RA患者外周血和關節(jié)炎大鼠破骨細胞miRNAs異常表達譜比較及特征性miRNA功能分析①

袁呈晨 耿 姍 朱亞梅 彭孝武 周學平 周玲玲

(南京中醫(yī)藥大學,南京210023)

·臨床免疫學·

RA患者外周血和關節(jié)炎大鼠破骨細胞miRNAs異常表達譜比較及特征性miRNA功能分析①

袁呈晨 耿 姍 朱亞梅②彭孝武 周學平 周玲玲

(南京中醫(yī)藥大學,南京210023)

目的：篩選類風濕關節(jié)炎(RA)患者外周血與關節(jié)炎大鼠破骨細胞的miRNAs異常表達譜，分析RA的特征性miRNAs及其功能。方法：采用miRNAs芯片，篩選RA患者與正常人外周血、共培養(yǎng)誘生的關節(jié)炎大鼠破骨細胞與正常基質細胞的miRNAs表達譜的差異；Real time PCR對芯片結果進行驗證；生物信息學方法對關鍵miRNA進行功能分析。結果：與正常人相比，RA患者外周血中具有差異表達的miRNAs有189個；與單核細胞比較，破骨細胞中具有差異表達的miRNAs有211個，其中miR-15b-5p等10個miRNAs在RA患者外周血及大鼠破骨細胞中均異常表達。Real time PCR驗證結果與芯片檢測結果具有一致性。生物信息學分析結果顯示特征性miRNA的靶基因顯著富集在VEGF，MAPK信號通路等信號通路。結論：部分miRNAs在RA患者外周血及關節(jié)炎大鼠破骨細胞中的異常表達具有一致性，其可能作為RA的特征性miRNAs，通過調控相關信號通路干預破骨細胞分化等病理過程。

微小RNA;類風濕關節(jié)炎;破骨細胞

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種病因未明的慢性炎癥性自身免疫病，可致關節(jié)畸形和功能喪失，而關節(jié)局部的骨質破壞是導致關節(jié)功能損壞的重要因素。本項目組針對RA的病理機制進行了大量體內外研究，并建立了RA滑膜成纖維細胞和外周血共培養(yǎng)誘生破骨樣細胞等多種細胞模型，證實了RA滑膜炎和骨破壞之間的密切聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)了細胞因子網絡和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)等信號分子在RA中的重要作用，以及各關鍵分子的交互聯(lián)系[1-3]，但其復雜的機制為確定關鍵靶位帶來困難。微小RNA (microRNAs,miRNAs)是一種長約22個核苷酸的非編碼RNA分子，具有調控生物的發(fā)育、增殖、凋亡等功能，其表達的異常與RA等自身免疫病的關系也日益受到關注，如異常表達的miR-155、miR-125a通過影響細胞因子和TRAF6等信號分子干預RA滑膜炎和骨破壞等病理過程[4,5]。同時，miRNAs的多靶點、多環(huán)節(jié)特點提示了其可能在RA復雜病機中起著關鍵的作用。

國內外針對RA中miRNAs的異常表達雖進行了較多研究，但考慮到miRNAs表達可能存在的種屬差異，本研究擬選擇RA患者和正常人外周血；共培養(yǎng)誘生的關節(jié)炎大鼠破骨細胞和正常基質細胞，分別采用miRNA芯片檢測其miRNAs表達譜，分析RA中異常表達的miRNAs，并比較不同種屬異常表達的一致性，探尋RA相關的特征性miRNAs，并通過初步的功能分析，為進一步的機制研究提供有意義的線索和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 卡介苗(上海瑞楚生物工程有限公司，批號201408)；液體石蠟(西隴化工股份有限公司，批號140927)；羊毛脂(國藥集團化學試劑有限公司，批號20141117)；Trizol(美國Ambion公司，批號10296010)；胎牛血清(Gibco公司，批號1619679)；RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco公司，批號8115448)；a-MEM培養(yǎng)液 (Gibco公司，批號8115309)；大鼠外周血淋巴細胞分離液(天津灝洋華科生物科技有限公司，批號20160215)。

1.1.2 儀器 超凈工作臺(美國Thermo公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限公司)；TSZ5-WS型離心機(上海盧湘儀儀器有限公司)；TD6001型電子天平(天津天馬儀器廠)；FA1204B型分析天平(上海精科天美科學儀器有限公司)；DK-S28型電熱恒溫震蕩水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；熒光定量PCR(美國羅氏公司)；紫外分光光度計(美國Thermo公司)；Axon GenePix 4000B掃描儀(德國Axon Instruments)。

1.1.3 動物 動物選用清潔級雄性SD大鼠60只，體重180～220 g，購自浙江省實驗動物中心，生產許可證號SCXK(浙)2014-0001，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心，每天人工光照12 h，室溫(23±2)℃，相對濕度50%～60%。

1.2 方法

1.2.1 臨床樣本收集 選用江蘇省中醫(yī)院陰虛絡熱證RA患者5例，健康志愿者5例，肘正中靜脈獲取抗凝血樣本。離心獲血漿，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 佐劑性關節(jié)炎大鼠(Adjuvant induced arthritis,AIA)滑膜成纖維細胞與單核細胞共培養(yǎng)模型的建立 選取雄性SD大鼠，200～220 g，參照文獻[6]建立AIA模型。28 d取新鮮抗凝血，分離單核細胞；處死取雙側膝關節(jié)滑膜組織，培養(yǎng)滑膜成纖維細胞；另取正常雄性大鼠新鮮抗凝血，分離單核細胞作為對照。6孔培養(yǎng)板內加入106ml-1單核細胞2 ml，滑膜成纖維細胞制備成105ml-1細胞懸液，加入6孔培養(yǎng)板內的懸掛式Transwell小室內，置5%CO2培養(yǎng)箱37℃共培養(yǎng)誘生破骨細胞，隔天換液，3周后收集分化的破骨細胞提取總RNA。正常單核細胞培養(yǎng)2～3 d提取總RNA作對照。

1.2.3 總RNA抽提 按照說明書提取各樣本中總RNA，并對RNA進行質量檢測。

1.2.4 miRNA芯片篩選 miRNA芯片檢測與分析由上海康成生物有限公司完成。采用miRCURYTMArray Power Labeling kit 進行標記，再應用miRCURYTMLNA Array (v.18.0)進行芯片雜交，雜交完成以Wash buffer kit清洗芯片，使用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片。數據進行分析，以兩種樣本比值≤0.5或≥1.5為標準判定差異表達的miRNA。

1.2.5 Real time PCR驗證 對芯片篩選的部分異常miRNAs進行驗證，按照試劑盒操作步驟進行Real time PCR反應，在Real time PCR儀上進行反應：95℃，10 min；40個PCR循環(huán)(95℃，10 s；60℃，60 s)，收集熒光。擴增反應結束后，按(95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s)；并從60℃緩慢加熱到99℃。各樣品的目的miRNAs和內參分別進行Real time PCR反應。數據采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.2.6 生物信息學分析 選擇表達差異顯著的miRNA，采用miRNAs常用靶基因預測數據庫TargetScan和miRanda對目的基因進行基因預測，取兩個數據庫預測的交集靶基因進行功能富集分析(GO分析)和KEGG信號通路富集分析。

2 結果

2.1 芯片樣品RNA質檢結果 使用NanoDrop ND-1000定量RNA并檢測RNA質量。A260/A280比值表示RNA純度，均接近2.0，說明RNA純度越高。A260/A230比值大于1.8，說明雜質較少，符合miRNA芯片質量要求。

2.2 miRNAs芯片篩選結果 miRNAs芯片結果顯示(圖1)：與正常人相比，RA患者外周血異常表達的miRNAs有189個，其中119個miRNAs表達上調，70個miRNAs表達下調(部分結果見表2)；與正常大鼠單核細胞相比，共培養(yǎng)的大鼠破骨細胞異常表達的miRNAs有211個，其中88個miRNAs表達上調，123個miRNAs表達下調(部分結果見表3)；其中miR-15b-5p、miR-30e-5p、miR-26b-5p、let-7g-5p、miR-30b-5p、miR-140-5p、miR-410-5p、miR-340-3p等10個miRNAs在RA患者與關節(jié)炎大鼠破骨細胞中均異常表達(結果見表4)。

表1 實時定量PCR引物

Tab.1 List of primers used in Real time PCR

NamePrimersequenceshsa-miR-155-5pGSP:5'GGGGGTAATGCTAATCGTGAT3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'hsa-miR-143-3pGSP:5'GGGATGAGATGAAGCACT3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'rno-miR-15b-5pGSP:5'GGGTAGCAGCACATCATGG3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'rno-miR-26b-5pGSP:5'GGGGTTCAAGTAATTCAGG3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'rno-let-7g-5pGSP:5'GGGGGATGAGGTAGTAGTTTGT3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'

Note：GSP.Corresponding to the specific primers of miRNAs；R.The primers.Match the Real time primers.

圖1 miRNAs聚類分析圖Fig.1 Hierarchieal Clustering of differentially expressed miRNAs chipNote: A.Hierarchieal Clustering of differentially expressed miRNAs between RA and normal;B.Hierarchieal Clustering of differen-tially expressed miRNAs between osteoclasts and monocytes in rats.

2.3 Real time PCR芯片驗證結果 根據芯片篩選結果，選擇了5個異常表達的miRNAs進行PCR驗證，結果顯示(圖2)：PCR檢測中miR-155-5p，miR-143-3p在RA患者中的表達分別是正常人的1.44倍和0.38倍，而芯片檢測中的表達倍數分別是2.26倍和0.44倍(圖2A)；PCR檢測中miR-15b-5p、miR-26b-5p、let-7g-5p在大鼠破骨細胞中的表達分別是正常基質單核細胞的0.207倍、0.174倍和0.363倍，而芯片檢測中的表達倍數為0.09倍、0.27倍和0.22倍(圖2B)。上述結果提示Real time PCR驗證的結果與芯片結果具有一致性，表明miRNAs芯片是可靠的。

表2 RA患者與正常人外周血部分miRNAs的表達差異情況

Tab.2 Some differential miRNAs expressions between RA patients and normal persons

IDmiRNAFoldchange(RA/Normal)28019hsa-miR-10a-3p2.12334675↑42778hsa-let-7g-3p2.81878831↑145826hsa-miR-18b-3p4.96012725↑4700hsa-miR-155-5p2.25516526↑28019hsa-miR-10a-3p2.12334675↑168569hsa-miR-5088-5p2.69378961↑42738hsa-miR-340-3p0.32036336↓145968hsa-let-7d-5p0.36316350↓146086hsa-miR-30a-5p0.46006253↓146112hsa-miR-30b-5p0.35566080↓17506hsa-miR-24-3p0.46442241↓145889hsa-miR-196b-5p0.39154356↓

Note：Fold change<0.5，down-regulated expression，↓；Fold change>1.5，up-regulated expression，↑.

表3 關節(jié)炎大鼠破骨細胞與正常基質單核細胞部分miRNAs的表達差異情況

Tab.3 Some differential miRNAs expressions between osteoclasts in AIA rats and monocytes in normal rats

IDmiRNAFoldchange(OC/MNC)11208rno-miR-2072.56367420↑10928rno-miR-125a-5p6.73010043↑145820rno-let-7c-5p2.25026250↑147199rno-miR-27b-3p2.93148929↑168569rno-miR-31a-5p19.56735615↑28019rno-miR-24-3p2.43921725↑10947rno-miR-142-3p0.13220152↓17506rno-miR-300-5p0.46558970↓33902rno-miR-128-3p0.01629757↓147366rno-miR-320-5p0.46476498↓169394rno-miR-1843a-5p0.23304342↓29490rno-miR-7a-5p0.11805196↓

Note：Fold change<0.5，down-regulated expression，↓；Fold change>1.5，up-regulated expression，↑.

表4 RA患者外周血與關節(jié)炎大鼠破骨細胞異常表達具有一致性的miRNAs

Tab.4 Similar abnormal expressions of miRNAs in RA patients and osteoclasts in AIA rats

IDmiRNAFoldchange(RA/Normal)Foldchange(OC/MNC)17280miR-15b-5p0.49764↓0.08986↓28191miR-30e-5p0.42093↓0.11546↓146008miR-26b-5p0.36806↓0.27036↓46438let-7g-5p0.3667↓0.21951↓146112miR-30b-5p0.35566↓0.39997↓4700miR-140-5p0.3216↓0.21801↓148187miR-410-5p0.24172↓0.04288↓29872miR-340-3p0.32036↓0.49066↓147198miR-26a-5p0.34193↓0.35492↓4700miR-155-5p2.25517↑1.64294↑

Note：Fold change<0.5，down-regulated expression，↓；Fold change>1.5，up-regulated expression，↑.

圖2 Real time PCR與miRNA芯片結果的一致性比較Fig.2 Comparison of miRNA fold-changes by miRNA microarray and Real time PCR

2.4 特征性miRNA的靶基因及靶信號蛋白的生物信息學分析結果

2.4.1 靶基因預測結果 選擇異常表達的miR-15b-5p，應用Targetscan 和miRanda 2個數據庫進行靶基因預測并取交集基因，共發(fā)現(xiàn)交集基因703個，部分可能與RA相關的交集靶基因見表5。

2.4.2 靶基因功能GO分析結果 對預測的靶基因進行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)miR-15b-5p靶基因主要參與了蛋白結合，細胞內蛋白修飾，細胞分化，蛋白定位等生物過程(P<0.01)，結果見圖3。

2.4.3 miR-15b-5p靶基因的信號通路富集分析結果 采用DAVID數據庫進行基于KEGG數據庫的生物通路富集分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)miR-15b-5p靶基因主要富集在腫瘤、促性腺激素釋放激素、環(huán)鳥苷酸-蛋白激酶G、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、神經營養(yǎng)因子(Neurotrophin)、MAPK、環(huán)磷酸腺苷、轉化生長因子(Transforming growth factor beta,TGF-β)、T細胞受體等信號通路中(P<0.01)。

圖3 miR-15b-5p潛在作用靶標GO生物學過程富集分析Fig.3 Gene Ontology enrichment analysis of target genes of miR-15b-5p

圖4 miR-15b-5p潛在作用靶標信號通路的富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of target genes of miR-15b-5p

表5 Targetscan和miRanda中miR-15b-5p的部分交集靶基因

Tab.5 Some intersection target genes of miR-15b-5p between Targetscan and miRanda

miRNATargetgenesrno-miR-15b-5pCapza2,Il7r,Snrk,Smad7,Mkks,Traf3,Map1lc3b,Spnb3,Mtch2,Ppap2a,Map2k1,Dclk1,Map3k7ip2,Runx1t1,Il10rb,Mapkapk3,Wnt9a,Mmp1a,Map3k3,Ppp2r1a,Wdr47,Nlrp1,Ppap2b,Mmp17,Il1f5,Mapre1,Kif23

3 討論

miRNAs的異常表達在RA中發(fā)揮重要的作用，如參與滑膜成纖維細胞的增殖和侵襲[7]；抑制TRAF6的表達[8]；影響破骨細胞分化遷移、增殖和骨吸收等過程[9，10]。因此發(fā)現(xiàn)RA的特征性miRNAs，系統(tǒng)研究其在RA病理機制中的多環(huán)節(jié)、多靶點作用，對于RA的臨床診斷和治療具有積極的指導意義[11]。

miRNAs芯片技術的發(fā)展，使得針對特定疾病的miRNAs篩選更為便捷[12]。本研究針對RA分別進行了人和動物的miRNAs表達譜檢測，并采用Real time PCR實驗驗證了芯片篩選的可靠性。研究結果證實，在RA患者和動物均存在miRNAs的異常表達，其中miR-15b-5p等10個miRNAs在RA患者外周血與大鼠破骨細胞均出現(xiàn)相似的異常表達，表明部分miRNAs在不同種屬中的異常表達具有一致性，其可能作為RA的特征性miRNAs起著重要的作用。

研究進一步選擇了在人和動物均有顯著異常表達的miR-15b-5p進行了生物信息學分析，結果顯示其多個靶基因均與細胞分化等過程明顯相關，其調控的VEGF、MAPK、T細胞受體等多個靶信號通路均參與RA的發(fā)生與發(fā)展。結合文獻，其他miRNAs作用的靶蛋白亦與RA相關，如miR-26a可上調DC-STAMP信號蛋白的表達，調控破骨細胞分化[13]；miR-155能抑制SOCS1，調節(jié)成骨細胞分化[14]；miR-15b可通過NRP-2、MMP-3調控細胞增殖和凋亡[15，16]；let-7g-5p可通過MAP3K1、K-Ras、caspase-3等參與細胞增殖、分化和凋亡[17-19]；miR-26b能抑制MAPK通路的活性[20]。已知miRNAs具有網絡性調控的特點，即：單一miRNA通過不同靶位產生效應的協(xié)同；同一miRNA在不同水平調節(jié)關鍵信號產生效應的增強；一個關鍵分子是多個miRNA的靶位而產生效應的疊加。因此，上述特征性miRNAs可能構成調控網絡，干預細胞因子和信號蛋白等不同環(huán)節(jié)、不同靶位，而成為RA破骨細胞分化等多個病理過程的中心機制。

綜上所述，部分miRNAs在不同種屬的異常表達具有一致性，其可能作為RA的特征性miRNAs構成調控網絡，進一步研究其調控特點和機制，將有利于揭示RA復雜病理機制，確立RA的關鍵靶位，為臨床診斷與治療提供參考。

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[收稿2016-07-27 修回2016-11-21]

(編輯 張曉舟)

Comparison of abnormal expression of miRNAs in peripheral blood of rheumatoid arthritis patients and osteoclasts in rat and analysis of any miRNAs

YUANCheng-Chen，GENGShan，ZHUYa-Mei，PENGXiao-Wu，ZHOUXue-Ping，ZHOULing-Ling.

NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China

Objective:To analyze the different expressions of miRNAs in peripheral blood of rheumatoid arthritis (RA) patients and the osteoclasts in rats,and to verify the key miRNAs in RA.Methods: The miRNAs expressions in monocyte and the co-cultured osteoclasts,peripheral blood of rheumatoid arthritis (RA) patients and normal were detected by miRCURYTMLNA Array.Real time PCR was applied to verify the reliability of miRNA array.The bioinformatics software and database were applied to predict and analyze target genes.Results: miRNA array results showed that 189 miRNAs changed in RA patients compared with the normal;211 miRNAs were changed in osteoclasts group compared with monocytes group.The expressions of ten miRNAs were all abnormal in RA patients and osteoclasts in rats.The results of Real time PCR were consistent with the array.Results of bioinformatics analysis showed that the target gene of miRNA significantly enriched in signaling pathways such as VEGF,MAPK signaling pathways.Conclusion: Some miRNAs had similar abnormal expressions in different species，and these miRNAs may influence the differentiation of the osteoclasts through regulating the related signal passways.

miRNAs;Rheumatoid arthritis;Osteoclast

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.017

①本文受國家自然科學基金(81673937)和國家基金預研基金(No.14XYY01)資助。

袁呈晨(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事免疫藥理學研究，E-mail:1126773099@qq.com。

及指導教師：周玲玲(1974年-)，女，博士，碩士生導師，副教授，主要從事中藥藥理學、免疫藥理學研究，E-mail: llzhou74@163.com。

R285.5

A

1000-484X(2017)05-0715-06

②南京市中醫(yī)院，南京210023。