膽管細胞癌中CtBP1、Zeb1、Zeb2與E-cadherin蛋白的表達及臨床意義

胡 潔，邊立會，王曉玉，楊月麗，張小玲，肖勝軍

膽管細胞癌中CtBP1、Zeb1、Zeb2與E-cadherin蛋白的表達及臨床意義

胡 潔1，邊立會2，王曉玉2，楊月麗2，張小玲3，肖勝軍4

目的 探討轉錄抑制因子Zeb1、Zeb2、轉錄輔抑制因子CtBP1及其靶基因E-cadherin在膽管細胞癌中的表達及CtBP1、E-cadherin的臨床意義。方法 采用免疫組化法檢測膽管細胞癌及癌旁組織芯片中CtBP1、Zeb1、Zeb2和E-cadherin的表達。結果 CtBP1在膽管細胞癌及癌旁組織中的陽性率分別為44.44%和17.86%，Zeb2分別為34.92%和10.71%，E-cadherin分別為50.79%和100%，組間差異均有統計學意義(P均<0.05)。Zeb1在膽管細胞癌僅1例表達，而在癌旁組織中不表達。CtBP1與膽管細胞癌的分化程度相關(P<0.05)，E-cadherin與膽管細胞癌的分化程度及遠處轉移有關(P均<0.05)。E-cadherin和CtBP1及Zeb2表達呈負相關(r=-0.034、-0.029，P均<0.001)，CtBP1和Zeb2表達呈正相關(r=0.228，P=0.005)。結論 膽管細胞癌中CtBP1、Zeb2與E-cadherin均表達異常，CtBP1、Zeb2可能共同參與E-cadherin表達調控。聯合檢測CtBP1和E-cadherin有望成為評估膽管細胞癌惡性生物學行為的參考指標。

肝腫瘤； 膽管細胞癌；Zeb1；Zeb2；羧基末端結合蛋白1；E-cadherin

膽管細胞癌(cholangiocarcinoma)是一種起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，近年來國內發病率及病死率呈上升趨勢，其惡性程度高，預后欠佳[1]。這與腫瘤術后局部復發和遠處轉移發生率較高密切相關。因此，探討膽管細胞癌侵襲轉移的機制，為臨床診斷、合理治療提供理論支持，具有非常積極的意義。腫瘤的侵襲及轉移依賴于細胞的黏附、運動和變形，而這些作用源于肌動蛋白絲的分解、細胞與細胞間黏附的失活和肌動蛋白聚合之間的調整。上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)是一種重要的細胞黏附分子，其介導的黏附連接的破壞是細胞解離和分離的初始步驟，因此，研究E-cadherin抑制的基本過程被認為對腫瘤預防和遷移的抑制作用有重大意義[2]。Zeb蛋白即E盒結合鋅指蛋白，是序列特異性DNA結合轉錄因子，其家族成員包括Zeb1和Zeb2。Zeb蛋白作為轉錄抑制因子能招募羧基末端結合蛋白(C-terminal binding protein, CtBP)，脊椎動物的CtBP基因編碼CtBP1和CtBP2兩種蛋白，其中CtBP1能與組蛋白去乙酰化酶相互作用，通過靶向結合啟動子區域抑制基因表達[3]。CtBP1、Zeb及E-cadherin在膽管細胞癌中的表達及相互關系國內外鮮有報道，本實驗采用免疫組化法檢測CtBP1、Zeb1、Zeb2及E-cadherin在膽管細胞癌及癌旁組織中的表達，初步探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2007～2014桂林醫學院附屬醫院手術切除的膽管細胞癌標本63例，其中男性34例，女性29例，有淋巴結轉移者17例，無淋巴結轉移者46例。患者年齡35～87歲(平均57.6歲)。高分化腺癌20例，中+低分化腺癌43例。患者術前均未行放、化療。鼠抗人CtBP1單克隆抗體(濃縮型，1 ∶100稀釋，Santa Cruz公司)；Zeb1及Zeb2(濃縮型，1 ∶100稀釋，Sigma Aldrich公司)；E-cadherin(濃縮型，1 ∶50稀釋，Santa Cruz公司)；二抗免疫組化檢測試劑盒購于北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片制備 鏡下觀察HE切片，選取2個腫瘤組織區域和1個癌旁組織區域并標記，然后通過組織芯片制作機細針打孔的方法在供體組織蠟塊上采集組織，并轉移至空白蠟塊的陣列孔中，每個孔芯直徑1.5 mm，制作組織芯片蠟塊1個，蠟塊含有155個點(1個為標志點)。

1.2.2 免疫組化 組織芯片蠟塊4 μm厚連續切片，60 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，高溫高壓熱修復，其他步驟按試劑盒說明書進行，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，脫水透明封固。以PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.3 結果判讀 由兩位病理科主治以上的醫師采用雙盲法獨立閱片，評判標準根據染色強度和陽性細胞百分比來判定。CtBP1：>75%的細胞核棕黃色為陽性；Zeb1：>25%的細胞核著色為陽性；Zeb2：>25%的細胞質及細胞核著色為陽性；E-cadherin：>25%的細胞膜完整著色為陽性。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學處理，膽管細胞癌與癌旁組織中各蛋白的陽性率之間的關系及CtBP1、E-cadherin與各臨床指標的相關性采用四格表Pearson χ2檢驗，膽管細胞癌中各蛋白表達的關聯性比較采用Pearson相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CtBP1、Zeb1、Zeb2和E-cadherin在膽管細胞癌和癌旁組織中的表達 CtBP1在細胞核中表達，膽管細胞癌及癌旁組織中的陽性率分別為44.44%、17.86%；Zeb2在細胞質及細胞核中表達，膽管細胞癌組織及癌旁組織的陽性率分別為34.92%、10.71%；E-cadherin在細胞膜及細胞質中表達，膽管細胞癌組織及癌旁組織的陽性率分別為50.79%、100%，差異均具有統計學意義(P均<0.05)；Zeb1在細胞核中表達，膽管細胞癌組織僅1例陽性，癌旁組織中不表達，差異無統計學意義(P>0.05，表1，圖1～3)。

2.2 膽管細胞癌中CtBP1及E-cadherin蛋白表達的臨床意義 膽管細胞癌組織中CtBP1蛋白的表達與分化程度相關，高分化膽管細胞癌的陽性率為20%，而中+低分化膽管細胞癌的陽性率高達69.77%，兩者之間的差異有統計學意義(P=0.009)，但其與患者年齡、性別、腫瘤大小、神經侵犯、脈管浸潤、淋巴結轉移及遠處轉移無明顯相關性。E-cadherin蛋白表達與膽管細胞癌組織分化程度及遠處轉移相關(P=0.005，P=0.038)，與其他臨床特征無明顯相關性(表2)。

①A①B①C②A②B②C③A③B③C

圖1 A.癌旁組織膽管上皮中CtBP1陰性；B.高分化膽管細胞癌中CtBP1細胞核弱陽性；C.中低分化膽管細胞癌中CtBP1細胞核強陽性，SP法 圖2 A.癌旁組織膽管上皮中E-cadherin細胞膜及細胞質陽性；B.高分化膽管細胞癌中E-cadherin部分細胞膜及細胞質陽性；C.中低分化膽管細胞癌中E-cadherin陰性，SP法 圖3 A.癌旁組織膽管上皮中Zeb2陰性；B.高分化膽管細胞癌中Zeb2細胞質及細胞核弱陽性；C.中低分化膽管細胞癌中Zeb2細胞質及細胞核強陽性，SP法

表1 CtBP1、Zeb1、Zeb2和E-cadherin在膽管細胞癌與癌旁組織中的表達

表2 CtBP1及E-cadherin蛋白表達與膽管細胞癌臨床病理特征的關系

2.3 膽管細胞癌中CtBP1、Zeb2和E-cadherin表達的關系 膽管細胞癌組織中28例CtBP1陽性者中僅7例E-cadherin陽性(25%)；CtBP1陰性病例中E-cadherin陽性率為71.43%(25/35)，兩者表達呈顯著負相關(rs=-0.034，P<0.001，表3)。膽管細胞癌組織中Zeb2陽性病例中CtBP1陽性率為68.18%(15/22)，Zeb2陰性病例中CtBP1陽性率為7.31%(13/41)，兩者表達呈高度正相關(rs=0.228，P=0.005，表4)；膽管細胞癌組織中Zeb2陽性病例中僅4例(18.18%)E-cadherin陽性，Zeb2陰性病例中E-cadherin陽性率為68.29%(28/41)，兩者表達呈顯著負相關(rs=-0.029，P<0.001，表5)。

表3 膽管細胞癌中CtBP1和E-cadherin蛋白表達的相關性

表4 膽管細胞癌中CtBP1和Zeb2蛋白表達的相關性

表5 膽管細胞癌中Zeb2和E-cadherin蛋白表達的相關性

3 討論

E-cadherin普遍存在于各類上皮細胞，參與細胞的凝聚力并在相同或不同類型細胞的組織結構重建和形態維持中起關鍵作用。大量研究發現E-cadherin具有抑制腫瘤浸潤轉移的作用[4]，其表達缺失能增加腫瘤的侵襲能力[5]。Araki等[6]發現E-cadherin表達下調能夠促進肝外膽管癌的發展，并與患者預后相關。本實驗結果顯示，跟癌旁組織比較，膽管細胞癌中E-cadherin蛋白表達明顯下調或缺失，并且與分化程度及遠處轉移相關，分化程度較低或伴有遠處轉移的膽管細胞癌中E-cadherin蛋白陽性率較低，差異具有統計學意義，綜合數據分析表明E-cadherin蛋白表達的下調或缺失促進了膽管細胞癌的浸潤和轉移，這與文獻報道一致[5]。實驗數據顯示E-cadherin蛋白在無淋巴結轉移組的陽性率高于伴淋巴結轉移組，但差異無統計學意義(P=0.085)，可能是由于研究樣本量較小的原因。

E-cadherin的編碼基因CDH1的表達受多個轉錄抑制因子的調控，包括Snail、Zeb等[7]，Zeb蛋白家族成員Zeb1及Zeb2都含有螺旋-環-螺旋基序，可以特異性地結合到 E-cadherin基因啟動子區域內的E-box上，從而參與調控E-cadherin的表達[8]。有報道稱[9-10]在多種腫瘤細胞中Zeb1及Zeb2可抑制E-cadherin的表達，其中Zeb1與轉錄輔助抑制因子CtBP1結合，形成轉錄抑制復合物，從而抑制E-cadherin轉錄[10]。而Zeb2通過結合E-cadherin基因啟動子的E-box抑制其表達，從而促進腫瘤細胞的浸潤轉移[11]。本組實驗結果顯示，在膽管細胞癌中Zeb2和CtBP1蛋白表達明顯上調，且與E-cadherin蛋白表達呈顯著負相關，Zeb2和CtBP1可能共同作用參與膽管細胞癌E-cadherin蛋白表達調控并抑制其表達，從而促進膽管細胞癌的浸潤轉移，其具體的作用機制有待于進一步深入研究。曾思恩等[12]曾報道CtBP1與肝細胞肝癌的分級相關，可作為腫瘤的預后因子。本實驗結果顯示CtBP1蛋白表達與膽管細胞癌的分化程度相關，腫瘤分化程度越低CtBP1蛋白的表達越高，也進一步提示CtBP1蛋白跟膽管細胞癌的惡性程度相關，但CtBP1蛋白表達與淋巴結轉移和遠處轉移無關，這可能與本組實驗樣本量較少有關，此外，還受病理科醫師取材能力及影像學診斷水平等主觀因素的影響。

Zeb1在癌旁組織中不表達，在膽管細胞癌中也僅有1例表達，兩者表達差異無統計學意義。作者推測Zeb1和Zeb2雖然在分子結構高度相似，但它們的表達量和功能上存在著一定的差異[8]。

綜上所述，CtBP1、Zeb2在膽管細胞癌中表達上調，兩者之間呈顯著正相關，并均與E-cadherin表達呈負相關，三者之間存在調控關系，共同促進膽管細胞癌的浸潤轉移；且CtBP1和E-cadherin均與膽管細胞癌分化程度相關，后者還與遠處轉移相關，聯合檢測CtBP1和E-cadherin有望成為評估膽管細胞癌惡性生物學行為的參考指標。

[1] Yang J, Yan L N. Current status of intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2008,14(41):6289-6297.

[2] Wong T S, Gao W, Chan J Y. Transcription regulation of E-cadherin by zinc finger E-box binding homeobox proteins in solid tumors[J]. Biomed Res Int, 2014,2014:921564.

[3] Sundqvist A, Sollerbrant K, Svensson C. The carboxy-terminal region of adenovirus E1A activates transcription through targeting of a C-terminal binding protein-histone deacetylase complex[J]. FEBS Lett, 1998,429(2):183-188.

[4] Lee J O, Kwun H J, Jung J K,etal. Hepatitis B virus X protein represses E-cadherin expression via activation of DNA methyltransferase 1[J]. Oncogene, 2005,24(44):6617-6625.

[5] 肖勝軍, 張小玲, 容明智, 等. 轉錄輔抑制因子CtBP1與其靶基因E-cadherin在結腸腺癌中的表達[J]. 世界華人消化雜志, 2009,17(36):3756-3759.

[6] Araki K, Shimura T, Suzuki H,etal. E/N-cadherin switch mediates cancer progression via TGF-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition in extrahepatic cholangiocarcinoma [J]. Br J Cancer, 2011,105(12):1885-1893.

[7] Schmalhofer O, Brabletz S, Brabletz T. E-cadherin,beta-catenin,and ZEB1 in malignant progression of cancer[J]. Cancer Metastasis Rev, 2009,28(1-2):151-166.

[8] Peinado H, Olmeda D, Cano A. Snail, Zeb and bHLH factors in tumour progression: an alliance against the epithelial phenotype[J]? Nat Rev Cancer, 2007,7(6):415-428.

[9] Postigo A A, Depp J L, Taylor J J,etal. Regulation of Smad signaling through a differential recruitment of coactivators and corepressors by ZEB proteins[J]. EMBO J, 2003,22(10):2453-2462.

[10] Pena C, Garcia J M, Garcia V,etal. The expression levels of the transcriptional regulators p300 and CtBP modulate the correlations between SNAIL, ZEB1, E-cadherin and vitamin D receptor in human colon carcinomas[J]. Int J Cancer, 2006,119(9):2098-2104.

[11] Vandewalle C, Van Roy F, Berx G. The role of the ZEB family of transcription factors in development and disease[J]. Cell Mol Life Sci, 2009,66(5):773-787.

[12] 曾思恩, 肖勝軍, 張小玲, 陳秋月. 肝細胞肝癌中轉錄輔抑制因子CtBP1與其靶基因E-cadherin的表達[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2010,26(6):655-657.

Expression of CtBP1, Zeb1, Zeb2 and E-cadherin in cholangiocarcinoma and their clinical significance

HU Jie1, BIAN Li-hui2, WANG Xiao-yu2, YANG Yue-li2, ZHANG Xiao-ling3, XIAO Sheng-jun4
(1DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China;2GraduateSchoolofGuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China;3DepartmentofPhysiology,FacultyofBasicMedicalSciences,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China;4DepartmentofPathology,theSecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541199,China)

Purpose To investigate the expression of transcriptional suppressor CtBP1, Zeb1, Zeb2 and their target gene E-cadherin, and their significance in cholangiocarcinoma. Methods The expression of CtBP1, Zeb1, Zeb2 and E-cad- herin proteins in cholangiocarcinoma and the paired non-neoplastic tissue array were detected by the immunohistohemical staining. Results The positive rates of CtBP1 expression in cholangiocarcinoma and the paired non-neoplastic tissue were 44.44% and 17.86%, these of Zeb2 were 34.92% and 10.71%, and these of E-cadherin were 50.79% and 100%, respectively. The differences between the groups were statistically significant (allP<0.05). There was only one case with expression of Zeb1 in cholangiocarcinoma, but no expression in the paired non-neoplastic tissue. CtBP1 was correlated with the degree of differentiation of cholangiocarcinoma (P<0.05). E-cadherin was related to the differentiation degree , and distant metastasis of cholangiocarcinoma (allP<0.05). The E-cadherin expression was negatively correlated with CtBP1 and Zeb2 (r=-0.034, -0.029, allP<0.05). The Zeb2 expression was positively correlated with CtBP1 (r=0.228,P=0.005). Conclusion CtBP1, Zeb2 and E-cadherin express abnormally in cholangiocarcinoma. CtBP1, Zeb2 may be involved in the regulation of E-cadherin expression. Joint detection of CtBP1 and E-cadherin is expected to be a reference index to evaluate the malignant biological behavior of cholangiocarcinoma.

liver neoplasms; cholangiocarcinoma; Zeb1; Zeb2; CtBP1; E-cadherin

國家自然科學基金(81660485)、廣西壯族自治區和計劃生育委員會資助課題(Z2015404)

1桂林醫學院附屬醫院病理科，桂林 5410012桂林醫學院研究生院，桂林 5410043桂林醫學院基礎醫學院生理學教研室，桂林 5410044桂林醫學院第二附屬醫院病理科，桂林 541199

胡 潔，女，主治醫師。E-mail: 214736697@qq.com 肖勝軍，男，教授，博士生導師，通訊作者。E-mail: xiaoshengjun@glmc.edu.cn

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.003.html

R 735.8

A

1001-7399(2017)04-0365-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.003

接受日期：2017-02-07