從日本進境羅漢松中截獲移去劍線蟲

龍 海, 齊小峰, 謝泳桂, 李一農, 李芳榮*

(1. 深圳出入境檢驗檢疫局, 深圳 518001; 2. 深圳市檢驗檢疫科學研究院深圳市外來有害生物檢測技術研發重點實驗室, 深圳 518045)

有害生物動態
InformationofPests

從日本進境羅漢松中截獲移去劍線蟲

龍 海1,2, 齊小峰1, 謝泳桂1, 李一農1, 李芳榮1*

(1. 深圳出入境檢驗檢疫局, 深圳 518001; 2. 深圳市檢驗檢疫科學研究院深圳市外來有害生物檢測技術研發重點實驗室, 深圳 518045)

2016年11月,深圳口岸從日本進境羅漢松中截獲一種劍線蟲。采用貝曼漏斗法分離線蟲,結合形態學、28S rRNA基因序列測定以及構建系統發育樹,對分離的線蟲進行鑒定。該線蟲的28S rRNA基因序列和GenBank 數據庫中的移去劍線蟲Xiphinemaelongatum(登錄號分別為EF140790、KF430803、KF430802和KF430801)的序列同源性高達99%;其形態特征和測計值與X.elongatum最為吻合;系統發育樹表明該線蟲和X.elongatum聚為一組。通過以上結果判定截獲的線蟲為移去劍線蟲。劍線蟲是一種重要的植物外寄生線蟲,我國口岸曾經多次截獲劍線蟲,劍線蟲入侵我國的風險較高。本文首次對日本羅漢松中的移去劍線蟲進行了詳細的描述,提供了該線蟲新的地理分布信息。

移去劍線蟲; 羅漢松; 形態學; 分子鑒定

劍線蟲屬Xiphinema線蟲是一類重要的外寄生線蟲,它們在植物根部取食,嚴重破壞根組織,影響根系生長。除取食危害以外,一些劍線蟲作為植物病毒的傳播介體對農林業生產造成嚴重的經濟損失[1]。已報道的劍線蟲屬線蟲有296種[2],其中劍線蟲傳毒種被列入我國檢疫性有害生物名錄。隨著我國進口苗木種類和數量越來越多,劍線蟲傳入我國的風險日益加大。我國口岸曾多次從進境種苗中截獲劍線蟲,深圳口岸近年來從日本進境苗木中就曾截獲過短頸劍線蟲X.brevicollum、湖南劍線蟲X.hunaniense、標明劍線蟲X.insigne、美洲劍線蟲X.americanum、太平洋劍線蟲X.radicicola等。劍線蟲入侵我國的風險可見一斑。

2016年11月深圳口岸從日本進境的羅漢松樣品中分離到一種劍線蟲。通過對其進行形態特征觀察、測量,28S rRNA基因序列測定以及系統發育樹分析,鑒定為移去劍線蟲X.elongatum。本文對上述過程進行了詳細描述,為口岸檢疫提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

口岸現場取羅漢松的根和根際土壤約500 g,放入封口袋中,做好標簽,送至實驗室。

1.2 線蟲分離

采用貝曼漏斗法分離線蟲[3]。取約250 g樣品,用雙層紗布包好,置于漏斗中,25℃靜置24～48 h。用凹面皿接取線蟲懸浮液10 mL,在體式顯微鏡下鏡檢。

1.3 形態學鑒定

用挑針挑取線蟲制成臨時玻片[4],在Zeiss Zmager MI光學顯微鏡下對線蟲的整體形態和內部結構進行觀察。用顯微鏡自帶的Zeiss AxioCam HRC數碼相機對線蟲進行拍照,并用Axio Vision 4.8.2自帶的測量軟件和de Man公式法[5]對線蟲進行測計。

1.4 分子生物學檢測

1.4.1 單條線蟲DNA提取

參照Long等[6]的方法。取12 μL裂解緩沖液(1×ExTaqBuffer(Mg2+free),100 μg/mL蛋白酶K,2 mmol/L MgCl2)到潔凈的載玻片上,將線蟲挑到裂解緩沖液中并碾碎,把上述線蟲懸液轉移到PCR薄壁管中,-80℃放置30 min,再轉移到PCR儀上,60℃加熱1 h,95℃加熱15 min,經上述步驟處理的線蟲粗提液用于PCR擴增。

1.4.2 PCR擴增

28S rRNA基因序列擴增采用的引物對為:D2A(5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′)和D3Br(5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′)[7]。PCR反應體系為50 μL,包括10×ExTaqBuffer(Mg2+free)4 μL,25 mmol/L MgCl23.2 μL,2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL,5 U/μLExTaq0.2 μL,10 μmol/L D2A/D3Br引物各4 μL,線蟲粗提液10 μL,加滅菌水定容至50 μL。PCR反應程序參照de Ley 等[7]的方法,94 ℃預變性4 min;94℃ 30 s,55℃ 40 s,72℃ 1 min,40個循環;最后72℃保溫10 min,使反應產物充分延伸。

1.4.3 PCR產物的檢測、測序和序列分析

取5 μL PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳20 min,在凝膠成像系統下觀察并拍照,如果出現目標條帶,將余下的PCR產物送華大基因有限公司測序,用BioEdit 7.0[8]對序列進行編輯,在GenBank 數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中進行BLAST分析,選取同源性較高的劍線蟲的28S rRNA基因序列,用MEGA 4.0[9]構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定

在光學顯微鏡下觀察分離到的線蟲形態(圖1)。雌蟲腹面彎曲,熱殺死后呈“C”形,體環不明顯。角質膜有兩層,內層角質膜在尾端明顯增厚。唇區微縊縮。口針和誘導環結構典型。食道球長圓柱狀,長86 ～105 μm,寬21 ～25 μm。陰門位于蟲體前約1/3處,雙生殖腺,均發育完全,卵巢回折。尾圓錐形,腹面彎曲,長度約為肛門處體寬的2.5～3.5倍,每側3個尾孔。雄蟲未發現。

2.2 形態測量值

從日本進境羅漢松中分離的劍線蟲,形態特征和測量值(表1)與文獻報道的X.elongatum最為接近,故初步將其鑒定為X.elongatum。

2.3 分子生物學數據分析

經PCR擴增、測序(GenBank登錄號KY348743),將序列與NCBI數據庫中的序列進行BLAST分析，結果表明,劍線蟲日本群體的28S rRNA基因序列與GenBank登錄號分別為EF140790、KF430803、KF430802和KF430801的X.elongatum序列相似度高達99%。基于28S rRNA基因序列構建的系統發育樹(圖2)也顯示該線蟲與X.elongatum位于一個進化枝上,親緣關系最近。綜合上述形態學和分子生物學數據分析,判定截獲的日本劍線蟲為移去劍線蟲。

圖1 日本羅漢松中移去劍線蟲的光學顯微圖片Fig.1 Photomicrographs of Xiphinema elongatum intercepted in Podocarpus macrophyllus from Japan

種群Population數量Number體長/mmLabcc'V日本Japan232.23±0.2(2.0～2.6)53.0±4.4(43.0～58.5)6.8±1.0(5.6～9.4)34.4±3.5(30.1～45.4)3.0±0.3(2.5～3.5)38.9±2.0(34.4～43.5)剛果[10](全模標本)Zaire(holotype)12.089496.1352.540埃塞俄比亞[11]Ethiopia42.38±0.71(2.33～2.43)69±7.0(64～74)7.2±0.5(6.9～7.6)33.2±5.8(29.1～37.3)2.7±0.1(2.6～2.8)41.3±0.3(41～41.7)泰國[12]Thailand52.30(2.15～2.45)51.3(47.9～55.7)—37.4(36.9～39.6)2.6(2.5～2.8)38.4(35.1～40.5)

續表1 Table 1(Continued)

種群Population數量Number體長/mmLabcc'V菲律賓[12]Philippines202.47±0.18(2.11～2.72)56.1±4.3(49.8～68.2)—34(32～37)(n=8)2.8±0.2(2.6～3.2)39.9±1.6(37.0～43.0)中國福建[13]Fujian,China62.11±0.13(1.89～2.25)54±3.8(49～60)6.5±0.2(6.3～6.8)36±2.0(33～39)2.6±0.1(2.4～2.8)41±1.1(40～43)中國臺灣[14]Taiwan,China252.00±0.11(1.77～2.17)57.7±4.9(47.8～65.8)6.0±0.3(5.5～6.4)35.7±1.9(31～40)2.6±0.2(2.3～2.9)39.6±1.3(36.3～42.7)種群Population齒針長/μmOdontostylelength齒針延伸部長/μmOdontophorelength口針長/μmStyletlength唇寬/μmLipwidth肛門處體寬/μmAnalbodywidth尾長/μmTaillength日本Japan93.7±4.4(83.7～102.7)60.6±2.7(51.3～63.1)154.3±4.6(143.3～160.1)11.8±0.5(10.7～12.8)21.8±1.2(19.6～24.5)65.1±5.6(50.5～75.6)剛果[10](全模標本)Zaire(holotype)94591531423.659埃塞俄比亞[11]Ethiopia78±12(70～86)51±7(46～55)—11±1(10～11)22±3(20～24)65.1±2.7(62.5～68.0)泰國[12]Thailand93±1.8(91～95)57±1.6(55～59)150±2.2(147～153)——61.5(58～65)菲律賓[12]Philippines91±2.0(89～97)61±2.3(56～65)152±1.5(149～154)——64(n=8)(58～70)中國福建[13]Fujian,China90±3.9(83～93)56±3.2(51～60)146±5.3(138～151)11.5±0.5(11.0～12.0)22.0±1.3(20.5～23.5)58±2.9(56～62)中國臺灣[14]Taiwan,China88.3±2.4(83.3～92.5)56.7±1.6(55.0～61.7)145.1±3.2(140.0～151.7)11.8±0.5(10.7～12.8)22.0±1.0(20.0～24.0)56.0±3.0(51.0～63.0)

1)n=測計樣本數;L=體長;a=體長/最大體寬;b=體長/體前端至食道與腸連接處的距離;c=體長/尾長;c′=尾長/肛門處體寬;V=體前端至陰門的距離×100/體長。“—”表示無數據。n=Number of measured samples;L=Body length;a=Body length/maximum body width;b=Body length/the distance from body front to esophagus and intestines junction;c=Body length/tail length;c′=Tail length/anal body width;V=The distance of body front to vulva×100/body length.‘—’ means no data.

圖2 基于28S rRNA基因序列構建的部分劍線蟲屬種群系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based upon sequences of D2-D3 expansion region of the 28S rRNA gene of some Xiphinema spp.

3 討論

移去劍線蟲日本種群的形態特征和文獻描述的形態特征[10-14]相符。日本種群的形態測量值和其他種群比較結果顯示,和全模標本相比,c值、V值、齒針長、齒針延伸部長以及口針長非常吻合,其他測量值雖然存在一定差異,但是全模標本的各項單一測量值都在日本種群的范圍內(表1)。日本種群的各測量值和菲律賓種群的一致性較高(表1)。和埃塞俄比亞種群相比,c值、c′值、V值、唇寬、肛門處體寬和尾長比較接近,其他各測量值存在差異,除了a值,埃塞俄比亞種群的測量值都在日本種群的范圍之內,而埃塞俄比亞種群的a值大于其他種群,但與菲律賓和中國臺灣種群沒有重疊(表1)。日本種群的各測量值和泰國、中國的種群相比,雖然存在差異,但是測量范圍都有重疊(表1)。Luc等[15]根據尾長和口針長度,將不同地理來源的移去劍線蟲種群分成兩類,第一類尾長48～54 μm,口針等于或大于164 μm,這一類源自西非;第二類尾長59～67 μm,口針等于或小于161 μm,此類主要來自東非、東南亞和太平洋地區。依據此二分法,日本群體屬于第二類。

移去劍線蟲起源于非洲剛果[10]。其后在夏威夷[16]、南非[17]、南美的蘇里南[18]和巴西[19]等地均有報道,我國僅有零星分布[13-14]。不同地理來源的移去劍線蟲在形態特征和測量值之間都存在差異,需要輔以分子生物學進行鑒定。本文通過28S rRNA基因序列擴增,測序,BLAST比對以及系統發育樹分析,最終判定日本羅漢松中截獲的劍線蟲為移去劍線蟲。本文首次對移去劍線蟲的日本群體進行了詳細描述。近年來,我國進口的苗木量不斷攀升,危險性線蟲入侵的風險也與日俱增,僅深圳口岸從日本和泰國進境的苗木中截獲的線蟲種類就有劍線蟲、長針線蟲、毛刺線蟲、擬毛刺線蟲、根結線蟲、短體線蟲、類短體線蟲和隱皮孢囊線蟲等。口岸檢疫部門需加強對進口苗木的檢疫監管,防止危險性線蟲隨苗木入侵我國,保護我國的農林業生產。

[1] Taylor C E, Brown D J F.Nematode vectors of plant viruses [M]. CAB International, Wallingford, 1997: 286.

[2] Coomans A, Huys R, Heyns J, et al. Character analysis phylogeny and biogeography of the genusXiphinemaCobb 1913 (Nematoda, Longidoridae) [M]. Royal Museum for Central Africa, 2001: 237.

[3] 謝輝. 植物線蟲分類學[M]. 合肥: 安徽科學技術出版社, 2000.

[4] 劉維志. 植物線蟲志[M]. 北京: 中國農業出版社, 2004.

[5] de Man J G. Di frei in der reinen Erde und im sussen Wasser lebenden Nematoden der Niederlandischen Fauna [M]. Brill, Leiden, 1884: 206.

[6] Long Hai, Liu Hao, Xu Jianhua. Development of a PCR diagnostic for the root-knot nematodeMeloidogyneenterolobii[J]. 植物病理學報, 2006, 36(2): 109-115.

[7] de Ley P, Felix M A, Frisse L M, et al. Molecular and morphological characterisation of two reproductively isolated species with mirror-image anatomy (Nematoda: Cephalobidae) [J]. Nematology, 1999, 1(6): 591-612.

[8] Hall T A. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95/98NT [J]. Nucleic Acids Symposium Series, 1999(41): 95-98.

[9] Tamura K, Dudley J, Nei Mand Kumar S. MEGA 4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 [J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(8): 1596-1599.

[10]Tarjan A C, Luc M. Observations onXiphinemainsigneLoos, 1949 andXiphinemaelongatumSchuurrmans Stekhoven & Teunissen, 1938 (Nematoda: Dorylaimidae) [J]. Nematologica, 1963, 9(2): 163-172.

[11]Getaneh G, Bert W, Decraemer W. First report, morphological and molecular characterization ofXiphinemaelongatumandX.pachtaicum(Nematoda, Longidoridae) from Ethiopia [J]. Zookeys, 2015(489): 1-13.

[12]Alkemada J R M, Loof P A A. Observations on the ontogeny of some species ofXiphinema(Nematoda: Dorylaimida) [J]. Mededelingen van de Faculteit Landbouwwetenschappen / Rijksuniversiteit Gent, 1989, 54: 1177-1186.

[13]徐建華, 付鵬, 程瑚瑞. 中國七省(區)劍屬線蟲的分類學研究[J]. 南京農業大學學報, 1995, 18(1): 37-42.

[14]陳殿儀, 倪蕙芳, 顏志恒, 等. 臺灣地區劍線蟲Xiphinemaelongatum之變異性[J]. 植物病理學會刊, 2004, 13(1): 45-60.

[15]Luc M, Southey J F.Study of biometrical variability inXiphinemainsigneLoos, 1949, andX.elongatumSchuurmans Stekhoven & Teunissen 1938; description ofX.savanicolan. sp. (Nematoda: Longidoridae) and comments on thelytokous species [J]. Revue de Nématologie, 1980, 3(2): 243-269.

[16]Cohn E, Sher S A.A contribution to the taxonomy of the genusXiphinemaCobb,1913 [J].Journal of Nematology,1972,4(1):36-65.

[17]Heyns J. The genusXiphinemain South Africa Ⅱ.X.elongatum-group (Nematoda: Dorylaimida) [J]. Phytophylactica, 1974, 6(4): 249-260.

[18]Loof P A A, Maas P W T. The genusXiphinema(Dorylaimida) in Surinam [J]. Nematologica, 1972, 18(1): 92-119.

[19]Ferraz L C C B. Observations on someXiphinemaspecies found in Brazil (Nematoda: Dorylaimoidea) [J]. Nematologia Mediterranea, 1980, 8(2): 141-151.

(責任編輯：楊明麗)

Xiphinemaelongatumintercepted inPodocarpusmacrophyllusfrom Japan

Long Hai1,2, Qi Xiaofeng1, Xie Yonggui1, Li Yinong1, Li Fangrong1

(1. Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518001, China;2. Shenzhen Key Laboratory of Inspection Research & Development of Alien Pests,Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine, Shenzhen 518045, China)

In November 2016, oneXiphinemapopulation was detected in the roots ofPodocarpusmacrophyllusimported from Japan in Shenzhen port, China. The nematode was extracted using modified Baermann method and identified based on morphology, morphometrics, 28S rRNA gene sequencing and phylogenetic analysis. The 28S rRNA gene sequence of the nematode matched well (99% similarity) with that ofXiphinemaelongatumdeposited in GenBank (GenBank accession number EF140790, KF430803, KF430802 and KF430801). The morphological characteristics and morphometrics of the nematode were highly consistent with those ofX.elongatum. The phylogenetic analysis showed that the nematode andX.elongatumwere clustered into one group. It is concluded that the intercepted nematode isX.elongatum.Xiphinemaspp. are important ecto-parasitic nematodes, which have been repeatedly intercepted by Chinese ports, and the invasion risk of these nematodes to China is high. This paper first gives a detailed description ofX.elongatuminP.macrophyllusfrom Japan and provides new geographical distribution information of this nematode.

Xiphinemaelongatum;Podocarpusmacrophyllus; morphology; molecular identification

2017-02-09

2017-03-15

S 432.45

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.040

* 通信作者 E-mail: lifangr@126.com