人外周血γδT細胞免疫治療裸鼠皮下人肝癌細胞移植瘤的體內實驗研究①

夏 莉 遲艷飛 李曉峰 王 娟 劉柏林 韓桂紅 劉龑航 劉玉俠

(吉林省人民醫院，長春130021)

人外周血γδT細胞免疫治療裸鼠皮下人肝癌細胞移植瘤的體內實驗研究①

夏 莉 遲艷飛 李曉峰 王 娟 劉柏林 韓桂紅 劉龑航 劉玉俠②

(吉林省人民醫院，長春130021)

目的：研究不同劑量的人外周血γδT細胞對裸鼠人肝癌細胞(SMMC-7721)移植瘤模型的免疫治療作用。方法：①用人肝癌細胞株SMMC-7721接種BALB/c裸鼠皮下,建立肝癌裸鼠模型。②從健康人外周血中提取單核細胞，體外特異性擴增γδT細胞。③將已建立的肝癌裸鼠模型隨機分為5組,陽性對照組為5-氟尿嘧啶(5-Fu)，陰性對照組為生理鹽水，治療組用不同劑量的γδT細胞(1×105、5×105及25×105)分別注入裸鼠尾靜脈，陽性對照組用5-Fu裸鼠腹腔注射，陰性對照組用生理鹽水裸鼠尾靜脈注射。觀察不同劑量的γδT細胞對腫瘤的抑制效果，包括治療前后的體重、食物攝取量及生長狀況等，并與陽性對照組和陰性對照組比較腫瘤體積(TV)、相對腫瘤體積(RTV)和相對腫瘤增殖率[T/C(%)]變化。結果：不同劑量的γδT細胞對裸鼠移植瘤的生長有不同程度的抑制，RTV與生理鹽水陰性對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；與5-Fu陽性對照組比較，TV增長明顯低于5-Fu陽性對照組，RTV各劑量組抑制程度相似，均略高于5-Fu陽性對照組，T/C(%)各劑量組比5-Fu對照組的相對腫瘤增殖率稍低，但無顯著性差異。結論：人外周血γδT細胞對肝癌裸鼠移植瘤具有顯著的抑瘤作用,為建立肝癌免疫治療新方法提供實驗依據。

裸鼠；肝腫瘤模型；γδT細胞；免疫療法

我國是肝癌高發國家，肝癌發病人數占全球的55%，多發生在肝炎或肝硬化的基礎上，造成肝臟的儲備及再生功能降低。肝癌治療最好的方法仍是手術治療，但由于臨床所見肝癌多已進入中晚期，能夠實施根治性切除術的肝癌只是少數。

為了尋找有效的肝癌治療方法，我們研究用特異激發和擴增γδT細胞的方法，探討γδT細胞對原發性肝癌的治療作用，為肝癌的治療提供一種有效的免疫治療方法和手段。

目前，腫瘤的免疫治療在惡性腫瘤的治療中發揮著重要作用，而T淋巴細胞是免疫治療腫瘤的主要細胞，T細胞可以依據其表面受體的不同表達而分為兩類αβT細胞和γδT細胞。在抗腫瘤免疫中，由于γδT細胞對腫瘤抗原的識別不受MHC限制，而且不需要特異的抗原遞呈作用，且對多種腫瘤細胞具有細胞毒活性。所以，本研究選擇γδT細胞作為抗肝癌作用的效應細胞，通過體外特異性誘導培養，將不同劑量的γδT細胞作用于已建立的肝癌裸鼠模型，通過體內實驗，研究其對人肝癌免疫治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 CO2培養箱，德國；Olympus顯微鏡，日本；SORVALL離心機，美國；BECKMAN流式細胞儀，美國；酶標儀RS-23EL，Switch。

1.1.2 試劑 IMDM、MTT Sigma公司；胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司；PE anti-human γ/δT Cell Receptor(B1):BioLegend公司；anti-human TCRγ/δ:Biolegend公司；InterluekinⅡ(IL-2):PeproTech公司；淋巴細胞分離液:中國科學院血液學研究所；5-氟尿嘧啶(5-Fu):250 mg/10 ml，天津金耀氨基酸有限公司生產，批號:1102241。

1.1.3 瘤株 人肝癌細胞瘤株SMMC-7721由吉林省腫瘤防治研究所提供。

1.1.4 實驗動物 BALB/c雄性裸鼠50只,6～8周齡，體重20～25 g(中國醫學科學院動物中心，合格證號：0232052)，飼養于SPF級無菌飼養室，自由攝取食物和水。

1.2 實驗方法

1.2.1 γδT細胞的體外培養及鑒定 參考文獻[1]。

1.2.2 SMMC-7721人肝癌荷瘤裸鼠模型的建立 將對數期的SMMC-7721細胞經0.25%-EDTA胰酶消化細胞重懸、計數后,調整細胞濃度制備5×106個/ml的細胞懸液。選健康活潑BALB/c雄性裸鼠50只，體重20～25 g，于每只裸鼠皮膚消毒后用 1 ml注射器于左側大腿上方皮下接種細胞懸液0.1 ml，注射局部出現明顯皮丘。接種第12天即可見直徑為2～3 mm的腫瘤。以腫瘤生長至2～3 mm為成瘤標準，接種成瘤率100%。治療前各組裸鼠飲食行為均表現正常。

1.2.3 裸鼠體內抑瘤實驗

1.2.3.1 實驗分組與給藥 實驗分組：根據所注射的γδT細胞數量分組，每組10只裸鼠。每一個試驗組根據所注射的細胞數量，分為低劑量、中劑量及高劑量組。①生理鹽水陰性對照組(A組)：正常BALB/c雄性裸鼠10只，除正常飲食外，尾靜脈注射生理鹽水。注射頻率為第1～5天和第8～12天，注射生理鹽水0.2 ml。②γδT細胞低劑量組(B組)：正常BALB/c雄性裸鼠10只，除正常飲食外，尾靜脈注射γδT細胞1×105，注射頻率同生理鹽水注射相同，注射細胞液0.2 ml。③γδT細胞中劑量組(C組)：正常BALB/c雄性裸鼠10只，除正常飲食外，尾靜脈注射γδT細胞5×105，注射頻率同生理鹽水注射相同，注射細胞液0.2 ml 。④γδT細胞高劑量組(D組)：正常BALB/c雄性裸鼠10只，除正常飲食外，尾靜脈注射γδT細胞25×105，注射頻率同生理鹽水注射相同，注射細胞液0.2 ml 。⑤5-Fu陽性對照組(E組)：正常BALB/c雄性裸鼠10只，除正常飲食外，每日腹腔注射5-Fu 10 mg/kg，連續10 d。各組均自抑制成瘤試驗第30天，脫頸處死裸鼠。

1.2.3.2 注射γδT細胞劑量的確定[2]是以60 kg的成人為基準，γδT細胞在臨床預期使用劑量為1×109～1×1010個細胞(約1.6×107～1.6×108個細胞/kg)。把臨床預期劑量中的最大劑量設定為注射劑量時，以裸鼠體重20 g為基準，其臨床預期劑量相當于5×105～5×106個細胞/只。以臨床預期劑量中的5×105個細胞/只作為中劑量，按5倍數量計算，設定了1×105、5×105及 25×105個細胞/只(0.2 ml)的注射劑量。

1.2.4 觀察及評估項目

1.2.4.1 一般癥狀的觀察 注射期間，觀察一般狀態的變化、運動性、外觀等的一般癥狀，每周至少觀察5次并掌握是否有死亡動物。

1.2.4.2 體重的測量 試驗動物的體重，在分組及注射期間，每周測量5次。

1.2.4.3 腫瘤的體積 注射期間，每周5次使用測徑器測量腫瘤的長軸及短軸，并計算測量的腫瘤體積，每次測量瘤徑后計算腫瘤體積(mean tumor volume，TV)、相對腫瘤體積(relative tumor volume,RTV)和相對腫瘤增殖率[T/C(%)]，計算公式如下：(1)TV(mm3)=AB2/2，其中A、B分別表示腫瘤的長和寬;(2)RTV=Vt/V0，其中V0為分組給藥時(即d0)所測得的腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積；(3)T/C(%)=TRTV/CRTV×100%，其中TRTV為治療組的RTV，CRTV為陰性對照組的RTV。療效評價標準:T/C>60%為無效，T/C≤60%，并經統計學處理P<0.05為有效。

2 結果

2.1 一般癥狀 在注射試驗物質的期間，除生理鹽水組有1只裸鼠第12天死亡外，其余裸鼠沒有發現特異的癥狀。

2.2 體重的測量 各組裸鼠在治療期間體重均有不同程度的下降(表1)。裸鼠體重變化圖見圖1。由圖1可知，除γδT(1×105)組下降比其余組略明顯外，其余各組裸鼠體重變化趨勢和程度基本一致。

2.3 瘤體積 裸鼠瘤體積生長情況見表2。腫瘤體積生長曲線見圖2。由圖2可知，各組裸鼠給藥后前5 d腫瘤生長情況基本沒有差別；在給藥后第5天開始，5-Fu(10 mg/kg)組裸鼠與生理鹽水對照組的裸鼠腫瘤體積增長趨勢一致，曲線上升明顯；注射不同濃度γδT細胞液的各組裸鼠的腫瘤體積增長趨勢一致，曲線明顯低于生理鹽水組和5-Fu對照組。

2.4 RTV(相對腫瘤體積)值的測量 經測量裸鼠瘤體積與第1天給藥時瘤體積，根據公式計算得到RTV值，結果見表3。由表3可知，與生理鹽水陰性對照組相比，γδT細胞液各劑量組和5-Fu組均在第10至15天開始有顯著差異，即腫瘤體積得到明顯抑制，γδT細胞各劑量組抑制程度相似，均略高于5-Fu組。

2.5 相對腫瘤增殖率[T/C(%)] 經計算各實驗組裸鼠相對腫瘤增殖率見表4。經SPSS統計分析結果可知，受試的γδT細胞液各劑量組與5-Fu陽性對照組的T/C(%)之間無顯著差異。給裸鼠注射不同濃度γδT細胞液后的第10～15天，腫瘤生長抑制療效顯著。注射γδT細胞液的各劑量組比5-Fu陽性對照組的相對腫瘤增殖率稍低，但無顯著性差異。

DaysoftreatmentAgroupBgroupCgroupDgroupEgroupd5-1.9±3.3-2.9±3.1-5.3±2.21)2)-1.9±3.9-2.0±1.6d10-4.0±6.0-7.9±2.51)2)-5.3±2.4-2.3±5.9-2.8±2.6d15-10.1±9.4-14.3±5.82)-10.4±4.5-10.8±6.0-8.6±4.4d19-14.9±30.4-11.5±7.7-6.9±6.5-6.7±7.7-7.5±6.6d25-12.8±32.0-7.8±10.0-1.3±5.7-2.1±9.40.7±7.2d29-15.5±31.1-7.5±9.8-4.8±4.5-3.1±9.2-2.9±8.2

Note：Compared with A group，1)P<0.05;compared with E group，2)P<0.05.

DaysoftreatmentAgroupBgroupCgroupDgroupEgroupd145.04±29.4459.93±47.3965.85±43.0053.46±35.2653.32±34.38d565.07±44.4960.20±22.1968.12±39.8358.95±42.4669.89±31.12d10118.00±107.3567.08±24.0773.83±37.2476.04±43.73110.25±71.86d15151.17±138.87 67.42±30.741)83.12±60.30 74.36±58.411)126.08±81.79d19171.53±133.07135.10±80.56151.24±109.39126.79±97.55189.75±102.77d25203.56±174.00154.51±112.65175.49±126.34168.79±174.71202.12±110.28d29282.77±268.08155.60±93.66165.97±121.67169.37±150.48246.94±141.87

Note：Compared with A group，1)P<0.05;compared with E group，2)P<0.05.

TimeAgroupBgroupCgroupDgroupEgroupd51.76±1.301.42±0.711.23±0.581.40±0.811.35±0.62d105.95±9.691.61±1.011)1.51±1.091)1.50±0.551)2.01±1.291)d158.12±13.741.59±1.121)1.36±0.571)1.63±1.041)2.20±1.061)d199.35±22.072.95±1.762.44±1.282.25±0.883.50±1.78d2510.43±25.003.23±2.052.94±1.482.54±1.483.70±1.79d2921.51±58.383.38±2.072.71±1.332.67±1.604.48±2.15

Note：Compared with A group，1)P<0.05;compared with E group，2)P<0.05.

圖1 各實驗組裸鼠體重變化Fig.1 Weight change of each experimental group nude mice

圖2 各實驗組裸鼠腫瘤體積生長變化圖Fig.2 Tumor volume growth and change graph of each experimental group nude mice

圖3 各實驗組裸鼠瘤體大小Fig.3 Tumor size of each experimental group nude miceNote: 1.A group，tumor size 10 mm×9 mm;2.E group，tumor size 9 mm×9 mm;3.B group，tumor size 7.5 mm×7.5 mm;4.C group,tumor size 7.0 mm×7.0 mm;5.D group，tumor size 7.0 mm×6.8 mm.

表4 各實驗組裸鼠相對腫瘤增殖率[T/C(%)]

Tab.4 Relative tumor proliferation rate of each experim-ental group[T/C(%)]

TimeafterinjectionBgroupCgroupDgroupEgroupd580.769.979.576.7d1027.11)25.41)25.21)33.81)d1519.61)16.71)20.11)27.11)d1931.626.124.137.4d2531.028.224.435.5d2915.712.612.420.8

Note:1) represents the treatment is effective.

3 討論

細胞免疫治療已經在多種腫瘤中顯示出有效性[3-5]。γδT細胞是機體的一種免疫細胞，主要以非MHC限制方式識別抗原，可以分泌多種細胞因子誘發獲得性免疫反應，被認為是聯系機體固有免疫和適應性免疫的一種非傳統T細胞，在機體的抗感染、抗腫瘤等方面發揮重要作用[6，7]。研究表明，γδT細胞對包括肝細胞癌、大腸癌、肺癌、前列腺癌在內的多種類型的腫瘤細胞都表現出較強的細胞毒性[8，9]。

康寧等[10]研究結果表明：體外擴增的γδT細胞在腫瘤組織中的分布取決于腫瘤局部CCR5和CXCR3配體分子的表達情況，高表達這些趨化因子的腫瘤可以作為γδT細胞過繼免疫治療的適應證。李華等[11]報道γδT細胞對宮頸癌細胞體外殺傷作用，發現體外培養的γδT細胞具有明顯的殺傷宮頸癌細胞株SiHa和HeLa細胞的能力。

本實驗通過不同劑量的γδT細胞，以5-Fu為陽性對照，以生理鹽水為陰性對照，研究其對裸鼠人肝癌細胞SMMC-7721移植瘤模型的免疫治療作用。實驗發現：靜脈注射γδT細胞有明顯腫瘤抑制作用，效果比5-Fu強。生理鹽水陰性對照組有1只裸鼠死亡，5-Fu陽性對照組、γδT細胞的低劑量、中劑量及高劑量組無死亡動物。綜上所述，人外周血γδT細胞對肝癌裸鼠移植瘤具有顯著的抑瘤作用,為肝癌免疫治療提供了一種新的治療方法。

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[收稿2016-08-23 修回2016-10-13]

(編輯 張曉舟)

Immunotherapy experimental study of γδT cells from human peripheral blood on human liver cell nude mouse xenograft in vivo

XIALi,CHIYan-Fei,LIXiao-Feng,WANGJuan,LIUBai-Lin,HANGui-Hong,LIUYan-Hang,LIUYu-Xia.

People′sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China

Objective:To study the immunotherapy effects of different doses of human peripheral blood γδT cells on human hepatoma cells (SMMC-7721) xenograft model.Methods: (1)The nude mouse model of liver cancer was established by inoculated BALB/c mouse subcutaneous with human hepatoma cell line (SMMC-7721).(2)The mononuclear cells in healthy human were extracted from peripheral blood,and specific amplification γδT cells in vitro.(3) The nude mouse model divided into 5 groups by random.The positive control group was 5-Fu,negative control group was normal saline(NS).The treatment group was injected different doses of γδT cells(1×105,5×105and 25×105)by nude mice tail vein.The positive control group injected 5-Fu by enterocoelia,negative control group injected NS by tail veins.The inhibition effect of different dose γδT cells on tumor was observed,including weight，food intake and growth conditions,etc.and the changes of tumor volume (TV)，relative tumor volume (RTV)and relative tumor appreciation rate[T/C(%)] were compared with positive control group and negative control group.Results: Different dose of γδT cells had different degree of inhibition on nude mouse xenograft growth.RTV compared with saline negative control group was statistically significant (P<0.05).Compared with the positive control group of 5-Fu,the TV growth was significantly lower than the 5-Fu,degree of inhibition was similar in RTV each dose group,and all slightly higher than the 5-Fu positive control group.The each dose group of T/C (%)was slightly lower than the relative tumor proliferation rate of the control group of 5-Fu,but had no significant difference.Conclusion: The γδT cells from peripheral blood had significant inhibitory effect on nude mice transplanted liver tumor and it may be used as a new treatment for liver cancer immunotherapy provide experimental data.

Nude mice;Liver tumor model;γδT cell;Immunotherapy

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.014

①本文受吉林省科技發展計劃項目(20160101197JC)資助。

夏 莉(1960年-)，女，醫學碩士，科主任，主任醫師，教授，碩士生導師，主要從事肝癌、胃癌、肺癌等研究工作，E-mail：15843076550@139.com。

R392.12

A

1000-484X(2017)05-0702-05

②通訊作者，E-mail：lyxia620126@163.com，吉林省腫瘤防治研究所，長春130012。