HIF-1α、ALDH1和Hedgehog信號通路協同促進三陰性乳腺癌中癌癥干細胞活化的相關性研究①

黃 琳 滕美君 徐竟男 張純潔 鐘克禎 程名揚 陶雅軍

(大連大學醫學院，大連116622)

HIF-1α、ALDH1和Hedgehog信號通路協同促進三陰性乳腺癌中癌癥干細胞活化的相關性研究①

黃 琳 滕美君 徐竟男 張純潔 鐘克禎 程名揚 陶雅軍

(大連大學醫學院，大連116622)

目的：探討HIF-1α、ALDH1和Hedgehog信號通路在三陰性乳腺癌中癌癥干細胞活化的相關性及其臨床意義。方法：采用免疫磁珠法從三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞中分選出ALDH1+乳腺癌干細胞和ALDH1-乳腺癌細胞，采用qRT-PCR方法比較HIF-1α和Hedgehog信號傳導通路主要分子SHH、PTCH1、SMO、GLI1在這兩種細胞中的表達差異；采用免疫組化方法了解HIF-1α和ALDH1在三陰性乳腺癌組織中的表達以及與干細胞信號傳導通路Hedgehog的相互關系。結果：HIF-1α mRNA、SMO mRNA和GLI1 mRNA在ALDH1+乳腺癌干細胞中的表達均明顯高于ALDH1-乳腺癌細胞，差異具有顯著統計學意義(P均<0.05)。在三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌組織中HIF-1α的陽性表達率分別為90.0%和70.0%，ALDH1的陽性表達率分別為93.3%和66.7%，差異均具有顯著統計學意義(P均<0.05)。在三陰性乳腺癌組織中HIF-1α和ALDH1的表達呈正相關(r=0.53，P<0.01)。HIF-1α的表達與三陰性乳腺癌的淋巴結轉移和TNM分期有關(P均<0 .05)，ALDH1的表達與組織學分級和TNM分期有關(P均<0.05)。HIF-1α與Hedgehog信號通路分子SHH(r=0.584，P<0.01)、SMO(r=0.467，P<0.01)和GLI1(r=0.439，P<0.05)的表達呈正相關，ALDH1與SHH(r=0.426，P<0.05)和GLI1(r=0.394，P<0.05)的表達呈正相關。結論：HIF-1α和Hedgehog信號通路在ALDH1+乳腺癌干細胞中活化，HIF-1α、ALDH1與Hedgehog信號傳導通路可能相互協同激活癌癥干細胞從而促進三陰性乳腺癌的惡性進展。

三陰性乳腺癌；癌癥干細胞；HIF-1α；ALDH1；Hedgehog信號通路

癌癥干細胞(Cancer stem cell，CSC)具有自我更新、分化與無限增殖能力，與腫瘤的持續增殖、抗凋亡、轉移、復發及耐藥等惡性生物學行為關系密切。乳腺癌是一類在分子水平上具有高度異質性的疾病。2000年，Perou等[1]最先對乳腺癌的基因表達進行研究，將乳腺癌分成luminal A型(ER+HER-2-)、luminal B型(ER+HER-2+)、ER-/HER-2+型、basal-like型(ER-HER-2-)及normal breast-like型等。在basal-like型乳腺癌中ER-PR-HER-2-亞型被稱為三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)[2]，約占全部乳腺癌的10%～17%。與其他類型乳腺癌相比，TNBC更富有侵襲性，轉移早、復發率高、耐藥且患者預后較差，該類型乳腺癌患者的臨床病理改變符合癌癥干細胞性腫瘤的特點，有研究發現活化的CSC在TNBC組織中的含量明顯高于其他類型乳腺癌[3]，故又被稱為干細胞性乳腺癌[4,5]，但在TNBC中CSC活化的機制迄今還不清楚。

缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是維持細胞內氧代謝平衡的重要調控因子[6]，有研究發現在乳腺腫瘤中HIF-1α可通過促進CSC活化來調控腫瘤細胞的生長和轉移[7]。ALDH1(Aldehyde dehydrogenase 1)是細胞內乙醛氧化脫氫酶，是干細胞生長、分化的必需物質，也是目前CSC標記物研究的熱點之一[8]。Hedgehog信號通路在維持干細胞的增殖潛能、自我更新方面具有重要作用[9]，該通路紊亂可能與惡性腫瘤的發生、發展有關[10]。本課題在前期研究中發現Hedgehog這一干細胞信號傳導通路在三陰性乳腺癌中的表達明顯增強，其與乳腺癌的浸潤轉移以及預后關系密切，抑制Hedgehog信號傳導通路可明顯抑制乳腺癌細胞的增殖與侵襲[5]。本研究擬通過了解TNBC細胞或組織中HIF-1α、ALDH1和Hedgehog信號通路主要分子Sonic hedgehog(SHH)、patched1(PTCH1)、Smoothened(SMO)和Glioma-associated oncogene homoglog1(GLI1)的表達及其相互關系進一步探討三陰性乳腺癌中癌癥干細胞活化的機制及其在三陰性乳腺癌惡性進展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與臨床標本 乳腺癌MDA-MB-231細胞為本室保存。30例TNBC和30 例非三陰性乳腺癌(non-triple-negative breast cancer，non-TNBC)組織石蠟標本均采集自2008年5月～2012年11月大連市中心醫院病理科存檔標本，全部乳腺癌患者術前均未接受放療、化療、激素或免疫治療，病理類型均為浸潤性導管癌。

1.1.2 試劑 DMEM/F12培養基、EGF、bFGF和B27(Gibco公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；Trypsin-EDTA(Gibco公司)；TRIzol、Super-ScriptTMⅢ First-Strand Synthesis Kit(Invitrogen公司)；免疫磁珠分選系統(Bioworld公司)；HIF-1α(ab51608)、SHH(ab53281) 、GLI1(ab49314)單克隆抗體和SMO(ab72130)、PTCH1(ab53715)兔抗人多克隆抗體(Abcam公司)；ALDH1(sc-50385) 兔抗人單克隆抗體(Santa cruz公司)；SP廣譜超敏試劑盒、DAB 酶底物顯色劑(福建邁新生物技術開發公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基于37℃ 5%CO2培養箱中培養MDA-MB-231細胞，每3 d換液一次，并傳代培養。

1.2.2 免疫磁珠篩選 0.25%Trypsin-EDTA(Gibco公司)消化處于對數生長期的MDA-MB-231細胞，制備單細胞懸液，以1×105ml-1接種于含20 U/L EGF、20 U/L bFGF和2%B27的DMEM/F12無血清培養液中繼續培養。收集懸浮細胞，制成單細胞懸液，調整細胞總數為2×107ml-1。加入10 μg ALDH1一抗(Santa cruz公司)與40 μl IgG免疫磁珠(Bioworld公司)混勻，過磁性分選柱，ALDH1+細胞被吸附在分選柱中，收集流出的ALDH1-細胞并計數。將分選柱脫離磁場，用PBE沖洗分選柱，收集ALDH1+細胞并計數。

1.2.3 Real-time RT-PCR 應用TRIzol試劑(Invi-trogen)從分選出的ALDH1+的乳腺癌干細胞和ALDH1-乳腺癌細胞中分別提取總RNA并按照試劑盒(SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis Kit,Invitrogen,USA)說明書操作逆轉錄成cDNA，引物序列如下：HIF-1α F primer：5′-CAGAGCAGGAAAAGGAGTCA-3′，R primer：5′-AGTAGCTGCATGATCG-TCTG-3′；SHH F primer：5′-CAGCGGAAGGTATGAAGGGAA-3′，R primer：5′-GCCAAAGCGTTCAA-CTTGTCCT-3′；PTCH1 F primer：5′-CTGGCAGGAGGAGTTGATTG-3′，R primer：5′-TTGAAGTGCTCGTACATTTGCT-3′；SMO F primer：5′-CTTTGTCATCGTGTACTACGCC-3′，R primer：5′-CGAGAGAGGCT-GGTAGGTG-3′；GLI1 F primer：5′-GAACCCTTGGAAGGTGATATGTC-3′，R primer：5′-GGCA-GTCAG-TTTCATACACAGAT-3′；GAPDH F primer：5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，R primer：5′- AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′，引物由上海生工公司合成，GAPDH作為內參。qPCR反應體系包括：2×Real-time PCR Master Mix 10 μl，上游引物(20 μmol/L)0.1 μl，下游引物(20 μmol/L)0.1 μl，cDNA template 2 μl，rTaq DNA polymerase(5 U/μl)0.4 μl，加ddH2O至20 μl。反應條件為95℃ 3 min，95℃ 30 s，62℃ 40 s，共40個循環。

1.2.4 免疫組織化學方法 免疫組化SP法及DAB顯色操作步驟均按照說明書進行。免疫組化結果采用半定量法進行判定,根據染色密度(陰性=0、弱陽性=1、中度陽性=2、強陽性=3)和陽性細胞百分比(0=陰性、1=<25%、2=25%～50%、3=51%～75%、4=>75%)的乘積計算5個高倍視野的免疫反應評分(Immuno-Reactive score,IRS)。最后結果:陰性(IRS:0)：-，弱陽性(IRS:1～4)：+，中度陽性(IRS:5～8)：++，強陽性(IRS:9～12)：+++。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)進行數據分析，對HIF-1α mRNA、SHH mRNA、PTCH1 mRNA、SMO mRNA、GLI1 mRNA在ALDH1+乳腺癌干細胞和ALDH1-乳腺癌細胞中的表達量2-ΔΔCt行One-way ANOVA檢驗，采用Pearson卡方檢驗對HIF-1α、ALDH1在TNBC或non-TNBC組織中的表達進行分析，采用Spearman等級相關分析HIF-1α和ALDH1以及Hedgehog信號分子的相互關系，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α和Hedgehog信號通路主要分子SHH、PTCH1、SMO、GLI1在ALDH1+乳腺癌干細胞和ALDH1-乳腺癌細胞中的表達 HIF-1α mRNA、SMO mRNA和GLI1 mRNA在ALDH1+乳腺癌干細胞中的表達均明顯高于ALDH1-乳腺癌細胞，差異具有顯著統計學意義(P均<0.05)，而SHH mRNA和PTCH1 mRNA在兩種細胞中的表達未見顯著性差異(P均>0.05)，見圖1。

2.2 HIF-1α和ALDH1在TNBC組織中的表達 HIF-1α抗體陽性著色部位在胞漿和胞核，ALDH1抗體陽性著色部位主要在胞漿(圖2)。在TNBC組織中HIF-1α的陽性表達率為90.0%(27/30)，與non-TNBC的陽性表達率70.0%(21/30)比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。ALDH1在TNBC組織的陽性表達率為93.3%(28/30)，亦與non-TNBC的陽性表達率66.7%(20/30)具有顯著性差異(P<0.05)。Spearman等級相關分析提示在TNBC中HIF-1α和ALDH1的表達呈正相關(r=0.53，P<0.01)，結果見表1。

2.3 HIF-1α和ALDH1的表達與TNBC臨床病理因素的關系 結果見表2，病理分期依據AJCC 標準[11]。HIF-1α在有淋巴結轉移的TNBC組織中表達明顯增高(P<0.05)，ALDH1的表達與組織學分級有關(P<0.05)，HIF-1α和ALDH1的表達均與TNM分期有關(P<0.05)。

2.4 HIF-1α和ALDH1與Hedgehog信號傳導通路分子的相互關系 本課題在前期研究中發現Hedgehog信號通路在TNBC組織中處于活化狀態，SHH和SMO的表達與TNBC的組織學分級相關，GLI1的表達與淋巴結轉移相關，SMO和GLI1的表達均與TNM分期相關[5]。本研究結果顯示在TNBC中HIF-1α的表達與SHH、SMO和GLI1均呈正相關(P均<0.05)，ALDH1的表達亦與SHH和GLI1正相關(P均<0.05)，見表3。

圖1 HIF-1α和Hedgehog信號通路主要分子在ALDH1+乳腺癌干細胞和ALDH1-乳腺癌細胞中的表達Fig.1 Expression of HIF-1α and Hedgehog signaling molecules in ALDH1+ breast cancer stem cell and ALDH1- breast cancer cell Note: The expression of HIF-1α and Hedgehog signaling molecules SHH,PTCH1,SMO and GLI1 in ALDH1+ breast cancer stem cell and ALDH1- breast cancer cell were examined by qRT-PCR.*.P<0.05,compared to ALDH1- breast cancer cell.

TypeTNBCnon-TNBCPHIF-1α8.60±2.379.47±3.66<0.05ALDH19.67±3.458.20±2.39<0.05

表2 HIF-1α和ALDH1與TNBC臨床病理因素的關系(n=30)

Tab.2 Association between HIF-1α and ALDH1 expressions and clinicopathological parameters of TNBC patients(n=30)

ClinicopathologicalparametersNo.ofcasesMedianexpressionofHIF-1αPMedianexpressionofALDH1PHistologicgrade>0.05<0.05Ⅰ82.25±0.712.33±0.50Ⅱ113.73±0.475.18±2.52Ⅲ113.91±1.044.82±1.60Lymphaticinvolvement<0.05>0.05N0123.18±0.873.83±1.40N1-2186.79±1.556.33±2.83pTNM<0.05<0.05Ⅰ73.86±1.953.86±1.95Ⅱa92.78±1.203.00±1.22Ⅱb63.00±1.552.33±0.82Ⅲa42.20±1.092.20±1.09Ⅳ42.20±1.094.00±0.00

表3 HIF-1α和ALDH1與Hedgehog信號傳導通路分子在TNBC中表達的相關性

Tab.3 Correlation of expressions between HIF-1α and ALDH1 and Hedgehog signaling molecules in TNBC

TypeSHHrPPTCH1rPSMORPGLI1RPHIF-1α0.584<0.01-0.033>0.050.467<0.010.439<0.05ALDH10.426<0.05-0.056>0.050.176>0.050.394<0.05

Note：rrepresents Spearman′s rank correlation coefficient.

圖2 HIF-1α和ALDH1在乳腺癌組織中的表達(SP,×200)Fig.2 Expression of HIF-1α and ALDH1 in breast cancer(SP,×200)Note: A.HIF-1α located in the cytoplasm and nucleus of breast cancer；B.ALDH1 located in the cytoplasm of breast cancer；C.Normal breast tissue.

3 討論

TNBC的高復發率、耐藥以及易發生遠隔臟器轉移的特性與組織內富含較多的CSC關系密切。當前臨床放化療主要對快速增殖的腫瘤細胞有效，而處于慢周期的CSC往往逃避放化療的殺滅作用[12,13]，故目前臨床上對于TNBC尚無有效治療措施。TNBC組織中CSC的分子調控機制尚不清楚，如何靶向抑制CSC的活化或消滅CSC成為目前TNBC治療的難題和關鍵。因此，了解TNBC的分子調控機制、找到靶向調控CSC的因子并應用于臨床，將會有助于改善TNBC患者的預后。

HIF-1對環境中氧的含量變化非常敏感，是維持細胞內氧代謝平衡的重要調控因子。HIF-1α是HIF-1活性亞單位，在正常氧壓情況下，HIF-1α可因前羥基化酶的羥基化而快速降解，在缺氧狀態下，HIF-1α的羥基化進程停止，穩定狀態的HIF-1α轉入細胞核，與結構表達亞單位HIF-1β結合[14,15]，形成異質二聚體再與靶基因啟動子的缺氧應答元件相結合，從而激活靶基因的轉錄[16]。HIF-1α在缺氧的腫瘤組織里往往高表達，其介導多種基因的轉錄幫助腫瘤細胞適應不利的腫瘤微環境[17,18]。Lacerda等[19]發現在乳腺腫瘤中HIF-1α沉默可減少腫瘤起始細胞的數量和活性、Conley等[20]報道經過抗腫瘤治療后在乳腺腫瘤的缺氧區域可重新出現并富含CSC，Keith等[21]報道HIF-1α過表達與乳腺癌復發和預后差有關。與這些報道類似，本研究發現在分選出的ALDH1+乳腺癌干細胞中HIF-1α的表達明顯高于ALDH1-乳腺癌細胞，同時發現HIF-1α在TNBC組織中的表達亦明顯高于其在non-TNBC中的表達，HIF-1α的表達與TNBC的淋巴結轉移和TNM分期相關，這些結果提示HIF-1α在乳腺癌干細胞的活化以及TNBC的惡性進展中發揮重要作用。

ALDH1在多發性骨髓瘤、急性髓性白血病、肺癌、前列腺癌、結直腸癌等的干細胞中均有高表達，目前已成為CSC標記物之一[22-24]。Ginestier等[25]發現ALDH1活性增加的乳腺癌患者的乳腺上皮細胞具有干/祖細胞特性，他們將ALDH1+乳腺癌細胞接種于NOD/SCID小鼠去除乳腺的脂肪墊內，發現500個ALDH1+乳腺癌細胞就能形成腫瘤，而即使接種50 000個ALDH1-細胞也不會形成腫瘤，說明ALDH1+細胞具有較強的致瘤能力。此外富含ALDH1的乳腺癌細胞擁有自我更新潛能、分化潛能以及無限增殖能力，可以重現親代腫瘤的雜合性，并與患者預后差密切相關[26,27]，提示ALDH1對于維持CSC的干性具有重要作用。Hedgehog信號通路由分泌型配體SHH、受體PTCH1以及下游信號分子SMO和GLI1等組成，原癌基因SMO和GLI1的高表達是目前公認的Hedgehog信號通路激活的標志之一。激活的Hedgehog信號通路可通過調控干細胞相關基因的表達及與其他相關信號通路和致癌因子相互作用從而維持CSC的增殖、自我更新并促進腫瘤的發生發展。本研究結果顯示ALDH1在TNBC組織中的表達明顯高于其在non-TNBC中的表達，其表達與TNBC的組織學分級和TNM分期均相關，提示ALDH1的表達增強與TNBC的惡性進展關系密切。此外，本研究發現在分選出的ALDH1+乳腺癌干細胞中Hedgehog信號通路主要分子SMO和GLI1的表達明顯高于ALDH1-乳腺癌細胞，提示在ALDH1+乳腺癌干細胞中Hedgehog信號通路活化。在TNBC組織中ALDH1的表達與SHH和GLI1的表達相關、亦與HIF-1α的表達關系密切，而HIF-1α的表達與SHH、SMO和GLI1均呈正相關。這些研究結果提示在TNBC組織中HIF-1α、ALDH1可能與Hedgehog信號通路相互作用協同促進乳腺癌CSC的活化并參與TNBC的惡性進展，但具體機制不清。因此，進一步了解在TNBC組織中CSC活化的機理、阻斷HIF-1α、ALDH1和Hedgehog信號通路的相互作用對于抑制TNBC的惡性進展、改善患者的預后可能具有重要的臨床病理意義。

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[收稿2016-04-18 修回2016-12-05]

(編輯 倪 鵬)

Research of HIF-1α,ALDH1 and Hedgehog signaling pathway cooperation involved in activation of cancer stem cell in triple negative breast cancer

HUANGLin,TENGMei-Jun,XUJing-Nan,ZHANGChun-Jie,ZHONGKe-Zhen,CHENGMing-Yang,TAOYa-Jun.

MedicalCollegeofDalianUniversity,Dalian116622,China

Objective:To explore the cooperation and clinical significance of HIF-1α,ALDH1 and Hedgehog signaling pathway in the activation of cancer stem cell(CSC) in triple negative breast cancer(TNBC).Methods: ALDH1+(Aldehyde dehydrogenase1)breast cancer stem cells and ALDH1-breast cancer cells were selected from MDA-MB-231 cells by magnetic activated cell sorting system(MACS),qRT-PCR method was employed to analyze the expression differences of HIF-1α and Hedgehog signaling molecules Sonic hedgehog(SHH),patched1(PTCH1),Smoothened(SMO) and Glioma-associated oncogene homoglog1(GLI1) in ALDH1+breast cancer stem cells and ALDH1-breast cancer cells.Immunohistochemical method was applied to study the expressions of HIF-1α and ALDH1 and the relationships among HIF-1α,ALDH1 and Hedgehog signaling molecules in TNBC.Results: The expressions of HIF-1α mRNA,SMO mRNA and GLI1 mRNA in ALDH1+breast cancer stem cell were higher than those in ALDH1-breast cancer cell(Pall<0.05).The positive expression rates of HIF-1α were 90.0% and 70.0%,and the positive rates of ALDH1 were 93.3 % and 66.7 % in TNBC and non-TNBC,respectively(Pall<0.05).Spearman rank correlation analysis showed that the expression of HIF-1α was positively related with that of ALDH1 in TNBC(r=0.53,P<0.01).HIF-1α expression was correlated with lymph node metastasis and TNM stage(Pall<0.05),ALDH1 expression was correlated with histological grade and TNM stage(Pall<0.05).In addition,the expression of HIF-1α was positively related with that of Hedgehog signaling molecules SHH(r=0.584,P<0.01),SMO(r=0.467,P<0.01) and GLI1(r=0.439,P<0.05),the expression of ALDH1 was positively related with that of SHH(r=0.426,P<0.05) and GLI1(r=0.394,P<0.05).Conclusion: HIF-1α and Hedgehog signaling pathway were activated in ALDH1+breast cancer stem cell.HIF-1α,ALDH1 and Hedgehog molecules may cooperate with each other to activate breast CSC to promote the malignant progression of TNBC.

Triple negative breast cancer；Cancer stem cell；HIF-1α；ALDH1；Hedgehog signaling

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.013

黃 琳(1995年-)，女，主要從事乳腺癌轉移機制方面的研究，E-mail:247403619@qq.com。

及指導教師：陶雅軍(1969年-)，女，博士，副教授，主要從事腫瘤干細胞多向分化機制方面的研究，E-mail:sabrinatao@sina.com。

R737.9

A

1000-484X(2017)05-0697-06

①本文為遼寧省大學生創新訓練項目(No.201511258052)。