FoxM1抑制劑下調Rad51增敏順鉑對骨肉瘤耐藥細胞的化療抑制作用

朱 霞，魯康洋，江 燕，尹 玉，胡 勇，蔡永萍

FoxM1抑制劑下調Rad51增敏順鉑對骨肉瘤耐藥細胞的化療抑制作用

朱 霞1，魯康洋1，江 燕1，尹 玉1，胡 勇2，蔡永萍1

目的 探討FoxM1是否調控DNA修復基因Rad51參與順鉑(CDP)對骨肉瘤耐藥細胞化療抑制作用。方法 采用逐步增加劑量間歇作用的方法誘導骨肉瘤耐藥細胞系并分別命名為MG-63/R和HOS-MNNG/R。qRT-PCR、Western blot法檢測耐藥細胞與親本細胞FoxM1和Rad51的mRNA及蛋白表達；耐藥細胞中4 μmol/L Thiostrepton處理后qRT-PCR、Western blot法檢測FoxM1和Rad51的mRNA及蛋白表達。細胞計數法檢測單獨或聯合運用4 μmol/L Thiostrepton和2 μg/mL CDP對骨肉瘤耐藥細胞增殖率的影響。結果 建立在2 μg/mL CDP濃度中穩定生長的耐藥細胞系MG-63/R和HOS-MNNG/R，耐藥指數分別為30.52和37.87(均重度耐藥)。FoxM1和Rad51的mRNA及蛋白水平在耐藥細胞中表達較親本細胞明顯增高；在耐藥細胞中聯合運用4 μmol/L Thiostrepton和2 μg/mL CDP組較單獨應用4 μmol/L Thiostrepton組或2 μg/mL CDP組細胞增殖率明顯降低；耐藥細胞4 μmol/L Thiostrepton處理后FoxM1及Rad51的mRNA和蛋白表達均明顯降低。結論 FoxM1及Rad51高表達可能參與骨肉瘤細胞對CDP耐藥，FoxM1抑制劑Thiostrepton可能通過下調Rad51增強CDP對骨肉瘤耐藥細胞的抑制作用。

骨肉瘤；化療耐藥；順鉑；FoxM1；Rad51

骨肉瘤是發生于青少年的最常見的骨原發性高度惡性腫瘤，化療是骨肉瘤治療的重要手段之一。自20世紀80年代以來，盡管各種臨床實驗嘗試增加化療藥物劑量或聯合新的藥物提高化療效果，但患者的生存率始終無明顯改善[1]。化療耐藥導致化療失敗是患者復發和轉移的重要原因?；熌退幍脑蛴卸喾N，近年來研究發現DNA損傷修復是導致化療耐藥的因素之一[2]。Rad51是DNA損傷之后同源重組修復的關鍵蛋白，研究發現Rad51在腫瘤組織中高表達，且與化療藥物耐藥相關[3]。FoxM1(叉頭轉錄因子)是調控細胞周期的關鍵因子，新近研究發現FoxM1通過調控DNA損傷修復基因參與化療耐藥[4]，但其是否調控Rad51參與骨肉瘤對順鉑(CDP)化療耐藥目前尚未見相關報道。本實驗將探討FoxM1及Rad51是否參與骨肉瘤細胞對CDP耐藥，以期為臨床逆轉骨肉瘤化療耐藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑 骨肉瘤細胞系MG-63、HOS-MNNG購于中科院上海細胞庫；qRT-PCR試劑盒購于Vazyme公司；Thiostrepton(CAS 1393-48-2)購于Sigma公司，溶解于DMSO，-20 ℃保存；CDP生產于南京制藥廠公司；MTT試劑購于Sigma公司；FoxM1抗體(克隆號ab175798)、Rad51抗體(克隆號ab133534)及HRP標記的抗兔或抗鼠二抗均購于Abcam公司，β-actin抗體購于Abmart公司。

1.2 細胞培養 細胞在含10%滅活胎牛血清的DMEM培養液中培養，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 耐藥細胞系建立 采用逐步增加劑量間歇作用的方法誘導細胞耐藥。接種對數生長期的MG-63和HOS-MNNG細胞，加入質量濃度為0.1 μg/mL的CDP培養48 h，更換不含CDP的培養液，待細胞穩定生長后傳代，以上方法處理3次后CDP濃度更換為0.2 μg/mL，按此遞增CDP濃度，經過約4個月的誘導直至在2 μg/mL濃度下穩定生長和傳代，將誘導的耐藥細胞分別命名為MG-63/R和HOS-MNNG/R。

1.4 MTT法檢測CDP耐藥指數 將對數生長期的MG-63、MG-63/R、HOS-MNNG和HOS-MNNG/R細胞以1×104/mL濃度接種于96孔板中，培養24 h后棄培養液，加入含不同濃度CDP培養液，相鄰藥物濃度設置相差2倍，繼續培養48 h，加入5 mg/mL的MTT試劑20 μL培養4 h后加入100 μL DMSO，振蕩搖勻后酶標儀(λ=570 nm)測定每孔A值(A值與活細胞數成正比)。采用對數計量作圖法計算各種藥物對細胞達50%抑制率時的藥物濃度(IC50)，并計算耐藥指數(RI)=IC50(耐藥細胞)/IC50(親本細胞)。

1.5 qRT-PCR Trizol法提取總RNA，具體步驟見Trizol總RNA抽提試劑盒說明書；逆轉錄SYBR Green及qRT-PCR步驟見試劑盒說明書。FoxM1引物序列：上游5′-TGCAGCTAGGGATGT GAATCTTC-3′，下游5′-GGAGCCCAGTCCATCAGA ACT-3′；Rad51引物序列：上游5′-CAACCCATTTCA CGGTTAGA-3′，下游5′-TTCTTTGGCGCATAGGCAA CA-3′；18S引物序列：上游5′-CGGCGACGACCCATT CGAAC-3′，下游5′-GAATCGAACCCTGATTCCCCG TC-3′。18 S rRNA為內參。

1.6 Western blot法 收集細胞及蛋白提取后，采用BCA法蛋白定量，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，轉膜后5%脫脂牛奶封閉1 h以上，然后加入一抗FoxM1(1 ∶1 000稀釋)、Rad51(1 ∶1 000稀釋)或β-actin(1 ∶1 000稀釋)孵育過夜，加入HRP標記的抗兔或抗鼠二抗(1 ∶10 000稀釋)孵育2 h，顯影。

1.7 細胞增殖實驗 將對數生長期的細胞以2×104/mL接種于12孔板中，12 h后細胞分別加入DMSO、4 μmol/L Thiostrepton、2 μg/mL CDP和4 μmol/L Thiostrepton+2 μg/mL CDP，于處理1～5天中用細胞計數板對細胞進行計數，并繪制增殖曲線。

2 結果

2.1 耐藥細胞系的建立及耐藥指數檢測 采用逐步遞增濃度間歇作用的方法對MG-63和HOS-MNNG細胞進行體外誘導篩選，歷時4個月獲得在質量濃度為2 μg/mL CDP作用下生長良好的耐藥細胞系MG-63/R和HOS-MNNG/R。MTT法檢測結果表明MG-63/R和HOS-MNNG/R細胞對CDP的耐藥指數分別為30.52和37.87(表1)。

2.2 FoxM1和Rad51在骨肉瘤耐藥細胞及親本細胞中表達的比較 在前期建立的穩定的耐藥細胞系和親本細胞中運用qRT-PCR和Western blot法檢測FoxM1和Rad51的表達，結果發現在骨肉瘤耐藥細胞系MG-63/R和HOS-MNNG/R中FoxM1與Rad51的mRNA水平(圖1A、B)較親本細胞明顯升高。Western blot檢測結果顯示，與親本細胞MG-63(FoxM1：0.421±0.020，Rad51：0.848±0.110)相比，耐藥細胞MG-63/R(FoxM1：0.981±0.140，Rad51：3.166±0.180)的蛋白明顯升高；與親本細胞HOS-MNNG(FoxM1：0.675±0.015，Rad51：1.352±0.230)相比，耐藥細胞HOS-MNNG/R(FoxM1：1.266±0.011，Rad51：3.255±0.050)蛋白表達明顯增加(圖1C、D)。實驗結果表明：與骨肉瘤親本細胞相比，耐藥細胞中FoxM1和Rad51的表達明顯升高。

表1 骨肉瘤細胞對CDP耐藥的IC50及骨肉瘤耐藥細胞的耐藥指數

2.3 FoxM1抑制劑Thiostrepton增加耐藥細胞系MG-63/R、HOS-MNNG/R對CDP的敏感性 本實驗在MG-63/R和HOS-MNNG/R細胞系中分別加入4 μmol/L Thiostrepton、2 μg/mL CDP或4 μmol/L Thiostrepton+2 μg/mL CDP，于處理1～5天中每天分別對細胞進行計數，結果顯示聯合運用4 μmol/L Thiostrepton和2 μg/mL CDP組較單獨應用4 μmol/L Thiostrepton組或2 μg/mL CDP組增殖明顯減慢，表明聯合運用Thiostrepton可增敏CDP對骨肉瘤耐藥細胞的化療抑制作用(圖2A、B)。

2.4 FoxM1抑制劑Thiostrepton對Rad51 mRNA和蛋白表達的作用 為探究耐藥細胞系中FoxM1抑制劑Thiostrepton是否通過下調Rad51增敏耐藥骨肉瘤對CDP的敏感性，耐藥細胞中加入4 μmol/L Thiostrepton處理24 h后qRT-PCR法檢測FoxM1及Rad51的mRNA水平表達，處理48 h后Western blot法檢測FoxM1及Rad51的蛋白水平表達。qRT-PCR結果顯示，耐藥細胞中4 μmol/L Thiostrepton處理后FoxM1及Rad51的mRNA水平(圖3A、B)明顯下降。Western blot結果顯示，4 μmol/L Thiostrepton處理后MG-63/R(FoxM1：0.744±0.236，Rad51：0.240±0.227)較對照組MG-63/R(FoxM1：1.524±0.234，Rad51：0.389±0.156)的FoxM1與Rad51蛋白明顯下降；同樣，4 μmol/L Thiostrepton處理后HOS-MNNG/R(FoxM1：0.648±0.087，Rad51：0.367±0.023)的FoxM1與Rad51蛋白水平較對照組HOS-MNNG/R(FoxM1：1.438±0.210，Rad51：0.576±0.223)的蛋白明顯降低(圖3C、D)。結果表明在骨肉瘤耐藥細胞中，FoxM1抑制劑Thiostrepton下調FoxM1及Rad51的表達。

圖1 骨肉瘤耐藥細胞中FoxM1和Rad51的mRNA及蛋白表達水平較其親本細胞明顯增高

A、B.qRT-PCR法檢測骨肉瘤親本細胞及其耐藥細胞FoxM1和Rad51 mRNA表達；C、D.Western blot法檢測骨肉瘤親本細胞及其耐藥細胞FoxM1和Rad51蛋白表達水平，*P<0.05

圖2 FoxM1抑制劑Thiostrepton增敏骨肉瘤耐藥細胞對CDP的敏感性

骨肉瘤耐藥細胞系MG-63/R(A)、HOS-MNNG/R(B)加入DMSO、4 μmol/L Thiostrepton、2 μg/mL CDP、4 μmol/L Thiostrepton+2 μg/mL CDP的5天細胞增殖曲線圖，*P<0.05

3 討論

骨肉瘤是一種來源于間葉組織的最常見的骨原發性惡性腫瘤，好發于青少年，常發生肺轉移。目前治療方法包括術前新輔助化療和瘤體切除在內的綜合治療，新輔助化療標準化療方案為CDP、阿霉素和甲氨蝶呤三聯療法[5]。然而近30年來骨肉瘤患者的預后無明顯改善，尤其是對化療耐藥的患者預后極差，約20%患者出現復發和轉移[1]?，F階段，化療耐藥使得近年來骨肉瘤的治療進入瓶頸期。

本組實驗首先以CDP為誘導劑，建立穩定骨肉瘤耐藥細胞系MG-63/R與HOS-MNNG/R。Snow等[6]認為為耐藥指數﹤5為低度耐藥，5～15為中度耐藥，>15為高度耐藥。本實驗建立的骨肉瘤耐藥細胞系MG-63/R與HOS-MNNG/R耐藥指數分別為30.52和37.87，均顯示高度耐藥。CDP是骨肉瘤化療標準方案的基礎藥物之一，以CDP為誘導劑建立的人骨肉瘤耐藥細胞系對臨床耐藥研究具有重要意義，為后續研究提供良好基礎。

CDP是一種細胞毒性藥物，引起DNA雙鏈斷裂和抑制DNA的合成，最終導致細胞死亡[7]。當DNA修復能力增強時，常會導致腫瘤細胞對化療藥物的耐受，因此DNA損傷修復與CDP化療耐藥有重要聯系，同源重組是體內DNA損傷修復的主要機制[2]。

圖3 FoxM1抑制劑Thiostrepton抑制Rad51的mRNA及蛋白水平表達

A、B.qRT-PCR檢測骨肉瘤耐藥細胞系MG63/R、HOS-MNNG/R中4 μmol/L Thiostrepton處理24 h后FoxM1和Rad51的mRNA表達；C、D.Western blot法檢測骨肉瘤耐藥細胞系MG63/R、HOS-MNNG/R中4 μmol/L Thiostrepton處理48 h后FoxM1和Rad51蛋白表達，*P<0.05

DNA雙鏈斷裂修復蛋白Rad51是一種高度保守的主要在同源重組中發揮作用的DNA修復蛋白，是同源重組中最重要的關鍵酶，對維持基因的穩定性起重要作用[2]。本組實驗發現Rad51的mRNA及蛋白水平在骨肉瘤耐藥細胞系較親本細胞表達均明顯升高。與非小細胞肺癌中，Rad51高表達與CDP化療耐藥相關[3]相一致。另外有研究結果表明運用shRNA抑制Rad51表達增強骨肉瘤細胞對放、化療的敏感性[8]。因此，作者推測Rad51高表達與骨肉瘤細胞化療耐藥密切相關，并且有望成為逆轉骨肉瘤化療耐藥的新靶點。然而，近來研究發現，目前已知的Rad51抑制劑缺乏特異性，無法應用于臨床實驗[9]。因此，本實驗試圖尋找它的上游基因調控Rad51的表達逆轉骨肉瘤細胞耐藥。

FoxM1是一種與細胞增殖密切相關的轉錄因子，在調控細胞周期特別是G2/M期轉換中尤為重要[10]；且在多種惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的發生、發展密切相關[11]。本實驗結果發現FoxM1的mRNA及蛋白水平在骨肉瘤耐藥細胞系中表達較其親本細胞明顯升高，提示FoxM1高表達可能參與骨肉瘤CDP耐藥。研究表明FoxM1高表達與耐藥相關，抑制FoxM1表達增加腫瘤耐藥細胞對化療藥物的敏感性[12]。此外，研究報道在多形性膠質細胞瘤中，FoxM1直接調節Rad51的表達，調節細胞對化療藥物的耐藥性[13]。然而骨肉瘤中FoxM1與Rad51的表達是否存在相關性目前尚未見報道。

Thiostrepton是一種特異性抑制FoxM1轉錄活性的噻唑抗生素[14]，具有廣譜的抗革蘭陰性、陽性細菌的作用。研究發現在體內實驗中，Thiostrepton抑制FoxM1表達從而抑制腫瘤生長[15]。本實驗發現在耐藥細胞系中，單獨應用Thiostrepton處理后耐藥細胞的增殖率明顯下降，可能與Thiostrepton抑制FoxM1表達導致細胞周期停滯在G2/M期有關[10]。聯合運用Thiostrepton與CDP處理組的耐藥細胞的增殖率明顯低于單獨運用其中一種藥物處理組的細胞增殖率，提示Thiostrepton可能增敏CDP對骨肉瘤耐藥細胞的生長抑制作用。有趣的是，實驗發現應用Thiostrepton處理耐藥細胞后，FoxM1與Rad51的mRNA和蛋白水平也明顯下降。因此，作者推測FoxM1可能通過調控Rad51的表達來介導細胞耐藥。

化療耐藥是導致腫瘤化療失敗的關鍵因素，探究腫瘤耐藥機制對于提高腫瘤化療效果至關重要。本組實驗結果表明，在骨肉瘤耐藥細胞中抑制FoxM1表達能夠降低Rad51的表達增敏耐藥骨肉瘤細胞對CDP的敏感性。FoxM1及Rad51可能成為逆轉骨肉瘤化療耐藥的重要靶點，FoxM1抑制劑Thiostrepton有望與化療藥物聯合應用于骨肉瘤治療，提高耐藥骨肉瘤的化療效果。

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FoxM1 inhibitor sensitize resistant osteosarcoma cells to cisplatin by down-regulation of Rad51

ZHU Xia1, LU Kang-yang1, JIANG Yan1, YIN Yu1, HU Yong2, CAI Yong-ping1
(1DepartmentofPathology,BasicMedicalInstituteofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To investigate whether FoxM1 participate in inhibitory effect of cisplatin (CDP) in resistant osteosarcoma cell lines by down-regulation of Rad51. Methods The resistant osteosarcoma cell lines were induced by gradually increasing dose intermittent action, and were named MG-63/R and HOS-MNNG/R respectively. The mRNA and protein level of FoxM1 and Rad51 were detected by qRT-PCR and Western blot analysis in resistant cells and parental cells. The mRNA and protein level of FoxM1 and Rad51 were detected by qRT-PCR and Western blot analysis in resistant cells after treatment of 4 μmol/L Thiostrepton . The effect of single or combined treated of 4 μmol/L Thiostrepton or 2 μg/mL CDP on the rate of cell proliferation in resistant cells was examed by cell counting. Results Resistant osteosarcoma cell lines MG-63/R and HOS-MNNG/R were established and stablely growthed in the concentration of 2 μg/mL CDP, and the resistance index was 30.52 and 37.87 respectively (severe CDP resistance). The mRNA and protein level of FoxM1 and Rad51 were significantly increaced in resistant cells compared with parental cells. The proliferation rate of resistant cells in conbination of 4 μmol/L Thiostrepton and 2 μg/mL CDP treated group was significantly lower than these two drugs single treated group. The level of mRNA and protein of FoxM1 and Rad51 were significantly decreased after 4 μmol/L Thiostrepton treatment in CDP resistant cells. Conclusion The results suggest that FoxM1 and Rad51 may participate in the resistant osteosarcoma cells to CDP. FoxM1 inhibitor Thiostrepton may strengthen the inhibitory effect of CDP in the resistant cells by down-regulation of Rad51.

osteosarcoma; chemotherapy resistance; cisplatin; FoxM1; Rad51

國家自然科學青年基金(81102041)、安徽省自然科學基金(11040606Q17)

1安徽醫科大學基礎醫學院病理學教研室，合肥 2300322安徽醫科大學第一附屬醫院骨科，合肥 230032

朱 霞，女，碩士研究生。E-mail: zhuxia@stu.ahmu.edu.cn 蔡永萍，女，博士，副教授，通訊作者。E-mail: cyply221@163.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.011.html

R 738.1

A

1001-7399(2017)04-0403-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.011

接受日期：2017-02-07