (n=32) and healthy controls (n=10) were studied.Flow cytometry was utilized to quantify the percentage of Th22 cells in peripheral blood.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the levels of serum IL-22.The Th22 cells and The serum level of IL-22 among three groups were compared,and the correlation between Th22,IL-22 and SLE disease activity index score (SLEDAI) was analyzed.Results: Th22 cells in SLE group and LN group were significantly higher than those in healthy control group (P<0.01).Serum IL-22 level was also significantly higher than that of healthy control group (P<0.01);Th22 and IL-22 LN group were slightly higher than that in SLE group,but the difference was not significant (P>0.05).The proportion of Th22 cells and the level of IL-22 in LN group were positively correlated with the disease activity score SLEDAI.Conclusion: Th22 cells and IL-22 may play an important role in the pathogenesis of SLE and LN.

Th22 cells;IL-22;Lupus nephritis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.025

顧麗萍(1966年-)，女，主治醫師，主要從事內科疾病的診治工作，E-mail：guliping487@163.com。

R593.24+2

A

1000-484X(2017)05-0755-04

①通訊作者，E-mail：ygl473@163.com。

②武漢科技大學附屬天佑醫院腎病科，武漢430070。

③棗陽市第一人民醫院檢驗科，棗陽441200。