熱休克蛋白90α熒光免疫層析檢測方法的建立

王云龍 李 娜 李玉林 王繼創 程 蕾 高玉紅

(鄭州大學生命科學學院，鄭州450001)

熱休克蛋白90α熒光免疫層析檢測方法的建立

王云龍 李 娜 李玉林①②王繼創①②程 蕾①②高玉紅②③

(鄭州大學生命科學學院，鄭州450001)

目的：建立人血清中熱休克蛋白90α(HSP90α)的熒光免疫層析定量檢測方法。方法：采用熒光免疫層析技術，對熒光微球制備、最佳反應時間、線性范圍、精密性、回收率、臨床檢測等方面進行系統研究。結果：確定了各反應條件，最佳反應時間為5 min。線性范圍0.39～100 ng/ml。精密性質控品高值(30 ng/ml)CV=8.14%；低值(10 ng/ml)CV=9.26%，高、中、低值血清的回收率為100.56%、99.76%、94.1%；與國外試劑盒(ELISA檢測方法)平行檢測40份臨床血清，結果顯示兩者相關系數為0.968 5。結論：初步建立的方法具有良好的精密性和線性，臨床符合率能滿足臨床檢測技術要求，有望完善后報批用于臨床。

熒光免疫檢層析法；熱休克蛋白90α；熒光微球活化

熱休克蛋白90α (Heat shock protein 90α，HSP90α)是細胞受應激原刺激后誘導產生的應激蛋白[1]，在腫瘤組織中HSP90α表達量是健康組織的2～10倍[2]。其在血液中的含量與腫瘤惡性程度呈正相關[3]。Hsp90α作為一種全新腫瘤標志物[4]，用于肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、結直腸癌等多個腫瘤的臨床檢測[5,6]。患者血漿中HSP90α含量的高低與病情變化有較好的對應性[7]，可實時、較準確地反映治療效果，可為醫生提供臨床診斷、治療、預后客觀依據。鑒于此，HSP90α的檢測技術是目前國內外領域內研究的熱點，技術上已有酶聯免疫吸附法、膠體金免疫層析法、免疫比濁法、化學發光法等用于臨床的報道[4,8]，但缺乏可用于床旁檢測的熒光層析檢測方法。本實驗針對此方法進行系統研究。

1 材料與方法

1.1 材料 HSP90α抗體線性參考品P1-P11(依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195 ng/ml和0 μg/ml)、精密性質控品L1L2分別為30 ng/ml和10 ng/ml、HSP90α配對抗體、羧基熒光微球、硝酸纖維素膜、玻璃纖維棉、羊抗鼠多克隆抗體均由河南生物工程技術研究中心提供，人HSP90α重組蛋白抗原購自武漢三鷹，抗HSP90α抗體檢測對照試劑盒購自加拿大StressMarq,Victoria，臨床血清標本由鄭州大學第一附屬醫院提供，無溶血，乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病(C5項)檢測陰性，其他化學試劑均為分析純。三維平面點膜噴金儀(上海金標生物科技)、超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、熒光檢測儀[艾維博特(天津)生物科技有限公司]、電熱恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗組分 按照河南省生物技術研究中心已建立的技術方法確定的羧基熒光微球、硝酸纖維素膜、玻璃纖維棉、HSP90α配對抗體、羊抗鼠多克隆抗體，熒光微球的標記、包被按文獻[9]進行。

1.2.2 熒光微球的活化條件確定 (1)取硼酸緩沖液(0.05 mol/L，pH8.2)，加入10 μl羧基微球，混勻后加入10 μl EDC溶液(10 μg/ml)，漩渦混勻器混勻活化15 min。然后離心(16 000 r/min,10 min)，棄上清，在沉淀中加入500 μl硼酸緩沖液(0.05 mol/L，pH8.2)，進行超聲分散。(2)超聲分散功率和時間選用以下條件：100 W，2 min；100 W，4 min；100 W，6 min。300 W，2 min；300 W，4 min；300 W，6 min；分散后加入抗HSP90α單抗5 μl，振蕩偶聯2 h。(3)加入55 μl，10倍濃縮封閉液振蕩2 h，然后離心(16 000 r/min,10 min)，棄上清，加入復溶液1 000 μl，2 000 μl，3 000 μl，再按照上述條件進行再次超聲分散。(4)將免疫微球溶液每100 μl 鋪3 cm長度微球墊。放在恒溫干燥箱37℃干燥2 h。

1.2.3 最佳制備工藝的研究

1.2.3.1 包被 (1)把PVC板中間黏性紙揭掉，將NC膜組裝在PVC板上；(2)HSP90α多抗和羊抗鼠稀釋到1 mg/ml分別作為T線和C線；(3)用三維噴金劃膜儀將包被抗體和羊抗鼠以1 μl/cm的量劃在硝酸纖維素膜上；(4)將包被好的NC膜放入電熱恒溫干燥箱37℃干燥2 h。

1.2.3.2 組裝 在PVC底襯上端粘貼吸水紙，下端粘貼樣品墊，吸水紙內端與樣品墊內端各自與硝酸纖維素膜一段重疊，在樣品墊與硝酸纖維素膜的中間夾置粘貼結合墊。用切條機將組裝完成的PVC板切割成3.9 mm寬的條，放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。

1.2.4 反應模式的確定 滴加樣品P1的試紙條分別在反應2、3、4、5、6、7 min后進行檢測，觀察到檢測結果。

1.2.5 性能評價

1.2.5.1 線性范圍的確定 取熒光微球免疫層析實驗最佳工藝試紙條，以熒光定量檢測儀讀數為縱坐標，定值血清參考品(P1-P11)濃度為橫坐標，分別檢測3次，分別取多于5個點，繪制標準曲線，選擇最佳線性范圍。

1.2.5.2 精密性檢測 取精密性質控品血清L1L2各20份，對同一批HSP90α熒光免疫檢測試紙條進行檢測，檢測3次計算批內精密性。精密性CV=SD/平均數×100%。

1.2.5.3 回收率實驗 用HSP90α低值血清稀釋高值血清獲得預測濃度為100、50和20 ng/ml的3份血清，通過線性參考品標定這3份血清，通過公式:回收率=測定濃度/預測濃度×100%，計算所制備的HSP90α檢測試劑的回收率。

1.2.5.4 對比實驗 以建立的人HSP90α熒光免疫層析定量檢測方法，與抗人HSP90α檢測 (ELISA)試劑盒(StressMarq,Victoria,Canada)平行檢測40份臨床癌癥患者血清標本，評價制備的熒光免疫層析定量檢測方法的檢測效果。

2 結果

2.1 熒光微球活化實驗結果對比 超聲功率100 W和超聲時間2 min，加入復溶液3 000 μl時的線性效果最好，檢測范圍0.78～50 ng/ml時，Height T/C R2達到0.975 4。見表1。

2.2 最優檢測時間 滴加樣品后5 min進行檢測，線性范圍最佳。

2.3 精密性 用建立的HSP90α定量檢測方法及精密性質控品L1和L2，分別對同批次的熒光免疫層析試紙條進行精密性檢測，L1批內精密性檢測結果：均值28.98；SD值2.36；CV值為8.14%。L2批內檢測結果：均值9.82；SD值0.91；CV值為9.26%。CV%均低于10%，符合精密性要求。CV%均低于10%。

2.4 線性范圍確定 對峰高數據分析，如圖1,R2=0.984 1，試紙條最佳線性范圍為0.39～100 ng/ml。

2.5 回收率實驗 用低值血清稀釋高值血清獲得的高中低值3份血清進行回收率檢測。結果顯示如表2，高值血清的回收率為 100.56 %;中值血清的回收率為99.76%;低值血清的回收率為94.1%，滿足回收率85%～115%的要求。

表1 微球活化實驗線性檢測結果

Tab.1 Linear test results of fluorescent microsphere activation

NumberUltrasonicpowerandtimeComplexsolutionaddition(μl)HeightT/CR2AreaT/CR21100W,2min10000.950.952100W,4min10000.940.933100W,6min10000.920.914300W,2min10000.880.895300W,4min10000.870.776300W,6min10000.750.767100W,2min20000.9620.968100W,4min20000.930.929100W,6min20000.900.8910300W,2min20000.870.8611300W,4min20000.860.8512300W,6min20000.820.8013100W,2min30000.970.9714100W,4min30000.880.8715100W,6min30000.780.7616300W,2min30000.830.8217300W,4min30000.760.7518300W,6min30000.730.72

圖1 Height 標準曲線Fig.1 Height sandard curve

表2 回收率結果

Tab.2 Recovery result

GroupsPredictedconcen-tration(ng/ml)concentrationdeter-mination(ng/ml)Recovery(%)Highrecovery1001100.56Medium50499.76Low20194.10

2.6 臨床相關性檢測 結果如圖2，兩者具有很好的相關性，相關方程為：Y=0.919 4x+1.083 3,R2=0.968 5。

圖2 熒光層析與ELISA診斷試劑盒試劑盒測定結果的相關性Fig.2 Linear correlation between constracted immunochromatographic assay and ELISA measureme-nt assay

3 討論

熒光層析檢測方法是在熒光染料標記技術上發展起來的[10]，熒光染料發射光譜型標記物，信號強度可隨激發光增強而增強，在理論上有效降低了層析方法的檢測限。具有檢測快速、穩定性好、重復性好、既可定性又可定量等優點[11-13]，本實驗統計學方法參考《體外診斷試劑分析性能評估系列指導原則(征求意見稿)》，檢測方法與ELISA診斷試劑盒對比相關性良好，有可能為臨床檢測提供一種準確可靠的檢測方法，并有望在臨床檢測上進行推廣形成系列試劑，提升整個診斷試劑行業的技術水平。在本實驗中熒光微球聚集不容易分散是困擾該方法建立的一大難題，我們借鑒超聲技術不同的功率和時間可以造成不同的清洗效果原理[14]，選擇一定范圍的功率和作用時間進行超聲處理，獲得良好的實驗效果(設置超聲功率100 W和超聲時間2 min)。率先利用超聲清洗技術進行微球活化具有創新性，可作為其他研究的借鑒。

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[收稿2016-12-30 修回2017-02-20]

(編輯 張曉舟)

Establishment of quantitative fluorescence immunochromatographic assay detection method for heat shock protein 90α(HSP90α)

WANGYun-Long,LINa，LIYu-Lin,WANGJi-Chuang,CHENGLei，GAOYu-Hong.

SchoolofLifeScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China

Objective:To establish quantitative a fluorescence immunochromatographic assay detection method for the heat shock protein 90α(HSP90α)in human serum.Methods: Indirect the technology of fluorescence microshers immunochromatographic assay was used to research fluorescent microsphere activation,ensure optimal testing time,determine linearity range,precision,recovery experiments,testing clinical samples and that sort of thing in the fluorescence immunochromatographicassay experiment.Results: In all the reaction conditions,it was determined that the optimal teaction time was 5 minutes,and in the best line range (0.39-100 ng/ml) precision quality control materials of high recovery (30 ng/ml) Intra-assay CV was 8.14%; quality control materials of low recovery (10 ng/ml) Intra-assay CV was 9.26%.With high,medium and low recovery of serum recovery was 100.56%,99.76%,94.1%,separately.Foreign kit(ELISA) for detection of 40 cancer patients clinical serum,the result showed that the correlation was 0.968 5.Conclusion: Establishing the method initially quantitative fluorescence immunochromatographic assay for the heat shock protein 90α(HSP90α)in human serum have high performance and linear,clinic accordance rate also can satisfy the demand of clinic quantitative detection，and will improve hopeful to applied to clinic after apprroved.

Fluorescence immunochromatographic assay detection method;Heat shock protein 90α (HSP90α);Fluorescent microsphere activation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.016

王云龍(1962年-)，男，教授，博士生導師，主要從事生物制藥方面的研究，同時就職于河南省生物工程技術研究中心，E-mail:biowyl@126.com。

R446.6

A

1000-484X(2017)05-0712-04

①河南省生物工程技術研究中心，鄭州450010。

②鄭州市生物制藥重點實驗室，鄭州450010。

③鄭州職業技術學院，鄭州450010。