下調CD59對急性T系白血病細胞株Jurkat 凋亡相關分子的影響①

高美華 李華僑 李 冰 王 忠 叢蓓蓓 王 冰

(青島大學醫學院免疫學教研室,青島266071)

·生物治療·

下調CD59對急性T系白血病細胞株Jurkat 凋亡相關分子的影響①

高美華 李華僑 李 冰②王 忠 叢蓓蓓 王 冰③

(青島大學醫學院免疫學教研室,青島266071)

目的：探討下調CD59對急性T系白血病細胞株Jurkat凋亡相關分子的影響。方法：運用RNAi慢病毒為載體下調急性T系白血病Jurkat 細胞株CD59的表達；激光共聚焦觀察轉染效率及CD59分子的定位；Real-time-PCR、Western blot篩選下調效果最好的一組細胞，用其做后續的分子生物學水平的實驗； Western blot檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin蛋白表達量的變化；ELISA檢測各組的細胞培養上清中IL-3、TNF-β的表達。 結果：激光共聚焦觀察到轉染各組的轉染效率在90%以上，CD59分子主要位于細胞膜；Real-time-PCR篩選得出下調A組的轉染效果最好； Western blot結果顯示下調A組的CD59蛋白的表達量減少最明顯，將RNAi-CD59-A定義為RNAi-CD59作為實驗組進行后續實驗；實驗組能增強Bax、Caspase-3蛋白的表達(P<0.05)，抑制Bcl-2、Survivin蛋白的表達(P<0.05)；ELISA結果顯示下調組IL-3 表達水平降低(P<0.05)， TNF-β的表達水平升高(P<0.05)。結論：下調D59基因表達可使急性T系白血病細胞株Jurkat的促凋亡分子表達增高，促增殖分子表達降低。

CD59；凋亡；Jurkat；轉染

20世紀90年代，人們將由雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平特異性在轉錄后沉默相應序列基因表達的過程稱為RNA干擾(RNAi)[1]。RNAi 自發現以來其用于腫瘤治療的主要目標是能夠選擇性地沉默突變的或者與腫瘤相關的基因而對正常基因不會產生損害[2]，其在腫瘤治療中具有巨大的潛力,利用RNAi 技術,對腫瘤細胞內的癌基因和抑癌基因進行抑制其功能表達,分析其表型發生的變化,有利于揭示腫瘤發生發展的分子機制,為臨床腫瘤疾病的診斷治療提供了新思路[3]。本課題組前期運用電轉染的方法下調CD59的表達，轉染效率低，有一定的下調效果，對Jurkat細胞增殖具有一定的影響[4]，因此，本課題優化轉染方法，采用慢病毒為載體轉染Jurkat細胞，研究RNAi慢病毒下調CD59基因對急性T系白血病細胞株Jurkat凋亡相關分子的影響，為臨床白血病的診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 RNAi-CD59序列由本實驗室前期研究設計，RNAi-CD59序列以及陰性對照組的加強型綠色熒光蛋白慢病毒的包裝由上海吉凱基因化學技術有限公司統一合成(見表1)；RNA提取、反轉錄試劑盒以及Real-time PCR試劑盒均購自TaKaRa生物工程有限公司；哺乳動物蛋白抽提試劑、磷酸酶抑制劑、BCA試劑盒均購自康為試劑有限公司；兔抗人CD59、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin單克隆抗體購自Abcam公司；ELISA試劑盒購自武漢基因美生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染 Jurkat細胞系購自上海中科院細胞庫，于本實驗室保存，培養細胞用RPMI-1640完全培養基(含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液)，隔天換液一次；取對數生長期Jurkat細胞，接種于96孔板中(80 μl/孔 ，每組5個復孔)，加入構建的病毒(MOI值為50)，12 h后離心換液，建立穩定轉染的細胞系。

1.2.2 激光共聚焦觀察各組細胞的轉染效率及CD59分子的定位 取對數生長期的細胞通過熒光顯微鏡觀察各組細胞綠色熒光蛋白的表達來確定轉染效率，每組選擇5個具有代表性的視野，計算陽性細胞數的平均值，估算轉染效率；同樣取適量對數生長期細胞，PBS洗滌后懸滴于載玻片上，自然晾干后4%多聚甲醛固定。10%山羊血清封閉30 min后，加入一抗4℃過夜孵育。羅丹明標記的熒光二抗室溫避光孵育2 h，于激光共聚焦顯微鏡下觀察CD59在細胞膜上的定位情況。

表1 RNAi-CD59基因序列

Tab.1 Gene sequence of RNAi-CD59

GroupsRNAi-CD59sequenceATGAGCTAACGTACTACTGCBTGCGTGTCTCATTACCAAACGTGGGACATCCTTATCAGAGA

1.2.3 Real-time-PCP觀察各組細胞CD59 mRNA的表達情況 按TRIzol 試劑盒分別提取細胞系Jurkat正常細胞組，RNAi-CD59細胞A、B、C組及陰性對照組的總RNA，分別各取0.5 μg RNA逆轉錄為cDNA。引物由上海生工公司合成，序列(見表2)，反應體系總體積為20 μl，擴增條件為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 min，40個循環。由PCR反應曲線得到Ct值，采用2-ΔΔCt法計算相對定量結果。

1.2.4 Western blot觀察各組細胞CD59、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin 分子蛋白的表達水平 收集各組對數生長期細胞(107個/ml，1 ml)，提取總蛋白。于16%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫2 h，一抗4℃孵育過夜。TBST沖洗后加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h，TBST沖洗，加入ECL化學發光液，避光，曝光顯色。以β-actin作為內參，應用Image-J灰度分析軟件進行半定量檢測。

1.2.5 ELISA檢測細胞分泌因子IL-3、TNF-β的表達水平 取對數生長期的細胞，調整細胞密度為5×106于6孔板培養48 h后，1 000 r/min離心3 min取上清，后將上清液3 000 r/min離心20 min取上清液，按ELISA試劑盒操作說明進行各個數據的測定。

2 結果

2.1 激光共聚焦顯微鏡顯示病毒轉染效率及CD59分子在細胞上的定位 RNAi-CD59 3個組及空載體病毒顆粒轉染Jurkat細胞，培養96 h后直接在共聚焦顯微鏡下選取5個代表性的視野，觀察。兩圖中的圖1A1、A2經488 nm發射波激發下未見綠色熒光出現，圖1B1、B2中可見布滿整個視野的綠色熒光，幾乎包括每個細胞，細胞轉染效率達到90%；圖1C1、C2顯示CD59定位于細胞膜上細胞，圖1D1為B1、C1合并得到，同樣D2為B2、C2合并得到，說明了CD59的細胞膜表達更為明顯(如圖1)。

表2 CD59測定引物序列

Tab.2 Primer sequence of CD59

GenesForwardprimersReverseprimersCD595'-TGAGACACGCATCAAAATCAG-3'5'-CTGCCATTCAGGTCATAGCC-3'β-action5'-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3'5'-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3'

圖1 激光共聚焦觀察轉染效率及CD59分子的定位Fig.1 Rate of transfection efficiency and location of CD59 in confocal

圖2 Real-time-PCR檢測各組CD59 mRNA的表達(n=3)Fig.2 Expression of CD59 mRNA in each group by Real-time-PCR(n=3)Note: vs Jurkat,***.P<0.001.

圖3 各組細胞相關蛋白的表達情況(n=3)Fig.3 Expression of related molecule in each group(n=3)Note: vs Jarkat，*.P<0.05,**.P<0.01，***.P<0.001.

圖4 各組細胞分泌因子的表達情況(n=3，ng/ml)Fig.4 Expression of cells secrete factors in each group(n=3，ng/ml)Note: vs Jurkat，***.P<0.001.

2.2 Real-time-PCR篩選明顯的CD59下調序列 Real-time-PCR結果顯示RNAi-CD59-A的下調效果最好，差異有統計學意義(P<0.001),RNAi-NC與Jurkat細胞相比，CD59表達差異無統計學意義(P>0.05)，說明RNAi-CD59下調機制構建成功(如圖2)。

2.3 各組細胞CD59、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin 分子蛋白的表達水平 Western blot結果顯示，RNAi-CD59-A組CD59蛋白表達量最低，差異有統計學意義(P<0.05),后續用A組做實驗組進行相關分子的檢測；實驗組Bcl-2、Survivin表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，實驗組Bax、caspase-3表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與Jurkat組相比，陰性對照組(RNAi-NC)的各組蛋白表達水平無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05,如圖3)。

2.4 細胞分泌因子IL-3、TNF-β的表達水平 ELISA結果顯示，培養48 h后，下調組細胞上清液中IL-3較Jurkat相比表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)；下調組細胞上清液中TNF-β較Jurkat組相比表達量增多，差異有統計學意義(P<0.05)，空病毒組上述兩個指標較Jurkat組相比無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05，如圖4)。

3 討論

急性淋巴細胞白血病(ALL)的特點是侵襲骨髓的未成熟的淋巴細胞進行無限增殖，而急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)是一種由于未成熟T細胞前體細胞的惡性轉化引起的侵襲性血液系統的腫瘤[5]，治療與預后較差，有報道顯示白血病的發生趨于低齡化，其中14歲以下青少年主要惡性病為白血病[6]，因此對于白血病的研究有著非常重要的意義。免疫分子CD59也稱保護素(Protectin),廣泛分布于造血生成細胞和非造血生成細胞及多種組織細胞表面的補體終末段的一種18～20 kD的膜性調節蛋白,具有抑制補體攻膜復合物的形成,保護細胞免遭補體介導的溶細胞作用[7]。CD59分子在腫瘤細胞中過表達[8-11]，抑制補體殺傷，逃避機體免疫監視，因此，CD59過表達的腫瘤病人預后較差。本課題組前期研究發現，在多種腫瘤細胞中CD59基因受抑制后對補體溶破的抵抗作用降低，在篩選有效下調效率時，根據功能性CD59可抑制MAC的形成，功能性越高，保護性越強，后續研究發現下調CD59表達最好的一組CD59溶破作用最好，促凋亡效果最好[12，13]，并發現CD59可通過Cbp/LAT傳遞信號，引起細胞內相關分子的變化[14,15]，但對于CD59與白血病凋亡相關分子的直接關系的研究，需要進一步探討。

本實驗構建3條RNAi-CD59序列結合綠色熒光融合蛋白，以慢病毒為載體，轉染Jurkat 細胞，其中RNAi-CD59-A在本實驗室前期Hela細胞上驗證有效[16]，RNAi-CD59-B組RNAi-CD59-C組由吉凱基因合作完成，建立了穩定轉染的細胞株，以空病毒為陰性對照組(RNAi-NC)，Jurkat細胞組為空白對照組。激光共聚焦觀察綠色熒光蛋白幾乎布滿整個視野，說明綠色熒光蛋白結合入細胞內，同時我們觀察到空病毒組的綠光主要分布于胞內，下調組綠光主要位于細胞膜，加CD59抗體孵育后，觀察到兩者紅光均位于細胞膜，進一步說明了CD59主要定位于細胞膜。我們運用Real-time-PCR和Western blot分別檢測CD59 mRNA和CD59蛋白的表達，發現CD59在基因和蛋白水平上的表達均降低，且A組的下調效果最佳，證明了下調CD59表達的細胞模型構建成功，后續將用A組作為實驗組(定義為RNAi-CD59)。實驗組抗凋亡相關蛋白Bcl-2、Survivin的表達量降低(P<0.05)，促凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3的表達量升高(P<0.05),說明下調CD59的表達能夠增加促凋亡相關分子的表達，降低促增殖相關分子的表達，具有一定的研究價值。ELISA結果顯示，實驗組IL-3的表達水平降低，說明下調CD59的表達能夠使促進細胞增殖分化的相關分泌因子表達降低，說明細胞的增殖水平有可能降低；實驗組TNF-β的表達水平升高，說明下調CD59的表達能夠發生腫瘤壞死相關因子的表達量增高，具有一定的意義。

綜上所述，下調CD59的表達能夠使Jurkat細胞的促凋亡相關分子的表達升高，促增殖的相關分子的表達降低，從而起到促進凋亡抑制增殖的效果，但其具體的發生機制和下調后對生物學行為的影響以及靶向抑制CD59對正常T細胞的影響效果還需進一步驗證，后期我們將采取不同的方式對其促凋亡效果進行分析，并采用裸鼠移植瘤模型進行動物水平實驗加以研究。

[1] Fire A，Xu S，Montgomery MK,etal.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,39(19):806-811.

[2] Jeffrey M,Perkel PhD.RNAi therapeutics:the teenage years[J].Biotechniques,2012,52(6):355-357.

[3] Alagia A,Eritja R.siRNA and RNAi optimization[J].Methods Mol Biol,2016，1470:85-94.

[4] 李園園，高美華，叢蓓蓓，等.活化/抑制CD59對T淋巴細胞增殖的影響[J].現代生物醫學進展，2014,14(19)：3631-3634.

[5] Paganin M,Ferrando A.Molecular pathogenesis and targeted therapies for NOTCH1-induced T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Blood Rev,2011,25(2):83-90.

[6] 羅 鑫,肖 路,劉姝華,等.重慶市巴南區人民醫院2010-2011年居民死因監測分析[J].海南醫學,2013,24(5):752-754.

[7] Sugita Y,Nakano Y,Tomita M.Isolation from human erythrocytes of a new membrane protein which inhibits the formation of complement transmembrane channels[J].J Biochem,1988,104(4):633-637.

[8] Li B,Lin H,Fan J,etal.CD59 is overexpressed in human lung cancer and regulates apoptosis of human lung cancer cells[J].Intern J Oncol,2013,43(3):850-858.

[9] Accardopalumbo A,Triolo G,Colonnaromano G,etal.Glucose-induced loss of glycosyl-phosphatidylinositol-anchored membrane regulators of complement activation (CD59,CD55) by in vitro cultured human umbilical vein endothelial cells[J].Diabetologia,2000,43(8):1039-1047.

[10] Tamai H,Matsuo S,Fukatsu A,etal.Localization of 20-kD homologous restriction factor (HRF20) in diseased human glomeruli.An immunofluorescence study[J].Clin Exp Immunol,1991,84(2):256-262.

[11] Lehto T，Honkanen E,Teppo AM,etal.Urinary excretion of protectin (CD59),complement SC5b-9 and cytokines in membranous glomerulonephritis[J].Kidney International,1995,47(5):1403-1411.

[12] 石學香，高美華，李先平，等.siRNA介導的RNAi降低了CD59對補體溶破的抵抗作用[J].細胞與分子免疫學雜志，2008,24(12)：1164-1166.

[13] 石學香，高美華，方建紅.逆轉錄病毒載體介導的RNAi技術抑制HeLa細胞CD59表達及功能的研究[J].免疫學雜志，2010，26(2)：98-101.

[14] 馬 宇,高美華,張敏銳,等.Src羧基末端激酶結合蛋白過表達及棕櫚酰化對裸鼠T系白血病Jurkat細胞增殖作用影響的研究[J].中國免疫學雜志,2016,32(1):51-55.

[15] 秦 云,高美華,王 冰,等.T細胞銜接活化因子-綠色熒光蛋白真核表達質粒的構建及其在Jurkat細胞的定位[J].中國免疫學雜志,2013,29(5):526-529.

[16] Shi XX,Zhang B,Zang JL,etal.CD59 silencing via retrovirus-mediated RNA interference enhanced complement-mediated cell damage in ovary cancer[J].Cell Mol Immunol,2009,6(1):61-66.

[收稿2016-11-25]

(編輯 倪 鵬)

Effect of down-regulation of CD59 gene on apoptosis of acute T lymphocyte Jurkat cell lines

GAOMei-Hua,LIHua-Qiao,LIBing,WANGZhong,CONGBei-Bei,WANGBing.

DepartmentofImmunologyMedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266071,China

Objective:To study the change of related molecular about apoptosis we reduce the expression of CD59 on acute T lymphocyte Jurkat cell lines .Methods: RNA interference (RNAi) was used to reduce the expression of CD59 gene by lentivirus,confocal was applyed to observe the transfection efficiency and the location of CD59 molecular then Real-time-PCR and Western blot were used to select the most effective group to do the rest experiment ;Western blot was used to detect the change of expression about Bcl-2,Bax,Caspase-3 and Survivin;ELISA was used to investigate the expression of IL-3 and TNF-β.Results: Confocal observed each group′s transfection efficiency over 90%,CD59 molecules were mainly located in cell membrane;Real-time-PCR and Western blot showed group A had the best down-regulation efficiency ; we defined RNAi-CD59-A as experimental group for subsequent experiments named RNAi-CD59;the experimental group can enhance the expression of Bax,caspase-3 (P<0.05),inhibit the expression of Bcl-2 and Survivin(P<0.05);ELISA showed that the expression of IL-3 in the down-regulation group increase(P<0.05),the expression of TNF-β decrease (P<0.05).Conclusion: Down-regulation CD59 can promote the expression of apoptosis molecular in acute leukemia Jurkat cell lines restrain the expression of proliferation molecular.

CD59;Apoptosis;Jurkat;Transfection

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.012

①本文受國家自然科學基金(No.81273206)資助。

高美華(1953年-)，女，教授，博士生導師，主要從事腫瘤分子免疫方面的研究，E-mail:meihuagao66@163.com。

R392.4

A

1000-484X(2017)05-0693-04

②青島大學醫學院遺傳學教研室，青島266071。

③青島大學醫學院科研處，青島266071。