樂果農藥對生菜葉片微觀結構的作用機理研究

孫 俊 周 鑫 李青林 蔣淑英 毛罕平 楊 寧

(1.江蘇大學電氣信息工程學院， 鎮江 212013；2.江蘇大學現代農業裝備與技術教育部重點實驗室， 鎮江 212013)

樂果農藥對生菜葉片微觀結構的作用機理研究

孫 俊1,2周 鑫1李青林2蔣淑英1毛罕平2楊 寧1

(1.江蘇大學電氣信息工程學院， 鎮江 212013；2.江蘇大學現代農業裝備與技術教育部重點實驗室， 鎮江 212013)

為了更深入地研究樂果對生菜組織結構的影響，以蓮座期的生菜為實驗對象，利用掃描電鏡和透射電鏡對生菜葉片微觀結構進行檢測。研究發現隨著噴灑農藥濃度的增加，生菜葉片微觀結構發生明顯變化。氣孔的長寬比和密度降低，葉片的厚度變小，嗜鋨顆粒增加，淀粉顆粒變少。在897～1 332 nm波長范圍內，噴灑樂果的生菜光譜反射率與樂果濃度成反比，而在1 703～1 754 nm波長范圍內，噴灑樂果的生菜光譜反射率與樂果濃度成正比。此外，噴灑不同濃度的樂果農藥，生菜的紋理圖像也存在差異。研究結果表明，樂果農藥對生菜微觀結構產生了較大改變，從而導致生菜葉片光譜圖像信息產生較大變化。對噴灑不同濃度樂果農藥的生菜葉片微觀結構進行研究分析，可為高光譜技術對不同濃度農藥殘留的生菜進行定量檢測提供機理研究依據。

生菜葉片； 農藥殘留； 機理； 微觀結構； 特征提取； 高光譜圖像

引言

生菜富含豐富的維生素、膳食纖維素、礦物質元素，具有醫療保健作用[1]。在生菜生長過程中，主要蟲害有潛葉蠅、白粉虱、蚜蟲、薊馬等，通常選用樂果中等毒殺蟲劑來進行防治，樂果的使用提高了生菜的產量，但是農藥殘留問題也隨之而來[2-3]。由于農藥的不規范、不科學使用造成的農藥殘留嚴重威脅著生菜品質安全，制約著生菜商品經濟的發展。而過量使用農藥不僅會造成農藥殘留在生菜上，還會造成地下水和土壤污染等環境問題[4]。一些學者利用光譜技術對農藥殘留檢測進行了研究[5-7]，使光譜信息檢測農殘成為一種研究思路。

目前，已經有部分學者進行了農藥殘留對植物葉片微觀結構影響的研究。趙文等[8]利用掃描電鏡和透射電鏡對噴灑不同濃度毒死蜱和霜霉威的2種系列黃瓜的外果皮進行了觀察，發現在未噴灑農藥的情況下，2種系列的黃瓜外果皮細胞具有較大差異。同時，也有學者利用掃描電鏡和透射電鏡對生菜進行了一些研究。WU[9]利用透射電鏡觀測到電噴霧噴射的納米顆粒進入生菜種子后可提高植物種子的萌發率。SHIM等[10]用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察了致病菌的細胞膜損傷，并研究評估了γ射線輻照對鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及細胞膜損傷存活的影響。這說明掃描電鏡和透射電鏡可以用于觀測生菜的微觀結構，但目前，尚未存在關于不同濃度農藥對生菜微觀結構的研究報道。

本文利用掃描電鏡觀察不同濃度樂果處理后的生菜表皮形態結構細微變化，根據電子和物質間的相互作用，獲得生菜表面的氣孔密度、氣孔大小和生菜斷面的葉片厚度等信息，并利用透射電鏡觀察生菜細胞內部結構變化。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗樣本的栽培與制備

實驗樣本為江蘇大學重點Venlo型溫室內種植的意大利全年耐抽苔生菜，采用珍珠巖為基質的無土栽培方式進行生菜培育，確保每株生菜樣本的營養均衡以避免營養元素對生菜微觀結構的影響。待到蓮座期時，利用塑料薄膜將生菜與土壤隔離開，防止生菜葉片上的農藥滴入土壤中并被生菜根系吸收。實驗試劑為南通江山晨樂化工股份有限公司生產的40%樂果乳油，首先配置4個濃度梯度(樂果農藥與丙酮體積比分別為1∶1 400、1∶1 000、1∶500、1∶100)的樂果農藥，然后將長勢相近的160株生菜分為4組，對每組生菜充分噴灑同一梯度濃度的樂果。歷時5 d后(安全間隔期)，摘取大小、形狀、長勢相近的160片成熟生菜葉片，依次編號并裝入貼有標簽的塑料袋密封保存，將采集得到的160片生菜分別裝袋送往實驗室，進行樣本高光譜圖像采集[11]。并快速切取2 mm×5 mm葉片和1 mm×2 mm葉片(溫度為25℃左右，相對濕度為65%，光照強度約為1 000 lx，采摘時刻為14:00)，并分別用4%戊二醛溶液固定，使其完全下沉，利用掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)對生菜葉片微觀結構進行檢測。最后，利用化學定量實驗[12]噴灑4個農藥(樂果，40%乳油)梯度，依次為0.36、1.02、5.10、15.78 mg/kg。其中，國家規定樂果農藥每日允許攝入量0.002 mg/kg，生菜表面樂果農藥最大檢測限量為1 mg/kg[13]。

1.2 掃描電鏡和透射電鏡

實驗儀器主要包括HCP-2型臨界點干燥儀、IB-5型離子濺射儀、INCA X-ACT型能譜儀、Quanta 200型掃描電鏡[14](SEM，美國FEI公司)和JEM-1400型透射電子顯微鏡[15](TEM，日本電子株式會社)。在SEM儀器中，鎢燈絲作為電子槍，加速電壓為0.2～30 kV，放大倍數為20～300 000倍，分辨率達到3.5 nm，如圖1所示。在TEM儀器中，加速電壓為0.04～100 kV，放大倍數為50～1 000 000倍，點分辨率達到0.38 nm，線分辨率達到0.2 nm，如圖2所示。

圖1 Quanta 200型掃描電鏡實物圖Fig.1 Picture of Quanta 200 SEM

圖2 JEM-1400型透射電鏡實物圖Fig.2 Picture of JEM-1400 TEM

1.3 SEM樣本處理

在掃描電鏡試驗前，先對葉片進行固定、脫水、斷裂、干燥、投影等處理[16]。樣本固定：將2 mm×5 mm生菜葉片樣本浸入4%戊二醛溶液，固定2 h(4℃)。脫水：先采用5個體積分數(30%、50%、70%、90%、100%)的乙醇按梯度逐步脫水，隨后采用體積比1∶1 的100%乙醇-乙醚混合液置換20 min，最后采用乙醚置換30 min。斷裂：將脫水處理后生菜葉片樣本放置在液氮環境中，當液氮平靜后，用由液氮冷卻處理的單面刀片撞擊生菜葉片樣本使其斷裂。干燥：在真空環境中，采用CO2對斷裂后的生菜葉片樣本進行臨界點干燥，使其溫度升至常溫(20℃)。投影：使用導電膠將干燥處理后的生菜葉片斷面向上粘在樣品臺上，用離子濺射鍍膜儀對樣本進行鍍金(15 mA，90 s)。最后，將2 mm×5 mm生菜葉片樣本進行掃描電鏡觀察。

1.4 TEM樣本處理

在透射電鏡試驗之前，葉片先經過洗滌、固定、脫水、浸透、包埋、聚合和超薄切片等處理[17]。固定洗滌：過4 h后，用pH值7.0的磷酸緩沖液沖洗1 mm×2 mm葉片3次，每次約為20 min，然后放入2%鋨酸液中使其完全黑透。脫水、滲透、包埋、聚合：磷酸緩沖液沖洗3次，每次約為20 min，用4個質量分數(30%、50%、70%、90%)的丙酮按梯度逐步脫水，隨后用100%丙酮脫水2次，每次約30 min，然后用包埋劑逐步浸透、包埋，并在恒溫箱中進行37℃—45℃—60℃加溫聚合12 h。超薄切片、染色：用美國RMC型超薄切片機切取50～70 nm厚度的葉片，采用鈾鉛方法染色，最后放入JEM-1400 TEM型透射電子顯微鏡觀察。

1.5 高光譜圖像的采集與標定

利用高光譜圖像系統采集樣本的高光譜圖像，先將生菜葉片樣本放置在一個長5 cm、寬10 cm的長方形白紙上，對儀器進行預熱使光源達到穩定狀態。其次將裝有生菜樣本的白紙放置在移動平臺上，鹵素燈放在水平夾角45°的位置，精密電控平移臺的平移速度設置為1.25 mm/s，曝光時間設置為20 ms，最終對所有制備的生菜樣本進行掃描，通過Spectral Cube軟件采集生菜的高光譜圖像。在采集樣本高光譜圖像前，系統需要黑白板標定[18]以消除暗電流等對高光譜圖像的影響。

2 結果與分析

為了從根本上研究樂果對生菜組織的影響，利用掃描電鏡觀察不同濃度樂果處理后的生菜表皮形態結構細微變化，根據電子和物質間的相互作用，獲得生菜表面的氣孔密度、氣孔大小和生菜斷面的葉片厚度等信息。利用透射電鏡觀察生菜細胞內部結構變化。

2.1 生菜表面微觀形態

生菜表面主要有表皮細胞和氣孔。生菜表面的樂果需通過氣孔進入內部細胞組織，因此對生菜表皮的研究主要針對氣孔進行。經過農藥處理后，生菜葉片的氣孔發生較大變化。隨著噴灑農藥濃度變高，氣孔的長寬比減小，氣孔密度也隨之變小，如圖3所示。因為生菜自身存在保護系統，生菜碰觸到高濃度的樂果后會自動開啟防御系統，氣孔會自動慢慢收縮以防止樂果的侵入。盡管如此，部分農藥殘留還會侵入生菜內部來破壞內部組織，高濃度樂果下的生菜表皮破損較為嚴重。因此，生菜表面氣孔的長寬比和密度變化直接反映了樂果農藥的殘留量。

圖3 不同濃度樂果對生菜葉片表面氣孔特征的影響Fig.3 Effect of pores on lettuce leaves sprayed with different concentrations of dimethoate

2.2 生菜葉肉組織

從生菜葉片樣本的切面分析，生菜葉片切面組織主要包含海綿組織、柵欄組織、上表皮和下表皮。當噴灑不同濃度農藥樂果時，生菜葉片切面厚度會發生明顯的變化。其中，不同濃度農藥樂果殘留下生菜葉片切面的海綿組織、柵欄組織厚度會出現明顯差異。從總體統計上看(表1)，隨著噴灑的農藥濃度變大，葉片的厚度將越來越薄。在生菜噴灑1∶1 400的農藥樂果時，生菜葉片的厚度為(168.38±8.80)μm，柵欄組織厚度為(117.05±5.68)μm，海綿組織厚度為(32.36±7.56)μm。當生菜上噴灑1∶100樂果時，生菜葉片厚度為(140.96±2.32)μm，柵欄組織厚度為(81.02±5.26)μm，海綿組織厚度為(54.98±3.48)μm。兩者葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度相差較大。

表1 不同濃度樂果下的葉片厚度Tab.1 Thickness of lettuce leaf sprayed with different concentrations of dimethoate μm

2.3 細胞超微結構

生菜內部細胞主要包括葉綠體、嗜鋨顆粒、細胞壁等，當樂果農藥通過氣孔進入生菜內部時，對生菜細胞產生較大影響。噴灑不同濃度樂果農藥后，生菜葉片葉綠體形態及內部結構均未發生較大變化，表明這些內部結構組織對樂果的侵害具有一定的抵抗力。隨著噴灑樂果農藥濃度的增加，生菜葉綠體內的嗜鋨顆粒變化較為明顯，數量變多，而淀粉顆粒變少。通過透射電鏡試驗觀察可以看出生菜葉片內部葉綠體斷層紋路清晰，呈矩形條狀。1∶1 400、1∶1 000樂果配比下，生菜葉片內部葉綠體排列緊湊，葉綠體間無縫隙；1∶500樂果配比下，生菜葉片內部葉綠體間已經開始出現了間隙；1∶1 00樂果配比下，生菜葉片內部葉綠體間的間隙較為明顯。不同濃度樂果農藥殘留下生菜葉片內部組織形態產生了細微變化。相關透鏡試驗結果見文獻[19]。

2.4 生菜光譜和紋理

樂果農藥不僅對生菜表皮組織產生影響，而且使得生菜內部組織形態結構產生細微變化。高光譜圖像技術將成像技術與光譜技術相結合，既得到了光譜信息，又得到了圖像信息。通過高光譜圖像的紋理信息和光譜信息直觀地反映出因噴灑不同濃度的農藥而造成的差異。紋理差異直接表現在樂果對生菜表面結構的破壞，噴灑農藥的濃度不同，生菜農藥殘留的光譜會存在差異，如圖4所示。

圖4 生菜農殘原始光譜曲線Fig.4 Original spectral curves of pesticide residues on lettuce leaves

生菜中心區域內的250像素×250像素區域選為感興趣區域(Region of interest,ROI)，并將計算得到ROI區域內光譜的平均值作為光譜數據。從圖4可以看出，在897～1 332 nm波長范圍內，噴灑樂果的生菜光譜反射率與樂果濃度成反比，噴灑的樂果濃度越高，生菜的光譜反射率越低。在1 703～1 754 nm波長范圍內，噴灑樂果的生菜光譜反射率與樂果濃度成正比，噴灑的樂果濃度越高，生菜的光譜反射率越高。在1 332～1 703 nm波長范圍內，可以明顯看到噴灑濃度較大的生菜光譜反射率低，其他濃度的生菜光譜反射率也存在差異。因此，噴灑的樂果農藥與生菜光譜反射率存在一定的相關性。

本文提取生菜葉片主成分圖像(PC1、PC2圖像)下基于灰度共生矩陣的紋理特征[20](對比度、相關性、能量、同質性)作為圖像信息，本文采用的是Matlab中的graycomatrix函數，將距離設為1，方向依次取0°、45°、90°、135°共4個角度，然后對感興趣區域中的葉片分別提取對比度、能量、同質性、相關性4個紋理特征，PC1、PC2下共計32個特征下紋理參數。從圖5可以看出,噴灑不同濃度的樂果農藥，生菜的紋理也存在差異。這表明噴灑的樂果與生菜圖像光譜反射率和紋理數據之間存在一定的相關性，因此可以利用高光譜圖像(Hyperspectral image,HSI)技術定量檢測生菜樂果殘留。

圖5 生菜農殘主成分圖像的紋理曲線Fig.5 Texture curves of principal component image of pesticide residues on lettuce leaf

3 結束語

采用掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)對不同濃度樂果農藥殘留下的生菜葉片微觀結構進行研究分析。研究結果表明隨著噴灑樂果農藥濃度的增加，生菜葉片表面氣孔的長寬比和氣孔密度逐漸變小，生菜葉片厚度變薄，生菜葉片內部的嗜鋨顆粒增加，淀粉顆粒變少。此外，生菜葉片內部細胞重要組成部分葉綠體間間隙隨著噴灑樂果農藥濃度的增加而逐漸變大。其中，葉片細胞的排列結構方式直接影響近紅外波段的植被反射光譜。噴灑不同濃度樂果農藥的生菜葉片近紅外波段的高光譜圖像信息間的差異性進一步驗證了HSI技術應用于生菜不同濃度農藥殘留定量檢測的有效性。為此，對噴灑不同濃度樂果農藥的生菜葉片微觀結構進行了研究分析，為HSI技術對生菜不同濃度農藥殘留進行定量檢測提供了機理研究依據。

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Mechanism of Different Concentrations of Dimethoate Residue on Microstructure of Lettuce Leaves

SUN Jun1,2ZHOU Xin1LI Qinglin2JIANG Shuying1MAO Hanping2YANG Ning1
(1.SchoolofElectricalandInformationEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China2.KeyLaboratoryofModernAgriculturalEquipmentandTechnology,MinistryofEducation,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)

Fast identification of pesticide residue in lettuce leaves plays a key role in the test of food safety. However, there are a few studies on the mechanism of pesticide on the internal structure of lettuce. In order to further study the effects of dimethoate on lettuce microstructure, the lettuce at rosette stage was used as the experimental object. Besides, scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) were used to detect the microstructure of lettuce leaves. It was found that the microstructure of the lettuce leaves was changed obviously with the increase of the concentration of dimethoate pesticides sprayed. Moreover, the ratio of length to width and density of stomata in leaves were decreased, leaf thickness was decreased, osmiophilic granules were increased and the starch granules were decreased. In the wavelength range of 897～1 332 nm, spraying dimethoate lettuce spectral reflectance was inversely proportional to the concentration of dimethoate. However, in the wavelength range of 1 703～1 754 nm, spraying dimethoate lettuce reflectance was proportional to the concentration of dimethoate. In addition, dimethoate pesticide spraying with different concentrations resulted in different textures of lettuce leaves. The results showed that dimethoate produced a huge change on lettuce microstructure, which caused great changes of the image information of lettuce leaves. Study on the microstructure of lettuce leaves sprayed with different concentrations of dimethoate pesticide provided the basis for the study on the mechanism of HSI technology to detect the different concentrations of pesticide residues in lettuce. Therefore, hyperspectral image detection technology can effectively realize the quantitative detection of pesticide residues on the surface of lettuce leaves.

lettuce leaves; pesticide residues; mechanism; microstructure; feature extraction; hyperspectral image

2016-08-30

2016-10-08

國家自然科學基金項目(31471413)、江蘇高校優勢學科建設工程項目PAPD(蘇政辦發2011 6號)、江蘇大學現代農業裝備與技術重點實驗室開放基金項目(NZ201306)和江蘇省六大人才高峰項目(ZBZZ-019)

孫俊(1978—)，男，教授，博士，主要從事計算機技術在農業工程中的應用研究，E-mail: sun2000jun@ujs.edu.cn

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.05.044

S636.2； 0433.4

A

1000-1298(2017)05-0350-06