瘦素受體基因Gln223Arg位點多態性與哮喘和代謝綜合征之間關系的研究

高俊杰 秦 苗 徐瑞金 張 靜 葛云潔

(青島市市立醫院干部保健科，青島266071)

瘦素受體基因Gln223Arg位點多態性與哮喘和代謝綜合征之間關系的研究

高俊杰 秦 苗①徐瑞金 張 靜 葛云潔

(青島市市立醫院干部保健科，青島266071)

目的：探討瘦素受體基因Gln223Arg位點多態性與哮喘和代謝綜合征之間的關系。方法：選擇120例哮喘病人(A)、92例代謝綜合征病人(M)、54例哮喘合并代謝綜合征病人(A+M)和81例健康對照者(NC)，其中哮喘組根據肺功能進一步分為輕-中度哮喘組和重度哮喘組。應用聚合酶鏈反應-限制性內切酶片段長度多態性(PCR-RFLP)方法測定所有受試者瘦素受體基因Gln223Arg位點基因型，ELISA法檢測血清瘦素濃度，同時測定所有受試者BMI、血壓、肺功能及空腹血糖。結果：①代謝綜合征組和哮喘合并代謝綜合征組AA+AG基因型和A等位基因頻率較健康對照組顯著性增高(P<0.05)；②哮喘組中重度持續組AA+AG基因型和A等位基因頻率較健康對照組顯著增高(P<0.05)；③AA+AG基因型的血漿瘦素濃度、MBI、收縮壓與GG基因型比均顯著升高，FEV1%、FEV1/FVC明顯下降(P<0.05)。結論：瘦素受體Gln223Arg位點基因多態性與哮喘和代謝綜合征具有相關性，其中A等位基因可能通過瘦素抵抗誘導哮喘和代謝綜合征的發生，是哮喘和代謝綜合征的共同遺傳易感因子。

哮喘；代謝綜合征；瘦素；瘦素受體；基因多態性

支氣管哮喘是一種多基因遺傳性疾病，其疾病的發生和進展受遺傳和環境等多種因素影響，機制復雜，目前尚未完全闡明。近年來人們發現，肥胖患者的哮喘發病率較正常體重者明顯升高[1,2]。瘦素是人體內影響能量代謝和體重的重要激素。研究表明，瘦素作為一種促炎激素，在哮喘的發病過程中也發揮了重要作用。瘦素通過和瘦素受體結合發揮其生物學作用，瘦素受體基因的突變可能會影響瘦素受體的生物學功能，從而導致瘦素抵抗。本研究通過對哮喘和代謝綜合征患者瘦素受體基因Gln223 Arg位點多態性的研究，旨在在分子水平上探討哮喘和代謝綜合征的發病機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 所有研究對象均為相互間無血緣關系的青島地區漢族居民，排除肝、腎、血液及免疫系統疾病。選擇2010年1月至2015年7月于青島市市立醫院住院或門診就診的單純哮喘病人(A)120例，單純代謝綜合征病人(M)92例，哮喘合并代謝綜合征病人(A+M)54例，其中哮喘病人均符合中華醫學會呼吸病學會2008年頒布的《支氣管哮喘防治指南》中哮喘的診斷標準，代謝綜合征病人均符合2005年國際糖尿病聯盟代謝綜合征定義共識。單純哮喘組病人根據病情嚴重程度分為輕-中度組和重度組。健康對照組(NC)81例，均為健康志愿者，無哮喘及其他過敏性疾病病史。所有參加本研究者均簽署知情同意書，本試驗符合1983年頒布的赫爾辛基宣言，獲得青島市市立醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 人體參數采集 每例研究對象均由專人測量身高和體重，計算BMI，測量收縮血壓(SBP)和舒張壓(DBP)，并進行肺功能測定，包括一秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1%)和一秒呼氣容積與用力肺活量比值(FEV1/FVC)。

1.2.2 標本收集 所有研究對象均抽取空腹靜脈血4 ml，EDTA-K2抗凝，將血漿分離后置-80℃冰箱保存。應用DNA提取試劑盒(Promega公司，美國)按照說明書從血細胞中提取基因組DNA。提取后的DNA應用微量核酸蛋白測定儀(NanoVue超微量分光光度計，英國)進行定性、定量分析，若紫外光吸收值A260/280>1.8，則DNA純度合格。定量后的DNA置-80℃冰箱保存備用。

1.2.3 物合成 聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)的引物參考Genebank中提供的基因組序列設計合成，上游引物序列為：5′-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATAG-3′，下游引物序列為：5′-AGCTAGCAAATATTTTTGTAAGAATT-3′。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.4 CR擴增 PCR反應體系總體積25 μl，包括10×反應緩沖液2.5 μl、基因組DNA2 μl、前后引物各1 μl、MgCl2(2.0 mmol/L)1.5 μl、dNTPs 0.5 μl、Taq DNA聚合酶0.15 μl，以滅菌雙蒸水補足至25 μl(試劑由美國Fermentas公司提供)。PCR反應條件：95℃預變性5 min，然后按95℃變性45 s、48℃退火45 s、72℃延伸60 s，總共循環35次，最后72℃延伸1 min，4℃保存。

1.2.5 增產物限制性片段長度多態性酶切分析(Restriction fragment length polymorphism，RFLP) 總反應體系31 μl，包括10×反應緩沖液2 μl、無核酸水18 μl、擴增產物10 μl和MspⅠ內切酶1 μl，置37℃金屬浴中反應5 min。反應終止后，產物以DL-700DNA片段長度為參考標準，經3%瓊脂糖凝膠電泳，使用全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)觀察酶切后的產物長度并拍照保存。

1.2.6 血漿指標測定 每例研究對象均抽取空腹血送檢驗科檢測空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)。血漿瘦素濃度檢測采用ELISA試劑盒(R&D，美國)檢測，儀器采用Bio-Rad Model 680型酶標儀。

2 結果

2.1 一般資料分析 各組間性別、年齡差別均無統計學意義(P>0.05)，提示各組間具有可比性。代謝綜合征組和哮喘合并代謝綜合征組病人BMI、FBG、SBP、DBP均高于健康對照組和單純哮喘組(P<0.05)。單純哮喘組和哮喘合并代謝綜合征組FEV1%和FEV1/FVC均低于健康對照組和代謝綜合征組(P<0.05，見表1)。

2.2 瘦素受體基因Gln223Arg位點多態性分析 瘦素受體基因Gln223Arg區域PCR產物片段大小為421 bp，經限制性內切酶Msp Ⅰ 酶切后，得到三種基因型：在421 bp處有1條電泳帶的為AA型；在128 bp、293 bp處有兩條電泳帶的為GG型；在128、293、421 bp 處有三條電泳帶的為GA型 (圖1)。

2.3 遺傳平衡性檢驗 采用Hardy-Weinberg平衡檢驗樣本的群體代表性，所有組該位點基因型和等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.4 各組間瘦素受體基因Gln223Arg位點基因型和等位基因分布頻率比較 代謝綜合征組AA+AG基因型和A等位基因頻率與健康對照組比差異具有顯著性(χ2=4.448、4.26，P<0.05)。哮喘合并代謝綜合征組AA+AG基因型和A等位基因頻率與健康對照組比具有差異性(χ2=4.385、4.634，P<0.05)。 單純哮喘組 AA+AG 基因型和A 等位基因頻率與健康對照組比差異無統計學意義(χ2=1.489、1.687，P>0.05)，但是單純哮喘組中重度持續組AA+AG基因型和A等位基因頻率較健康對照組有顯著差異(χ2=4.156、4.027，P<0.05，見表2)。

GroupsnMaleFemaleAge(year)BMI(kg/m2)FBG(mmol/L)SBP(mmHg)DBP(mmHg)FEV1%FEV1/FVCNC414045.23±15.4622.61±2.115.22±0.49119±1171±898.6±12.582.5±8.6M444843.57±13.2226.17±2.971)2)7.02±1.921)2)148±191)2)93±121)2)93.2±16.379.9±8.1A625842.31±14.8521.91±1.985.09±0.53113±1073±973.5±20.91)3)63.2±14.31)3)A+M252943.97±15.6726.75±2.711)2)7.25±2.111)2)150±211)2)98±151)2)71.9±21.21)3)61.8±12.51)3)

Note：BMI.Body mass index;FBG.Fasting blood glucose;SBP.systolic blood pressure；DBP.Diastolic blood pressure.1)vs NC group,P<0.05;2)vs A group,P<0.05;3)vs M group,P<0.05.

表2 各組瘦素受體基因Gln223Arg位點基因型和等位基因分布頻率(%)

Tab.2 Frequency distribution of leptin receptor gene Gln223Arg genotypes and alleles in each groups(%)

GroupsnGenotypeAA(%)AG(%)GG(%)AllelefrequencyA(%)G(%)NC812(2.4)16(19.8)63(77.8)20(12.3)142(87.7)M924(4.3)30(32.6)58(63.1)38(20.7)146(79.3)A1205(4.1)31(25.8)84(70.1)41(17.1)199(82.9)Mild-mediumA773(3.9)16(20.8)58(75.3)22(14.3)132(85.7)SevereA432(4.7)15(34.9)26(60.4)19(22.1)67(77.9)A+M543(5.6)18(33.3)33(61.1)24(22.2)84(77.8)

Note：Mild-medium A.FEV1%>60%;Severe A.FEV1%<60%.

表3 AA+AG與GG基因型血清瘦素濃度和各項臨床指標比較

Tab.3 Comparison of serum leptin level and clinical parameters between AA+AG genotype group and GG genotype group

GroupsnLeptin(ng/ml)MBI(kg/m2)FBG(mmol/L)SBP(mmHg)DBP(mmHg)FEV1%FEV1/FVCAA+AG1452.63±0.8625.13±2.816.53±0.86139±2085±1186.6±22.377.5±17.6GG3222.07±0.7223.07±2.476.31±0.92128±1883±1287.2±26.185.9±18.7P2.5532.2110.5852.3531.2022.1522.877t0.0140.0330.5620.0240.2360.0370.006

圖1 瘦素受體基因Gln223Arg位點PCR-RFLP圖譜Fig.1 PCR-RFLP patterns of leptin receptor gene Gln223ArgNote: L.DL-700DNA ladder;1.Genotype AA;2.Genotype GA;3.Genotype GG.

2.5 AA+AG基因型和GG基因型血漿瘦素濃度、BMI、FBG、血壓、肺功能比較 AA+AG基因型的血漿瘦素濃度、MBI、SBP、FEV1%、FEV1/FVC與GG基因型比差異具有顯著性(t=2.553、2.211、2.353、2.152、2.877，P<0.05)。兩組間FBG、DBP無顯著差異(t=0.585、1.202，P>0.05，見表3)。

3 討論

在過去，支氣管哮喘和代謝綜合征通常被認為是兩種獨立的、互不相關的疾病過程。然而，近年來的流行病學研究發現[3]，代謝綜合征人群的哮喘發病率明顯高于無代謝綜合征人群，兩者的發病具有相關性。進一步研究發現，肥胖患者體內脂肪細胞體積增大或數量增加，可產生大量的細胞因子，使循環或局部組織中脂聯素、瘦素、IL-6、TNF-α等細胞因子濃度的升高，進而導致全身炎癥反應，而這些炎癥反應也是哮喘發生的主要病理生理學基礎[4]。此外，與代謝綜合征相關的其他疾病如脂代謝異常、高血糖、高血壓、睡眠呼吸紊亂等亦存在類似的炎癥反應，從而誘發或加重哮喘[5]。由此我們推測，哮喘和代謝綜合征可能存在共同的致病因素，如共同的致病基因和飲食生活習慣等。

瘦素是由脂肪細胞合成和分泌的一種蛋白質類激素，具有廣泛的生物學效應，其中較重要的是作用于下丘腦的代謝調節中樞，發揮抑制食欲、減少能量攝取、增加能量消耗以及抑制脂肪合成的作用。實驗證實，瘦素的缺少或功能障礙會導致體重的顯著增加和能量代謝紊亂[6]。近年來研究顯示，支氣管哮喘病人血清瘦素的濃度較健康人明顯升高[7]，瘦素在哮喘中的作用逐漸受到人們重視。研究表明，瘦素可以通過增加氣道的高反應性、加重氣道炎癥以及調節Th1/Th2細胞反應[8-10]，進而誘發哮喘發病。因此我們推斷，瘦素的分泌異常或功能障礙，可能是導致哮喘和代謝綜合征的共同因素之一。

瘦素通過與瘦素受體相結合而發揮其生物學功能。瘦素受體屬于Ⅰ類細胞因子超家族，廣泛分布于脂肪組織、支氣管和肺泡上皮、下丘腦、胰島細胞、大腦脈絡叢、心臟、肝、腎、脾等。瘦素受體基因位于人染色體1p31，包含19個內含子和20個外顯子，其中在第6外顯子223位核苷酸存在A→G(Gln223Arg)替換多態性。本研究發現，代謝綜合征組和哮喘合并代謝綜合征組AA+AG基因型和A等位基因頻率較健康對照組顯著性升高(χ2=4.448、4.26，P<0.05)；單純哮喘組AA+AG基因型和A等位基因頻率與健康對照組雖無明顯差異，但是單純哮喘組中重度持續組AA+AG基因型和A等位基因頻率較健康對照組有顯著差異(χ2=4.156、4.027，P<0.05)，提示該位點A等位基因可能是重度哮喘和代謝綜合征的共同遺傳易感因子，AA和AG基因型攜帶者哮喘和代謝綜合征的患病風險增加。哮喘合并代謝綜合征組AA+AG基因型和A等位基因頻率與代謝綜合征組和單純哮喘組比均無統計學意義，我們分析其原因可能為：(1)哮喘和代謝綜合征均為多基因遺傳性疾病，其發病機制復雜，無法用單一一種基因多態性解釋；(2)本試驗樣本量較少，無法反映出其差異性。對此我們在未來研究中會加大樣本量，并綜合其他可能的致病基因共同分析，探討哮喘和代謝綜合征發病的共同發病基礎。

我們進一步研究還發現，AA+AG基因型的血漿瘦素濃度、MBI、SBP與GG基因型比均顯著升高，而FEV1%、FEV1/FVC下降明顯。相關研究表明，瘦素受體Gln223Arg位點編碼的氨基酸位于瘦素受體細胞外區的瘦素結合位點，該位點發生核苷酸替換后，編碼的氨基酸由原來的谷氨酸轉換為精氨酸，并導致該位點的帶電性由中性變為正電性，這一變化可能會影響瘦素和瘦素受體的結合，干擾結合后的信號傳導通路[11,12]，從而導致瘦素抵抗。瘦素抵抗一方面導致瘦素的相對不足，引起體重的增加和能量代謝紊亂，進而導致代謝綜合征發生；另一方面引起血清瘦素濃度反饋性升高，升高度血清瘦素通過誘導一系列炎癥反應和影響Th1/Th2細胞反應，促進哮喘的發生。

綜上所述，瘦素受體Gln223Arg位點基因多態性與哮喘和代謝綜合征具有相關性，其中A等位基因可能通過瘦素抵抗誘導哮喘和代謝綜合征的發生，是哮喘和代謝綜合征的共同遺傳易感因子。然而支氣管哮喘和代謝綜合征是一種多基因遺傳性疾病，在未來的工作中我們還要積極尋找更多的遺傳易感基因，從分子層面上進一步闡明哮喘和代謝綜合征的發病機制，為疾病的早期診斷和及時干預治療奠定理論基礎。

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[收稿2016-07-25 修回2016-12-05]

(編輯 許四平)

Associations of polymorphism of leptin receptor gene Gln223Arg with asthma and metabolic syndrome

GAOJun-Jie,QINMiao,XURui-Jin,ZHANGJing,GEYun-Jie.

TheCadreHealthCareDepartment,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266071，China

Objective:To investigate the relationship of polymorphism of leptin receptor gene Gln223Arg with asthma and metabolic syndrome.Methods: Collected 120 asthma patients,92 metabolic syndrome patients,54 asthma combined metabolic syndrome patients and 81 normal controls.According to the severity,the asthma patients were divided into mild-medium group and severe group.The serum leptin level was measured by ELISA,the genotypes of leptin receptor were analyzed by the method of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP),and statistcs of each subject′s MBI,blood pressure,lung function and fasting blood glucose were collected.Results: ①There were significant differences in genotype and allele frequency in leptin receptor gene Gln223Arg between the metabolic syndrome group,asthma combined metabolic syndrome group and normal control group(P<0.05).②The allele frequency and genotype in leptin receptor gene Gln223Arg were significant different between the severe asthma group and normal control group(P<0.05).③The serum leptin level,BMI and systolic blood pressure of AA+AG genotype group were significiant higher than GG genotype group(P<0.05),while the value of FEV1% and FEV1/FVC of lung function were lower than GG genotype group(P<0.05).Conclusion: Leptin receptor gene Gln223Arg polymorphism is correlated with asthma and metabolic syndrome,and by causing leptin resistance,the A allele might be the genetic factor that contribute to individual susceptibility for asthma and metabolic syndrome.

Asthma;Metabolic syndrome;Leptin;Leptin receptor;Gene polymorphism

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.005

高俊杰(1984年-)，男，碩士，主治醫師，主要從事內分泌和代謝方面的研究。

及指導教師：葛云潔(1969年-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事哮喘發病機制研究，E-mail: qdwangye@163.com。

R392.2

A

1000-484X(2017)05-0660-05

①青島大學附屬醫院，青島266002。