甘蔗TAD1(ScTAD1)的克隆與表達分析

李旭娟，字秋艷，李純佳，劉洪博，林秀琴，徐超華，陸鑫，毛鈞，劉新龍

（云南省農業科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南開遠 661699）

甘蔗TAD1(ScTAD1)的克隆與表達分析

李旭娟，字秋艷，李純佳，劉洪博，林秀琴，徐超華，陸鑫，毛鈞，劉新龍

（云南省農業科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南開遠 661699）

【目的】Tillering and Dwarf 1（TAD1）是植物株型發育的重要調控基因，該基因與腋芽的形成發育密切相關。獲得甘蔗TAD1（ScTAD1）并預測其結構和功能，分析其在甘蔗不同組織部位、不同發育階段腋芽中及在用生長素（IAA）和細胞分裂素（6-BA）處理后的蔗苗非伸長莖梢部的表達情況，以期為ScTAD1的功能分析及其在甘蔗產量分子輔助育種中的利用奠定理論基礎。【方法】采用電子克隆技術并結合反轉錄 PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR），cDNA末端快速擴增（rapid-amplification of cDNA ends，RACE）等技術獲得ScTAD1的cDNA全長，然后利用生物信息學方法對其序列結構、功能、同源性進行分析；再使用實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR）技術對該基因在甘蔗品種ROC22不同組織部位（根、莖、葉、分蘗芽、葉鞘、生長點）、莖尖生長點和不同發育階段腋芽（幼嫩腋芽、半大腋芽、較大腋芽、成熟休眠腋芽）及葉片分別噴施IAA和6-BA不同時間點幼苗非伸長莖梢部的表達特征進行分析。【結果】獲得ScTAD1的cDNA全長（GenBank登錄號為KX611166），序列分析發現其包含1個1 560 bp的完整開放閱讀框，編碼519個氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為55.57 kD，理論等電點pI為9.16。保守結構域分析表明ScTAD1包含7個WD40重復序列的保守結構域；信號肽預測結果表明 ScTAD1蛋白不存在信號肽，為非分泌蛋白；三級結構預測表明 ScTAD1與二穗短柄草（XP_003558934.1）、玉米（XP_008650376.1）和水稻（AAN74839.1）相關同源蛋白三級結構高度相似，且與高粱假定蛋白（XP_002468612.1）親緣關系最近。qPCR分析結果表明ScTAD1在甘蔗根、莖、葉、分蘗芽、葉鞘、生長點等不同組織部位均有表達，其中在分蘗芽中的表達量最高，其次為葉和葉鞘，根中表達較弱；不同發育階段甘蔗腋芽中，ScTAD1在幼嫩腋芽中表達最高；葉片噴施植物激素IAA和6-BA 36 h后該基因表達開始升高，但噴施6-BA 48 h后表達又回落到未處理水平，表明這兩類激素對ScTAD1表達有調控作用。【結論】成功從ROC22中獲得ScTAD1的cDNA序列，該基因在甘蔗不同組織部位均有表達，其中分蘗芽中表達量最高；推測ScTAD1可能在甘蔗腋芽形成發育早期發揮作用，其表達水平受生長素和細胞分裂素調控。

甘蔗；腋芽；TAD1；克隆；表達分析

0 引言

【研究意義】Tillering and Dwarf 1（TAD1）是近年發現的揭示植株形態建成新機制的重要基因之一，該基因可通過泛素化過程降解植物腋芽形成發育關鍵調控基因，從而影響植株分枝（蘗）數目并進一步影響植株形態建成及單產[1]。甘蔗（Saccharum spp.）屬于禾本科無性繁殖經濟作物，主要靠莖稈作為收獲產品，而其莖稈又主要由母莖基部非延長節上的腋芽發育而成，因此，甘蔗腋芽的形成發育在甘蔗最終產量形成上扮演著十分重要的角色。鑒于此，從甘蔗中克隆調控側芽形成發育相關基因 TAD1，分析其結構特征和功能，闡明其在甘蔗中的表達特征，對其功能機制研究及利用分蘗性狀改良甘蔗品種產量具有重要意義。【前人研究進展】TAD1編碼一個細胞分裂后期啟動復合物（anaphase-promoting complex，簡稱APC/ C）的共激活蛋白，能與水稻（oryza sativa）OsAPC10蛋白形成一個復合體，通過細胞周期依賴的方式降解水稻單蘗基因MONOCULM1（MOC1）[2]，隨后下調水稻同源異型盒基因（Oryza sativa homeobox 1，OSH1）[3]的表達，抑制腋芽分生組織的起始和形成，從而實現對腋芽形成和萌發的調控[1]。動物鈣粘連素基因（Cadherin 1，Cdh1）[4]、植物細胞周期調控蛋白基因（cell cycle switch 52，CCS52）[5-7]、水稻分蘗增強子基因（Tiller Enhancer，TE）[8]都屬于TAD1的同源基因。前期研究表明CCS52主要通過調節植物細胞由有絲分裂向細胞核內復制轉換而最終影響植物腋芽分生組織的起始和形成[9-12]，另外還有研究表明該基因還與莖、根分生組織的維持及種子、葉片、毛狀體分枝等表型性狀的形成相關[9,11,13-16]。最近，LIN等[17]研究表明TAD1還可以通過介導赤霉素（GA）和脫落酸（ABA）信號通路的拮抗作用，調控水稻等植物的生長發育。【本研究切入點】TAD1在水稻分蘗中具有重要作用，且該基因在植物中功能保守，但甘蔗中尚未見該基因的相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】本研究通過克隆甘蔗 ScTAD1，并對其蛋白結構和功能進行生物信息學預測分析，運用qPCR分析明確其在甘蔗不同組織中的表達特征，及其與甘蔗腋芽形成發育及腋芽發育相關調控激素的關系，為后續該基因的功能機制研究和分子輔助育種奠定良好的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及處理方法

1.1.1 研究材料 以中國主栽甘蔗品種新臺糖22號（ROC22）為研究材料，由國家甘蔗種質資源圃提供。

1.1.2 材料處理 于2015年5月初取ROC22分蘗盛期的分蘗苗莖尖生長點部位，用于后續 RNA的提取及ScTAD1的克隆。選用成熟期ROC22種莖進行桶栽種植（每桶5芽），待5—7葉期取其根、莖、葉、分蘗芽、葉鞘、莖尖等組織部位用于ScTAD1的組織表達分析。于2015年8月中旬，選取拔節后期ROC22的蔗莖，取莖尖生長點及其以下第1節位（幼嫩腋芽）、第3節位（半大腋芽）、第5節位（較大腋芽）、第7節位（成熟休眠芽）處不同發育階段的腋芽，用于不同發育階段腋芽中 ScTAD1的表達分析。另外，于2016年3月14日，取成熟期ROC22種莖，砍成單芽后種植于泥炭土與黏土2﹕1的塑料桶中，每桶5芽，每組5桶，共2組；放置于云南省農業科學院甘蔗研究所第一科研基地溫室中適時適量澆水，待蔗苗長至4葉1心時，于2016年4月14日早晨 8：00—9：00對 2組甘蔗分別噴施 600 mg·L-1的IAA（Sigma公司）和6-BA（Sigma公司），噴施至葉片表面水珠不下滴為止（每次噴施200 mL左右），然后每隔6 h取甘蔗幼苗非伸長莖梢部（腋芽分生組織形成部位）用于不同植物外源激素處理下ScTAD1的表達分析。

1.2 RNA提取及反轉錄

使用液氮速凍組織樣品，并研磨提取總RNA，提取方法參照全式金TransZolTMPlant RNA試劑盒，提好的RNA通過1.0%的瓊脂糖凝膠和Bio Drop Lite PC超微量可見紫外分光光度計檢測質量和濃度，然后分別使用試劑盒 Trans Script One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix和 SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit反轉錄成常規cDNA模板和RACE cDNA模板后于-20℃保存備用。

1.3 ScTAD1的克隆

以水稻TAD1（AK058595）mRNA序列為探針，通過BLAST檢索甘蔗EST文庫并下載相關序列，然后使用Vector NTI 11.5、DNAMAN 5.0軟件對獲得的EST序列進行拼接比對，獲得重疊群，再使用重疊群持續比對檢索直至無新的甘蔗 EST序列可供拼接延伸，最終獲得電子克隆序列。根據所獲得的電子克隆序列，設計RT-PCR引物（表1），使用高保真Trans Start Fast Pfu Fly DNA聚合酶進行基因片段的擴增，驗證電子克隆序列的準確性。對已驗證正確的電子克隆序列進行編碼區比對分析，然后設計RACE特異引物（表 1），進行 RACE擴增，所有試驗步驟參照SMARTERTMRACE cDNA Amplification Kit說明書進行。使用Vector NTI 11.5拼接電子克隆序列與RACE序列，然后根據拼接序列設計引物擴增ScTAD1的完整編碼區序列，驗證cDNA序列的正確性。所有PCR產物使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收，并使用全式金零背景克隆載體（pEASY- Blunt Zero Cloning Kit）將回收的擴增產物連接、轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞內，挑取至少3個克隆交由深圳華大基因測序，測序序列使用DNAMAN 5.0軟件比對分析。

表1 ScTAD1擴增及實時熒光定量PCR引物信息Table 1 Primers used for ScTAD1 amplification and qPCR

1.4 ScTAD1的生物信息學分析

首先利用在線工具ORF Finder查找所得序列的開放閱讀框（ORF），然后使用 ExPASy服務器中的ProtScale和ProtParam軟件、SIGNA-IP軟件、TargetP 1.1、SOP-MA在線軟件、SWISS-MODEL、ProtFun軟件、TMHMM 軟件分別預測ScTAD1的理化性質、信號肽、亞細胞定位、二級結構、三級結構及功能；再通過DNAMAN 5.0和MEGA 6.0等生物學軟件對TAD1 同源蛋白進行序列比對和NJ系統進化樹構建，進化樹的bootstrap設置為1 000次。

1.5 ScTAD1的實時熒光定量PCR表達分析

根據已獲得的ScTAD1序列，使用Primer Express 3.0.1設計熒光定量PCR引物，以LING等[18]發表的 GAPDH作為內參基因，選用 TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和SYBR?Premix Ex TaqTMII（TIi RNaseH Plus），ROX plus試劑盒，按試劑盒說明書進行操作，定量PCR體系為20 μL，包括cDNA 模板（50 μg·μL-1）2 μL、SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（2×）10.0 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）0.8 μL、ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL和H2O 6 μL。采用兩步法 PCR擴增，程序為95℃ 30 s；95℃5 s，60℃ 34 s，40個循環；95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。每個樣品設3次生物學重復和3次技術重復，在 ABI Vii7 Real time PCR System（Applied Biosystems，USA）上進行試驗。最后利用2-ΔΔCT法[19]計算 ScTAD1的相對表達量。

2 結果

2.1 ScTAD1 cDNA全長的獲得及序列分析

以水稻TAD1（AK058595）mRNA序列為探針，借助電子克隆技術獲得 2個重疊群，長度分別為688和1 218 bp，分別位于該基因的上游和下游區域，中間存在200 bp左右的缺口，在2個重疊群兩 端 設 計 RT-PCR 引 物 （TAD1-199-F 和TAD1-962-R），擴增得到一條長1 812 bp的片段（圖1），經測序比對，該片段與電子克隆獲得的2個重疊群相似性分別高達 95.19%和99.23%，證實了拼接電子克隆序列的正確性。序列分析表明RT-PCR獲得序列包含部分編碼區序列和450 bp的3′非編碼區序列。

使用 5′RACE基因特異引物 TAD1-572-R和TAD1-302-R經過兩輪PCR最終獲得一條327 bp的RACE產物（圖1），將該片段序列與上述獲得的1 812 bp的片段進行序列拼接，最終獲得2 129 bp的cDNA序列，比對分析表明該cDNA序列包含1 560 bp的編碼區、118 bp的5′非編碼區和450 bp的3′非編碼區。使用基因編碼區擴增引物 ScTAD1-49-F和ScTAD1-1816-R進行RT-PCR擴增得到一條1 785 bp的片段（圖1），測序比對為該基因的編碼區序列，證實了所獲得 cDNA序列的正確性，將該基因命名為ScTAD1，上傳至GenBank數據庫，序列號為KX611166。

2.2 ScTAD1的生物信息學分析

2.2.1 ScTAD1編碼氨基酸結構及其相應理化性質使用ORF Finder程序分析可知ScTAD1包含一個1 560 bp的最大完整開放閱讀框（ORF），編碼519個氨基酸殘基。Conserved domain search工具分析表明該蛋白具有7個WD40的保守結構域（圖2）。

圖1 ScTAD1 PCR擴增電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR amplification product of ScTAD1

圖2 ScTAD1保守結構域預測結果Fig. 2 Prediction of the conserved domain of ScTAD1

ScTAD1蛋白的分子質量約為55.57 kD、理化等電點 pI為 9.16、共包含 7 707個原子，分子式為C2433H3795N711O751S17；在組成該蛋白的20種氨基酸中絲氨酸（Ser）所占比例最高，達到13.7%，而蛋氨酸（Met）所占比例最低，為1.0%；該蛋白不穩定指數（II）為47.27，大于40，表明該蛋白不穩定，脂肪指數（AI）為 70.15，總平均親水性-0.328，介于-0.5—0.5，推測其可能是兩性蛋白，其親/疏水信號如圖3，其中第227和228位具有最高分值，均為1.778，疏水性最強，第 321位具有最低分值為-2.067，親水性較強。

圖3 ScTAD1親疏水性分析Fig. 3 Hydrophilicity/hydrophobicity prediction of ScTAD1

2.2.2 ScTAD1的信號肽和蛋白亞細胞定位預測 蛋白的信號肽預測結果表明ScTAD1第54位的丙氨酸（Ala）殘基具有最高的剪切位點分值0.111（圖4），第11位的絲氨酸（Ser）殘基具有最高的結合剪切位點分值0.107，第1位的蛋氨酸（Met）殘基具有最高的信號肽分值 0.123；由于最后算得信號肽平均值較小，為0.100（小于0.5），因此推測ScTAD1所編碼的蛋白不存在信號肽，為非分泌蛋白。

圖 4 ScTAD1的信號肽預測Fig. 4 Signal peptide prediction of ScTAD1

TargetP 1.1在線軟件預測表明ScTAD1蛋白主要位于葉綠體，少數位于除線粒體和分泌通路的其他位置，PSORT II亞細胞定位分析表明該蛋白定位于細胞核、細胞質、線粒體和過氧化物酶體的概率分別為73.9%、17.4%、4.3%和 4.3%，說明該蛋白可能主要定位于細胞核，細胞質中也可能有少量分布。

2.2.3 ScTAD1的二級結構和功能預測 使用SOPMA軟件預測ScTAD1蛋白的二級結構（圖5）。該蛋白主要由 α-螺旋（h）、β-折疊（e）、無規則卷曲（c）和β-轉角（t）構成，其中，無規則卷曲最多，比例為47.78%，其次為β-折疊（26.20%）和α-螺旋（17.53%），β-轉角最少（8.48%）。使用ProtFun 2.2預測ScTAD1蛋白功能，結果表明，該蛋白行使復制和轉錄作用概率為0.332，調控作用概率為0.231，參與翻譯的概率為 0.093，其中參與中樞代謝的機率最高；該蛋白屬于酶的概率達到了0.446，幾率為1.557，表明該蛋白可能是酶蛋白；從基因功能分類來看，該基因更可能屬于轉錄因子。

圖5 ScTAD1二級結構預測Fig. 5 Secondary structure analysis of ScTAD1

2.3 ScTAD1的三級結構預測

使用SWISS-MODEL在線工具對ScTAD1進行三級結構預測，根據預測結果可知ScTAD1的空間結構以螺旋和無規則卷曲為主（圖 6）。將該蛋白與二穗短柄草、玉米和水稻TAD1同源蛋白的三級空間結構圖進行比較，結果顯示它們的三級空間結構高度相似。

圖6 TAD1及其同源蛋白三級結構預測Fig. 6 Tertiary structure analysis of ScTAD1 and other homologous protein

2.4 ScTAD1蛋白同源性比對及進化樹分析

使用DNAMAN5.0軟件對高粱（Sorghum bicolor）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、小米草（Setaria italica）、水稻（Oryza sativa Japonica Group）、短花藥野生稻（Oryza brachyantha）、玉米（Zea mays）、青稞（Hordeum vulgare subsp. vulgare）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉山筷子芥（Arabidopsis lyrata subsp. lyrata）、葡萄（Vitis vinifera）、煙草（Nicotiana tabacum）、大豆（Glycine max）、陸地棉（Gossypium hirsutum）、苜蓿（Medicago truncatula）等14種植物的TAD1同源蛋白與ScTAD1蛋白進行氨基酸序列同源性分析（圖 7）。從圖中可以看出，TAD1蛋白與其他物種TAD1同源蛋白總體表現為N端保守性較差，C端較保守。此外，ScTAD1與單子葉植物高粱、玉米、小米草等作物相關蛋白相似度在92.75%—98.07%，而與葡萄、擬南芥、大豆等雙子葉植物相似度在67.50%—69.17%，表明該蛋白在單子葉植物之間具有高度的保守性。

使用ClustalX和MEGA6.0軟件，采用NJ法（BootStrap，1000）構建進化樹，分析ScTAD1蛋白與其他物種的TAD1同源蛋白的進化關系，結果如圖8所示。單子葉植物和雙子葉植物的ScTAD1蛋白明顯屬于兩大不同的分支；在單子葉植物分支中，甘蔗與同屬C4植物的高粱、玉米同屬一個小分支，表現出較近的親緣關系。

圖8 不同植物TAD1同源蛋白的NJ分子進化樹Fig. 8 NJ molecular evolutionary tree of the amino acid sequences of TAD1 with homologous among sugarcane and other plants

2.5 ScTAD1表達分析

2.5.1 ScTAD1組織特異性分析 組織特異性表達的qPCR分析表明，ScTAD1在甘蔗不同組織部位均有表達，但表達量有所差異，其中，在分蘗芽中的表達量最高，且顯著高于其他組織部位，其次為葉和葉鞘部位，根和莖尖表達較低，其中，根中表達最低（圖9）。由此表明，ScTAD1在甘蔗中的表達具有明顯的組織特異性。

2.5.2 ScTAD1在莖尖生長點和不同發育階段腋芽中的表達分析 qPCR分析表明，ScTAD1在莖尖生長點和不同發育階段腋芽組織中的表達量有所差異，在莖尖生長點和成熟腋芽部位表達相對較低，而在幼嫩腋芽中表達最高，隨著腋芽的逐漸成熟，表達呈現下降的趨勢，在腋芽形成發育過程中總體呈現出“先升后降”的趨勢（圖10），說明ScTAD1可能在甘蔗腋芽形成初期發揮作用。

圖9 ScTAD1在甘蔗不同組織部位的表達分析Fig. 9 Expression analysis of ScTAD1 in different sugarcane tissues

2.5.3 植物外源激素對ScTAD1的表達影響分析 對使用IAA、6-BA處理甘蔗幼苗莖梢部組織的qPCR分析表明，IAA處理0—24 h，ScTAD1表現出微弱的下調趨勢，但相比較 0 h，未有顯著性的變化；后續的36和48 h逐步表現出上升趨勢，且48 h相比較0 h，呈顯著性上升（圖11左）。而6-BA處理，在0—24 h，出現“先升高后降低再升高”的情況，但與0 h相比，均未達到顯著性變化；而在36 h時，表達升高，并達顯著性變化水平，到48 h又出現回落（圖11右）。以上研究結果表明ScTAD1的表達受IAA和6-BA調控，且明顯響應時段主要發生在36和48 h時段。

圖10 不同發育時期蔗芽中ScTAD1的表達分析Fig. 10 Expression analyses of ScTAD1in sugarcane buds at different developmental periods

3 討論

腋芽是決定禾本科植物形態建成和產量構成的重要器官[20]，其形成和發育過程受一系列基因調控[2]。前人研究表明，單雙子葉植物都是通過 TAD1/TE/ CCS52A—MOC1/LAS—OSH1/STM這一保守途徑調控腋芽的起始和發育[8]，其中調控腋芽形成關鍵基因MOC1處于該途徑的中心位置，但其表達量的多少又受上游TAD1的調控，因此，TAD1是該調控通路上游十分關鍵的基因。

圖11 葉面噴施 IAA、6-BA不同時間后甘蔗莖尖生長點處ScTAD1的表達分析Fig. 11 Expression analyses of ScTAD1 in sugarcane stem apex after IAA, 6-BA foliage spray

本研究克隆的 ScTAD1編碼的蛋白質具有 7個WD40重復序列的保守結構域，與水稻TAD1蛋白保守結構域相似[1]，該結構域是蛋白復合體或蛋白質-DNA復合體之間十分重要的互動平臺[21]。亞細胞定位分析發現，ScTAD1蛋白主要定位于細胞核，其次是細胞質，這與許操[22]研究證實的水稻 TAD1亞細胞定位結果一致。蛋白同源性分析表明ScTAD1與其他單雙子葉植物同源蛋白在C端較為保守，N端存在較多變異，與同屬C4植物的高粱、玉米表現出較近的親緣關系。表達分析顯示ScTAD1在甘蔗不同組織部位均有表達，其中，分蘗芽中表達量最高，其次是葉，這與水稻[1]、番茄[23]中其同源基因表達模式類似，推測該基因可能參與甘蔗分蘗芽的形成。

甘蔗分蘗芽位于莖基部的非延長節上，實質上也屬于腋芽。為了弄清楚ScTAD1是否參與甘蔗腋芽形成的調控，本研究分析了甘蔗莖尖生長點和不同發育階段甘蔗腋芽組織部位該基因的表達情況。結果表明，在甘蔗腋芽形成初期（幼嫩腋芽中），ScTAD1表達量較高，隨著腋芽的不斷發育至成熟，其表達量逐漸降低。由此表明，ScTAD1在甘蔗腋芽形成初期發揮一定作用，可能參與了腋芽的形成發育調控。

除了受基因調控，植物激素尤其細胞分裂素（CTK）和生長素（IAA）在腋芽的形成發育過程中也扮演著十分重要的角色[24-27]，但激素通常又是通過和基因間形成調控網絡共同調控腋芽的形成發育[28-29]。本研究表明分別使用外源IAA和6-BA處理后的甘蔗幼苗莖梢部ScTAD1均表現出一定程度的上調表達，雖然目前未見IAA和CTK對ScTAD1及其同源基因表達調控相關的報道，但有研究指出，水稻突變株體內IAA、CTK含量及IAA/CTK比值有利于側芽形成[30]，而ScTAD1又在腋芽形成中發揮作用，因而這兩種激素均可誘導ScTAD1的上調表達并不矛盾。本研究表明ScTAD1對IAA和CTK兩類激素有響應，但它們之間具體的調控方式還需后續更深入研究。

4 結論

獲得甘蔗分蘗重要調控基因ScTAD1的cDNA序列，其包含1個最大的1 560 bp的完整開放閱讀框，編碼519個氨基酸，編碼蛋白主要定位于細胞核，其次是細胞質。ScTAD1與玉米、高粱同源蛋白親緣關系最近。ScTAD1在甘蔗不同組織部位均有表達，其中，在分蘗芽中的表達量最高，葉、葉鞘以及莖中次之，根中表達較弱；ScTAD1在甘蔗腋芽形成初期表達量明顯上升，隨著腋芽發育又逐步降低；分別噴施兩種外源激素IAA和6-BA 48 h、36 h后的甘蔗幼苗非伸長莖梢部的ScTAD1的表達量最高。表明ScTAD1在甘蔗分蘗芽形成發育過程中發揮重要作用，其表達受IAA和6-BA的影響。

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（責任編輯 李莉）

Cloning and Expression Analysis of TAD1 (ScTAD1) in Sugarcane

LI XuJuan, ZI QiuYan, LI ChunJia, LIU HongBo, LIN XiuQin, XU ChaoHua, LU Xin, MAO Jun, LIU XinLong
（Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan 661699,Yunnan）

【Objective】The Tillering and Dwarf 1 (TAD1) gene plays an important role in regulating plant architecture, and response to the forming and developing of lateral buds. In this study, the gene named ScTAD1 was cloned from sugarcane, the structure and function of it were estimated, and the expression characteristics in different sugarcane tissues, axillary buds at different development at stages and seedlings treated by auxin and cytokinin were screened to provide a reference for function analysis of ScTAD1 and molecular assisted selection of sugarcane yield in the future. 【Method】 A series of technologies including in silicocloning, reverse transcription PCR (RT-PCR) and rapid-amplification of cDNA ends (RACE) were used to obtain the full-length cDNA of ScTAD1, the structure and function of this gene were analyzed and predicted using bioinformatics methods. Finally, by using the real-time fluorescent quantitative PCR (qPCR) technique, the expression pattern of this gene was detected in six different tissues (root, stem, leaf, tiller bud, leaf sheath and stem apex), stem apex and axillary buds with different size (tender axillary bud, medium axillary bud, largish axillary bud, mature dormant axillary bud) and six different time points of seedling tip with non-elongated internodes treated by IAA and 6-BA.【Result】The full length cDNA of ScTAD1 (GenBank accession number: KX611166) was obtained, which contains a 1 560 bp complete open reading frame (ORF) and encodes 519 amino acid residues with a predicted molecular weight of 55.57 kD, bioelectric point value of 9.16. Amino acid sequence analysis showed that it contains seven conserved domains named WD40 whose function is as a protein-protein or protein-DNA interaction platform. Signal peptide prediction results indicated that ScTAD1 without signal peptide and is a secreted protein. Tertiary structure prediction showed that ScTAD1 is highly similar to the homologous protein from Brachypodium distachyon (XP_003558934.1), Zea mays (XP_008650376.1) and Oryza sativa (AAN74839.1). In the phylogenetic tree, ScTAD1 has the closest evolutionary relationship with the homologous protein from Sorghum bicolor (XP_002468612.1). The qPCR analysis showed that ScTAD1 expressed in all the tested tissues, but high expression mainly occurred in tiller buds, followed by leaves, leaf sheath, and the lowest in root. At the different stages of axillary buds development, high expression of ScTAD1 gene appeared in tender buds; when the seedling was treated with IAA and 6-BA, high expression occurred in 36 h, but reduced in 48 h in 6-BA treatment, which implied that this gene can be regulated by the two plant hormones. 【Conclusion】 The ScTAD1 was successfully cloned from sugarcane, and it expressed in different sugarcane tissues with the highest expression in tiller buds. The gene ScTAD1 may play an important role in regulating the development of sugarcane axillary buds, and its expression can be regulated by the auxin and cytokinin.

sugarcane; axillary bud; TAD1 gene; cloning; expression analysis

2016-11-08；接受日期：2017-01-16

國家自然科學基金（31360359，31601362）、云南省基礎研究計劃青年項目（2015FD063）、云南省中青年學術技術帶頭人后備人才（2014HB038）

聯系方式：李旭娟，E-mail：lixujuan2011@163.com。通信作者劉新龍，E-mail：lxlgood868@163.com