CD244與活動性肺結核患者CD56brightNK細胞表型及功能的關系研究①

楊秉芬 翟 斐 蔣 靜 王心靜 曹志紅 程小星

(解放軍第三〇九醫院全軍結核病研究所全軍結核病防治重點實驗室/結核病診療新技術北京市重點實驗室，北京100091)

CD244與活動性肺結核患者CD56brightNK細胞表型及功能的關系研究①

楊秉芬 翟 斐 蔣 靜 王心靜 曹志紅 程小星

(解放軍第三〇九醫院全軍結核病研究所全軍結核病防治重點實驗室/結核病診療新技術北京市重點實驗室，北京100091)

目的：探索CD244與活動性肺結核患者CD56brightNK細胞表型及功能的關系。方法：用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMCs)，用流式細胞術檢測活動性肺結核患者與正常對照者CD56brightNK細胞表面CD244、CD94、NKG2D表達差異，進一步檢測活動性肺結核患者CD56brightNK細胞CD244與Tim3、CD27、CD62L、CCR7、CD107a、IFN-γ表達的關系。結果：不經過結核菌抗原刺激的外周血中的CD56brightNK細胞表面CD244表達在活動性肺結核患者和正常對照中并沒有顯著性差異；經過結核菌抗原刺激的活動性肺結核患者CD56brightNK細胞表面CD244表達顯著高于正常對照者；CD56brightNK細胞表面CD94和NKG2D表達，在活動性肺結核患者與健康對照者之間無顯著性差異；活動性肺結核患者CD244+CD56brightNK細胞表面Tim3+細胞顯著性升高，而細胞表面CD62L顯著性降低，細胞內IFN-γ顯著性降低；然而CD244+CD56brightNK細胞和CD244-CD56brightNK細胞之間CD107a表達無顯著性差異。結論：在活動性肺結核患者PBMCs中CD56brightNK細胞表面高表達CD244，可能與抑制受體Tim3協同抑制IFN-γ的表達，但是與NK細胞的脫顆粒作用無關。

CD56brightNK細胞；CD244；Tim3；IFN-γ；CD107a

NK細胞是主要的自然免疫細胞，占外周血淋巴細胞的5%～20%，在腫瘤免疫和抗感染免疫中具有重要的作用[1-3]。NK細胞在抗結核免疫中具有重要的作用，NK細胞可以直接裂解MTB感染的單核細胞，并能通過殺傷感染的巨噬細胞和調節性T細胞或者加強DC細胞的抗原遞呈能力來提高抗原特異性的CD8+T細胞的功能[4-6]。CD3-CD56+是人NK細胞的表型，又分為CD56dimCD16+和CD56brightCD16-/dull兩群細胞，前者主要功能是殺傷靶細胞和分泌少量的IFN-γ，后者能分泌大量的細胞因子包括IFN-γ、TNF-α、GM-CSF等[7]，并具有重要的調節功能，能夠調節DC細胞、單核細胞和T細胞的功能[8,9]。CD244是CD2家族成員，主要表達在NK細胞、γδT細胞和記憶性T細胞，CD244在NK細胞既是抑制性受體也是活化受體，其可能的機制是由其表達水平、交聯程度和細胞內接頭蛋白決定：CD244高水平表達、大部分CD244分子在細胞表面交聯和細胞內接頭蛋白SAP大量表達與抑制功能相關，反之CD244表達水平低、主要接頭蛋白是EAT-2與活化功能相關[10]。CD244在活動性肺結核患者外周血的CD8+T和CD4+T細胞表達升高并抑制其功能[11，12]，但是CD244在CD56brightNK細胞的抗結核免疫中的作用尚不清楚，本文研究CD244在活動性肺結核患者CD56brightNK細胞的表達，并研究其與CD56brightNK細胞的表型及其功能的關系。

1 材料與方法

1.1 資料 收集309醫院結核病研究所2016年4月39例活動期肺結核住院患者，男26例，女13例，平均年齡(34.79±2.221)歲，排除其他慢性感染性疾病、惡性腫瘤和免疫相關性疾病。招募健康對照者34例，男21例，女13例，平均年齡(37.26±1.174)歲。抽取外周血，EDTA抗凝，用密度梯度離心法分離PBMCs備用。所有病例都已簽署知情同意書，本研究臨床樣本使用通過309醫院倫理委員會審查，倫理學編號是：2015GKJ011。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞染色及分析 部分PBMCs直接進行細胞表面抗原染色；部分PBMCs用無血清培養基重懸，鋪在96孔板(每孔約5×105細胞)，使用結核分枝桿菌H37Rv菌體裂解液作為刺激抗原，37℃孵箱培養16 h，收集細胞用細胞表面抗原抗體進行染色，然后進行流式細胞分析。FITC-CD16、FITC-CD244、PE-CD244、PE-CF594-CD3、PC5-CD56、FITC-CD94、FITC-CD27、FITC-CD62L購自BD Bioscience公司；PC7-CD3、PC5-CD56、PC7-CD16、PE-NKG2D購自Biolegend公司； Alexa Flour488-Tim3、FITC-CCR7購自R&D公司。

1.2.2 IFN-γ染色及分析 取PBMCs鋪在96孔板(每孔約5×105細胞)，然后加入5×104個K562作為靶細胞，37℃孵箱培養過夜，然后加蛋白轉運抑制劑Golgiplug(終濃度10 μg/ml)，4 h后收集細胞，先進行細胞表面抗原染色，然后破膜固定后加入FITC-IFN-γ抗體(購自R&D公司)進行細胞內染色，洗滌后進行流式細胞分析。

1.2.3 CD107a 染色及分析 取PBMCs鋪在96孔板(每孔約5×105細胞)，然后加入5×104個K562作為靶細胞，同時加入FITC-CD107a 抗體(購自BD Bioscience公司)，2 h后加入蛋白轉運抑制劑Golgistop(終濃度10 μg/ml)，繼續培養4 h后收集細胞，用NK細胞標記抗體進行染色，然后進行流式細胞分析。

1.3 統計學處理 采用Graphpad Prism 5軟件進行統計分析，組間采用Mann-Whitney檢驗，顯著性檢驗標注為P<0.05。

2 結果

2.1 活動性肺結核患者和健康對照的外周血CD56brightNK細胞表面CD244表達無顯著差別 提取活動性肺結核患者和健康對照PBMCs直接進行表面染色，然后進行流式細胞分析，如圖1，在淋巴細胞先設門圈出CD3-細胞，然后分析其中CD56brightCD16-細胞的比例，用非參數T檢驗進行分析，結果顯示CD56brightNK細胞在活動性結核患者顯著低于健康對照(P=0.000 4)。然后分析CD56brightNK細胞表面CD244的表達，結果顯示活動性結核患者與健康對照CD56brightNK細胞表面CD244無顯著差別。

圖1 CD244在活動性肺結核患者與健康對照外周血CD56brightNK細胞表面表達無顯著差別Fig.1 Expression of CD244 on CD56brightNK cells showed no significant different between patients with active pulmonary tuberculosis and healthy controlsNote: A.Gate strategy of CD56brightNK cells;B.Statistical analysis of the CD56brightNK cells in PBMCs;C.Statistical analysis of CD244 on the CD56brightNK cells.

2.2 結核抗原刺激使活動性肺結核患者外周血CD56brightNK細胞表面CD244表達顯著升高 提取活動性肺結核患者和健康對照PBMCs用H37Rv裂解液刺激過夜，收集細胞進行表面染色，然后進行流式細胞分析，結果顯示結核抗原刺激后CD56brightNK細胞在活動性結核患者與健康對照之間無顯著性差異(P=0.10)。然后分析CD56brightNK細胞表面CD244的表達，結果顯示活動性結核患者CD56brightNK細胞表面CD244顯著高于健康對照(P<0.000 1)，見圖2。

2.3 CD56brightNK細胞表面CD94與NKG2D在活動性肺結核患者和健康對照無顯著性差異 用流式細胞術分析活動性肺結核患者和健康對照PBMCs中CD56brightNK細胞表面CD94和NKG2D的表達，如圖3所示，90%以上的CD56brightNK細胞表面都表達CD94和NKG2D，而且在活動性結核患者和健康對照之間無顯著性差異。

2.4 CD56brightNK細胞表面CD244與抑制受體Tim3和CD27表達的關系 取PBMCs用H37Rv裂解液刺激過夜，收集細胞進行表面染色，然后進行流式細胞分析，如圖4，在CD56brightNK細胞中CD244+細胞表面Tim3+細胞比例比CD244-細胞顯著升高(P=0.008 6)，但是同時檢測CD56brightNK細胞表面CD244和CD27的表達，發現CD27在CD244+CD56brightNK細胞與CD244-CD56brightNK細胞表達無顯著性差異。

圖2 結核抗原刺激后CD244在活動性肺結核患者外周血CD56brightNK細胞表面表達升高Fig.2 Expression of CD244 on CD56brightNK cells of pat-ients with active pulmonary tuberculosis increased significantly stimulated with MTB antigenNote: A.Isotype control of CD244;B.CD244 on CD56brightNK cells of healthy control;C.CD244 on CD56brightNK cells of patients with tuberculosis;D.Statistical analysis of the CD56brightNK cells in PBMCs;E.Statistical analysis of CD244 on the CD56brightNK cells.

2.5 CD56brightNK細胞CD244與CD62L和CCR7表達的關系 取PBMCs用H37Rv裂解液刺激過夜，收集細胞進行表面染色，然后進行流式細胞分析，如圖5，在CD56brightNK細胞中CD244+細胞表面CD62L+細胞比例比CD244-細胞顯著降低(P=0.000 4)，但是同時檢測CD56brightNK細胞表面CD244和CCR7的表達，發現CCR7在CD244+的CD56brightNK細胞與CD244-的CD56brightNK細胞表達無顯著性差異。

圖3 CD56brightNK細胞表面CD94和NKG2D的表達分析Fig.3 Expression of CD94 and NKG2D on CD56brightNK cellsNote: A.CD94 on CD56brightNK cells;B.Statistical analysis of CD94 on the CD56brightNK cells;C.NKG2D on CD56brightNK cells;D.Statistical analysis of NKG2D on the CD56brightNK cells.

圖4 Tim3在CD244+CD56brightNK細胞表面表達顯著性升高Fig.4 Expression of Tim3 on CD244+CD56brightNK cells elevated significantlyNote: A.Tim3 and CD244 on CD56brightNK cells;B.Statistical analysis of Tim3 on the CD244+CD56brightNK cells and CD244-CD56brightNK cells;C.CD27 and CD244 on CD56brightNK cells;D.Statistical analysis of Tim3 on the CD244+CD56brightNK cells and CD244-CD56brightNK cells.

圖5 CD62L在 CD244+CD56brightNK細胞表面表達顯著性降低Fig.5 Expression of CD62L on CD244+CD56brightNK cells decreased significantlyNote: A.CD62L and CD244 on CD56brightNK cells;B.Statistical analysis of CD62L on the CD244+CD56brightNK cells and CD244-CD56brightNK cells;C.CCR7 and CD244 on CD56brightNK cells;D.Statistical analysis of CCR7 on the CD244+CD56brightNK cells and CD244-CD56brightNK cells.

圖6 CD244與CD56brightNK細胞內IFN-γ表達的關系Fig.6 Relationship between expression of CD244 and production of IFN-γ in CD56brightNK cellsNote: A.IFN-γ and CD244 on CD56brightNK cells;B.Statistical analysis of IFN-γ in the CD244+CD56brightNK cells and CD244-CD56brightNK cells.

圖7 CD244與CD56brightNK細胞表面CD107a表達的關系Fig.7 Relationship between CD244 and CD107a on CD56brightNK cellsNote: A.CD107a and CD244 on CD56brightNK cells;B.Statistical analysis of CD107a on the CD244+CD56brightNK cells and CD244-CD56brightNK cells.

2.6 CD244與CD56brightNK細胞表達IFN-γ的關系 取PBMCs與K562共培養過夜，然后加蛋白轉運抑制劑Golgiplug，4 h后收集細胞，進行細胞染色，然后進行流式細胞分析，如圖6，在CD56brightNK細胞中CD244+細胞內IFN-γ+細胞比例比CD244-細胞顯著性降低(P=0.008 6)。

2.7 CD244與CD56brightNK細胞表面CD107a表達的關系 取PBMCs以K562細胞作為靶細胞，加入FITC-CD107a抗體進行預染，6 h后用NK細胞標記抗體進行染色，然后進行流式細胞分析，如圖7所示在CD244+CD56brightNK細胞表面CD107a+細胞比例與CD244-CD56brightNK細胞無顯著性差異。

3 討論

NK細胞在抗感染免疫中具有重要的作用，但是感染的微生物不同，其作用機制也不同，在蜱傳播腦膜炎病毒感染時，NK細胞主要通過分泌細胞因子IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、TNF等來調節機體的抗感染能力[13]；在HIV感染時抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用在控制病毒復制中具有重要的作用[14]；在結核分枝桿菌感染時，NK細胞可以直接殺傷結核分枝桿菌或者通過分泌細胞因子招募或激活其他免疫細胞來控制感染[5,6]。CD56brightNK細胞占外周血NK細胞的大概10%，高表達Ⅱ型膜糖蛋白CD94、L型選擇素CD62L和淋巴結歸巢受體CCR7，低表達CD16、KIRs、Perforin和Granzyme B，一直有理論認為CD56brightNK細胞是低分化不成熟的NK細胞，可以分化為CD56dimNK細胞[15]，Hong等[16]通過實驗證明HIV感染可以下調CD56brightNK細胞的CCR7表達，而CCR7-CD56brightNK細胞具有CD56dimNK細胞相似的表型。NK細胞的活化或者抑制受到其表面活化性受體(如KIRs、NKG2D、CD27)和抑制性受體(如CD94/NKG2A、Tim3)的調控[17]，表面受體CD244在NK細胞的活性調控中有雙向作用。在我們的研究中發現活動性肺結核患者的外周血CD56brightNK細胞比例與正常對照比較并沒有顯著性差別，但是活動性肺結核患者外周血CD56brightNK細胞表面的受體CD244表達顯著升高，而CD94和NKG2D并沒有顯著性差異。進一步研究發現在CD244+CD56brightNK細胞表面的黏附受體CD62L+細胞比例顯著降低，但是CD244的表達與趨化因子受體CCR7的表達并沒有相關性，這個結果表明CD244可能阻礙CD56brightNK細胞游走到淋巴結，從而抑制特異性免疫。

Tim3在結核病患者的NK細胞高表達，抑制NK細胞分泌IFN-γ和脫顆粒作用[18,19]。共刺激因子CD27可以表達在NK細胞表面，與CD70分子結合，傳導活化信號，增強NK細胞的殺傷作用[20]。實驗結果顯示CD244+CD56brightNK細胞表面的Tim3+細胞比例顯著升高，但是CD27的表達并沒有差異，進一步研究表明CD244+CD56brightNK的IFN-γ表達顯著降低，而作為NK細胞脫顆粒標志的CD107a[21]表達并沒有變化，這個結果表明CD244可能協同抑制受體Tim3抑制CD56brightNK細胞的IFN-γ分泌，但是CD244對CD56brightNK細胞的脫顆粒作用并沒有影響。

本研究初步探討了CD244在活動性肺結核患者外周血CD56brightNK細胞的表達及其與細胞表型的關系，其調節CD56brightNK細胞的功能和機制有待進一步研究。

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[收稿2016-09-09 修回2016-10-25]

(編輯 倪 鵬)

Research on relationship between CD244 and phenotype and function of CD56brightNK cells of patients with active pulmonary tuberculosis

YANGBing-Fen,ZHAIFei,JIANGJing,WANGXin-Jing,CAOZhi-Hong,CHENGXiao-Xing.

ArmyTuberculosisPreventionandControlKeyLaboratory,BeijingKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisandTreatment，InstituteforTuberculosisResearch,the309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China

Objective:To explore the relationship between CD244 and the phenotype and function of CD56brightNK cells of patients with active pulmonary tuberculosis.Methods: PBMCs were isolated from peripheral blood by density gradient centrifugation.The expression of CD244,CD94,NKG2D on the CD56brightNK cells from the active pulmonary tuberculosis patients and healthy controls was detected by flow cytometry.And then analyzed the relationship of the expression of CD244 with Tim3,CD27,CD62L,CCR7,IFN-γ and CD107a in CD56brightNK cells by flow cytometry.Results: The expression of CD244 on the CD56brightNK cells showed no significant difference between the patients with active pulmonary tuberculosis and healthy controls without MTB antigen.The expression of CD244 was significantly increased on CD56brightNK cells of patients with tuberculosis stimulated with MTB antigen.The expression of CD94 and NKG2D on CD56brightNK cells showed no difference between patients and healthy controls.The proportion of Tim3+cells in CD244+CD56brightNK cells was significantly higher than CD244-CD56brightNK cells.While the expression of CD62L and IFN-γ decreased significantly in CD244+CD56brightNK cells.The expression of CD107a on CD56brightNK cells was not significantly different between CD244+cells and CD244-cells.Conclusion: The expression of CD244 on CD56brightNK cells in patients with active pulmonary tuberculosis increased significantly,maybe inhibit IFN-γ co-work with Tim3.CD244 has nothing to do with degranulation of CD56brightNK cells.

CD56brightNK cells;CD244;Tim3;IFN-γ;CD107a

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.018

①本文受國家自然基金(81302537)和國家博士后科學基金(2013M532187)資助。

楊秉芬(1979年-)，女，博士，助理研究員，主要從事結核病免疫方面研究，E-mail: yangbingfen@sina.com。

及指導教師：程小星(1963年-)，男，博士，研究員，博士生導師，主要從事結核病免疫方面研究，E-mail:xc36cn@163.com。

R392.1

A

1000-484X(2017)05-0721-05