黃連乙醇提取物與鹽酸小檗堿體外抗炎對比研究①

陳 凱 王月亮 王佳奇 丁傳波 宋明銘 劉文叢 鄭毅男 李 慧

(吉林農業大學中藥材學院，長春130118)

·中醫中藥與免疫·

黃連乙醇提取物與鹽酸小檗堿體外抗炎對比研究①

陳 凱②王月亮②王佳奇 丁傳波 宋明銘 劉文叢 鄭毅男 李 慧②

(吉林農業大學中藥材學院，長春130118)

目的：比較黃連乙醇提取物與鹽酸小檗堿體外抗炎活性，探索體外抗炎機制。方法：通過脂多糖體外刺激小鼠單核巨噬細胞建立細胞炎癥模型，給藥干預后，LPS長時間刺激RAW264.7細胞，MTT比色法分析黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿對RAW264.7細胞生長活性的影響。酶聯免疫吸附法檢測細胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、前列腺素E2 (PGE2)含量。實時熒光定量RT-PCR法檢測iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達。結果：在5～80 mg/L范圍內，黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿對RAW264.7細胞無抑制作用；各濃度給藥組IL-6、IL-1β、TNF-α、NO、前列腺素E2 (PGE2 )含量與LPS刺激模型組比較均有顯著性(P<0.01)，且濃度與劑量無效應相關。實時熒光定量RT-PCR結果顯示，各濃度給藥組均明顯降低iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，且與濃度不呈效應關系。結論：黃連乙醇提取物具有體外抗炎作用，抗炎活性優于鹽酸小檗堿，其作用機制可能與抑制TNF-α、NO等炎癥因子的活化，進而影響花生四烯酸(AA)代謝有關。

黃連乙醇提取物；RAW264.7細胞；炎性因子；熒光定量

黃連為毛莨科植物黃連(Coptis chinensis Franch.)、三角葉黃連(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsial ) 或云連(Coptisteeta Wall.) 的干燥根莖，在我國西南和中南山區分布廣泛，具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效。黃連的主要成分是原小檗堿型化合物，包括小檗堿、表小檗堿、黃連堿、藥根堿及巴馬汀。在分子結構特點上均屬異喹啉類生物堿，具季銨基團，就抗炎方面，黃連單味藥及其組成成分之一的名方三黃瀉心湯具有較好的療效[1-4]。目前研究表明，黃連中抗炎作用的主要活性成分為鹽酸小檗堿，此外，也有相關數據顯示，黃連提取物有很好的抗炎作用[5]。因此，本研究選擇廣泛應用于體外實驗的小鼠巨噬細胞系細胞(RAW264.7細胞)，用脂多糖(LPS)誘導，建立巨噬細胞炎癥模型，觀察鹽酸小檗堿及黃連提取物對誘導的小鼠巨細胞釋放炎性細胞因子影響，以及iNos、HO-1 和TNF-α mRNA表達，比較二者的抗炎活性，探討其體外抗炎作用機制，為拓展黃連的藥用范圍及推動抗炎新藥的研制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 RAW264.7 細胞(中科院上海細胞研究所)，RPMI1640培養基、DMEM培養基(Hyclone)，胎牛血清(康源)，青霉素及鏈霉素混合液(上海銘博生物科技有限公司)，脂多糖(LPS，Sigma)，地塞米松(廣東三才石岐制藥股份有限公司)，黃連藥材飲片(河北安國市昌達中藥材飲片有限公司)，鹽酸小檗堿對照品(110713-201206，中國食品藥品檢定研究院，純度98%)，IL-6 ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒、NO ELISA試劑盒、PGE2 ELISA試劑盒均購自R&D公司，RT試劑盒、RCR試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)，MTT(amresco)，磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffered saline，PBS)，引物由北京博仕生物有限公司設計。

1.1.2 儀器 超凈工作臺(美國Forma公司)，CO2培養箱(美國Forma公司)，倒置顯微鏡(上海利鑫堅離心機有限公司)，冷凍離心機(上海比目儀器有限公司)，酶標儀(美國AWARENS)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 RAW264.7 細胞在37℃，5% CO2條件下，含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)及鏈霉素(100 U/ml)的DMEM培養液中傳代培養，試驗用細胞均處于對數生長期。

1.2.2 黃連乙醇提取物制備 取黃連飲片適量，加入15倍體積的50%乙醇溶液，超聲提取3次，每次30 min，合并濾液，旋轉蒸發濃縮至一定體積后，干燥，即得。

1.2.3 抗炎活性與機制研究

1.2.3.1 MTT法檢測不同濃度給藥組對RAW2 64.7細胞生長的影響 取對數生長期的RAW2 64.7 細胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，用含10%的PBS的DMEM培養基制成1×105個/ml單細胞懸液，以每孔100 μl接于96孔板中，每一濃度6個復孔。于37℃，5% CO2培養孵育24 h，分別加入5、10、20、40、80 mg/L的黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿2 h后，加入1 mg/L LPS刺激培養，繼續培養24 h。棄上清液，用10% PBS洗3次，每孔加入180 μl DMEM和20 μl MTT(0.5 g/L)后，加入不同濃度的黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿(5、10、20、40、80 mg/L)，棄培養液，每孔換無血清RPMI1640培養液195 μl，再加入 5 g/L MTT 10 μl，于37℃、5%CO2，培養4 h，吸出培養液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩5 min，采用自動酶標儀在570nm波長檢測OD值，以此反映細胞活力。細胞存活率(%)=[1-(A空白對照組-A藥物組)/A空白對照組]×100%。

1.2.3.2 LPS誘導RAW264.7細胞對IL-1β、IL-6、NO、TNF-α、PGE2含量的影響 調整RAW264.7細胞懸濁液濃度為1×105個/ml，以每孔100 μl接于96孔板中，待細胞貼壁后，設空白對照組，LPS刺激模型組，地塞米松陽性對照組，黃連乙醇提取物給藥組(5、10、20、40、80 mg/L)及鹽酸小檗堿給藥組(5、10、20、40、80 mg/L)，每組6個復孔。空白對照組只加入DMEM培養基，LPS刺激模型組加入1 mg/L LPS刺激培養，地塞米松陽性對照組加入2 mg/的地塞米松預處理2 h后，加入1 mg/L LPS刺激培養，給藥組分別加入5、10、20、40、80 mg/L兩組藥物預處理2 h后，加入1 mg/L LPS刺激培養。繼續培養24 h，收集上清，ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β、IL-6、NO、TNF-α、PGE2含量。操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.3.3 LPS誘導RAW264.7細胞iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達影響 實時熒光定量RT-PCR法檢測iNos、HO-1、TNF-α mRNA基因表達。細胞干預4 h后提取RNA，細胞總RNA提取采用RT試劑盒提取法，具體方法參照說明書。將RNA保存在-80℃備用。采用ABI-7700序列檢測儀。

引物序列為Mus-iNos:Forward：5′-AAGTCCAGCCGCACCACCCT-3′，Reverse：5′-CCTCGCTCA-ACACCTAAC-3′；Mus-TNF-α：Forward：5′-GGCGGTGCCTATGTCTCA-3′，Reverse：5′-AGTCAAGATACCGGGTCTG-3′，Mus-HO-1:Forward：5′-CCCCACTCTACTTCCCTG-3′，Reverse：5′-GATACATTTCGCA-GAGGTGC-3′;Mus-Cyclophilin：Forward：5′-GCAA-AGACACCAATGGCTCA-3′，Reverse：5′-CGTGGTTC-TGTCTGTCGG-3′。

2 結果

2.1 不同濃度給藥組對RAW264.7細胞生長的影響 MTT結果顯示：黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿給藥濃度在5～80 mg/L范圍內，鏡下觀察細胞形態均無改變，各濃度給藥組吸光度與對照組比較，OD值差異無顯著性，黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿內無細胞毒性。

2.2 LPS誘導RAW264.7細胞對IL-1β、IL-6、NO、TNF-α、PGE2含量的影響 結果顯示，LPS模型組TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量明顯高于對照組(P<0.01)，表明LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型造模成功。與模型組相比，兩種藥物各個給藥組中TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量均顯著降低(P<0.01)，給藥濃度 5～20 mg/L時，炎癥細胞所釋放的各個因子含量，均隨濃度的升高而降低；給藥濃度20～80 mg/L時，炎癥細胞所釋放的各個因子含量，隨濃度的升高而升高；說明各炎性因子含量與濃度無效應關系。黃連乙醇提取物的抑制作用優于鹽酸小檗堿，濃度為20 mg/L的兩種藥物給藥組對各個因子的抑制作用均最為顯著(P<0.01)，均能減少炎癥細胞所釋放的TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量，見表 1。

2.3 LPS誘導RAW264.7細胞iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達影響 結果顯示，與對照組比較，LPS刺激后巨噬細胞均增加(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，兩種藥物給藥濃度20 mg/L組iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達均顯著降低(P<0.01)，其他給藥濃度組iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達均降低(P<0.05)，兩種藥物對iNos、HO-1、TNF-α mRNA的mRNA表達的抑制作用無顯著性差異，見表2。

表1 TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量

Tab.1 Concentration of TNF-α，IL-6，NO，IL-1β，PGE2

GroupsContent(ng/L)TNF-αIL-6NOIL-1βPGE2Blankgroup82.98±4.7224.55±1.303.43±0.364.97±0.1781.71±2.29Modelgroup183.50±2.381)52.34±1.351)16.93±0.511)17.24±0.401)351.30±13.041)Positivecontrolgroup96.83±2.352)30.62±1.662)6.71±0.442)7.83±0.262)111.71±4.722)Berberinehydrochloridegroup5mg/L181.76±1.482)49.65±1.252)16.78±0.862)17.80±0.522)287.99±6.332)10mg/L155.88±4.792)44.79±1.982)14.52±0.652)15.97±0.632)259.26±2.892)20mg/L123.42±6.532)39.71±0.672)11.27±0.982)12.12±0.442)199.65±3.462)40mg/L146.55±5.492)41.97±0.652)13.39±0.712)13.79±0.582)232.58±5.422)80mg/L152.46±6.772)43.89±0.682)14.25±0.992)14.89±0.552)248.42±5.912)EthanolextractcoptischinensisFranch.group5mg/L173.45±1.642)45.37±1.322)14.80±0.622)14.60±0.522)243.14±7.412)10mg/L144.07±5.312)40.90±2.092)11.92±0.572)13.67±0.862)220.78±3.012)20mg/L107.36±7.082)34.70±0.822)9.68±0.672)10.51±0.652)167.30±3.812)40mg/L131.36±5.752)38.80±0.872)11.36±0.672)11.52±0.882)201.40±6.012)80mg/L141.88±7.902)40.60±0.892)12.16±1.032)11.63±0.422)217.19±5.592)

Note：Compared with blank group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

表2 iNos、HO-1、TNF-α mRNA表達量

Tab.2 Expression of iNos,HO-1,TNF-α mRNA

GroupsiNosHO-1TNF-αBlankgroup20.59±1.9745.77±3.5513.44±1.21Modelgroup110.30±11.531)243.30±18.971)77.29±5.681)Positivecontrolgroup81.71±6.822)131.71±10.562)41.44±3.272)Berberinehydrochloridegroup5mg/L101.32±7.422)201.56±12.862)60.55±3.672)10mg/L89.66±5.622)168.39±8.272)53.19±2.022)20mg/L61.29±3.602)130.02±8.042)39.08±2.362)40mg/L94.81±6.182)188.28±11.912)57.42±2.952)80mg/L105.82±7.492)216.39±12.772)67.84±3.612)EthanolextractcoptischinensisFranch.group5mg/L90.14±7.552)183.53±13.242)56.29±3.962)10mg/L72.78±5.292)141.28±9.772)49.47±2.472)20mg/L57.30±3.782)107.37±7.982)33.77±2.012)40mg/L89.40±7.392)170.10±12.552)52.85±3.222)80mg/L97.19±8.022)193.19±13.962)61.28±4.192)

Note：Compared with blank group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

3 討論

巨噬細胞在炎性反應中起著至關重要的作用，機體被刺激產生炎性反應后，巨噬細胞產生大量的炎性因子及炎性介質，如TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2等。這些炎癥因子及介質激活是炎癥反應的關鍵過程，對它們的抑制作用常常作為評價藥物抗炎活性的重要指標[6-8]。本研究以LPS誘導RAW 264.7細胞建立炎癥細胞模型，體外對比黃連乙醇提取物與鹽酸小檗堿的抗炎活性，并探索其作用機制。

正常情況下，靜止的巨噬細胞僅產生極少量的炎癥因子，當巨噬細胞經LPS、炎癥因子等誘導活化后通過一系列信號轉導通路，表達大量炎癥靶基因，如iNos、HO-1和TNF-α等，從而產生大量IL-6、IL-1β、NO、PGE2和TNF-α，活化后產生的一系列炎癥介質推動炎癥的級聯瀑布反應。TNF-α在級聯反應中屬于末期的效應分子，也是炎癥中起正反饋調控的一個關鍵分子，參與多種局部和全身的炎癥反應[9]。NO 產生受iNos影響，其在體內廣泛參與多種生理和病理過程，如調節血管張力、參與神經傳遞、介導炎癥反應和免疫反應等，同時也是炎癥和細胞毒素血癥中細胞毒性因子[10]。PGE2是一種重要的炎癥介質，是花生四烯酸環氧合酶(COX-2)代謝產物，能介導炎癥反應中疼痛和發熱的產生。所以本研究采用TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量變化及TNF-α、iNos和HO-1 mRNA表達作為評價黃連乙醇提取物抗炎效應的標準。

本研究結果顯示，黃連乙醇提取物及鹽酸小檗堿各個濃度給藥組對各炎癥因子有不同程度的抑制作用，給藥濃度為20 mg/L的抑制作用最為顯著(P<0.01)，能明顯抑制巨噬細胞釋放NO、IL-6、IL-1β、PGE2和TNF-α，其他給藥組對各炎癥因子的釋放也均有不同程度的抑制作用，且各炎癥因子的含量與給藥濃度無效應關系。在對照組中iNos、HO-1和TNF-α的基因水平都低表達，但經LPS刺激后mRNA表達均上調。與模型組相比，各個濃度給藥組對iNos，HO-1 和TNF-α的mRNA 表達均有抑制作用，20 mg/L的給藥組iNos、HO-1 和TNF-α的mRNA 表達抑制作用最為顯著。其他給藥組對各炎癥因子mRNA表達也均有不同程度的抑制作用。說明黃連乙醇提取物都具有一定程度的抗炎作用。

黃連提取物通過降低iNos、HO-1和TNF-α mRNA表達抑制NO、PGE2和TNF-α生成，而起到抗炎作用。據文獻報道，細胞毒性物質LPS、前炎癥細胞因子(TNF-α和PGE2等) 可通過激活巨噬細胞使NF-κB 活化并從細胞質易位到細胞核，啟動多種炎癥基因如炎癥酶(如iNos和HO-1等) 和細胞因子(如TNF-α)表達。該黃連乙醇提取物抑制炎癥介質的生成而實現抗炎效應是否在一定程度上影響NF-κB需要進一步研究。綜上所述，黃連乙醇提取物具有一定的抗炎作用，且抗炎活性優于鹽酸小檗堿，其發揮抗炎作用的機制可能與其影響炎癥介質的基因表達有關。本研究為進一步探討黃連乙醇提取物的抗炎機制提供了實驗依據。

[1] 劉衛霞，王俊平，林立紅，等.黃連解毒湯的鎮痛、抗炎及體內抗腫瘤作用[J].沈陽醫學院學報，2013，15(1):53-55.

[2] 董 靜，尤 凱，郭 星，等.黃連解毒湯的藥理學研究進展[J].沈陽醫學院學報，2014，16(1):51-53.

[3] 王利津，徐 強.黃連解毒湯的抗炎作用機理研究[J].中國中藥雜志，2000，25(8):493-496.

[4] 羅海燕，郵棗園，李 巖，等.黃連解毒湯不同劑型抗菌藥效實驗研究[J].臨床醫學工程，2011，18 (5):647-648.

[5] 王立紅，唐文照，辛義周.黃連中生物堿成分及藥理作用研究進展[J].山東中醫藥大學學報，2015，39(4)：389-392.

[6] Kulkarni SK，Dhir A.Berberine:a plant alkaloid with therapeutic potential for central nervous system disorders[J].Phytother Res，2010，24(3):317-324.

[7] 陳桂榮，李明玉，解世全，等.黃連解毒湯及其各部位群抗炎物質基礎[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22(1)：98-102.

[8] 王聚樂，孫 洋，周惠英，等.藏藥忍冬果對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能及分泌細胞因子的影響[J].中國中藥雜志，2006，31(2):145.

[9] 葉莎莎，曾耀英，尹樂樂.紅景天苷對小鼠腹腔巨噬細胞體外增殖、凋亡、吞噬、ROS 和NO 產生的影響[J]. 細胞與分子免疫學雜志，2011，27(3):237.

[10] 周 霞，彭耀宗，黃 濤,等.黃連生物堿對體外培養的小鼠腹腔巨噬細胞的影響[J].中國中藥雜志，2015，40(23)：4660-4666.

[收稿2016-04-15 修回2016-06-20]

(編輯 張曉舟)

Comparison of anti-inflammatory activity of ethanol extract of coptis chinensis Franch.and Berberine hydrochloride in vitro

CHENKai,WANGYue-Liang,WANGJia-Qi,DINGChuan-Bo,SONGMing-Ming,LIUWen-Cong,ZHANGYi-Nan,LIHui.

JilinAgriculturalUniversityCollegeofTraditionalChineseMedicine，Changchun130118，China

Objective:To study the anti-inflammatory effect of the ethanol extract of Coptis chinensis Franch.in vitro.Methods: An inflammatory cell model was established by stimulating the mouse peritoneal macrophages in vitro with lipopolysaccharide(LPS).LPS stimulated of RAW264.7 cells for a long time after administration of intervention.Effect of ethanol extract of Coptis chinensis Franch.on RAW264.7 cell growth activity was analyzed by MTT assay.The production of tumor necrosis factor-α(TNF-α),IL-1β,IL-6,NO,prostaglandin E2(PGE2) was determined by ELISA.The expression of mRNA of TNF-α，induced nitric oxide synthase(iNos) and HO-1 was detected by real-time fluorescent quantitative PCR(RT-PCR).Results: The ethanol extract of Coptis chinensis had no inhibition effect on the scope of RAW 264.7 cells the scope of 5-80 mg/L.Each treatment group concentration of interleukin-6 (IL-6),interleukin-1β (IL-1β),TNF-α,NO,prostaglandin E2 (PGE2) content of LPS stimulation model group were significantly (P<0.01),and content was not related to concentration.Real-time quantitative (RT-PCR) showed,the concentration of each treatment group were significantly lower iNos,HO-1 and TNF-α mRNA expression (P<0.05,P<0.05,P<0.01),and content was not related to concentration.Conclusion: Coptis chinensis Franch.ethanol extract has anti-inflammatory effects in vitro,the mechanism may be related to inhibition of TNF-α,NO and other inflammatory factors and the impact of the activation of arachidonic acid (AA) metabolism.

Ethanol extract of Coptis chinensis Franch.；RAW264.7 cell；Inflammatory cytokines；RT-PCR

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.010

①本文為2009年中醫藥行業科研專項(200907001-5)、國家科技部科技型中小企業技術創新基金項目(13C26212201221)和吉林省科技發展計劃項目(20150311050YY)。

陳 凱(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事中藥制劑評價與新藥研發研究。

及指導教師：劉文叢(1968年-)，男，博士，教授，主要從事中藥新藥研究與開發研究，E-mail:jwlw6803@126.com。

R943

A

1000-484X(2017)05-0684-04

②中國中醫科學院中藥研究所，北京100700。