miR-21通過PDCD4調控肝癌細胞的生長和侵襲

印 滇，楊 莉，張 亮，繆亞軍，馮 秀，王以浪

miR-21通過PDCD4調控肝癌細胞的生長和侵襲

印 滇，楊 莉，張 亮，繆亞軍，馮 秀，王以浪

目的 探討miR-21在原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)組織和細胞中的表達及其可能調控的靶基因。方法 檢測miR-21在HCC組織和細胞系中的表達，使用miR-21抑制劑后，觀察HCC細胞活力和侵襲能力的變化；運用生物信息學分析預測miR-21可能的靶基因。應用miR-21抑制劑后，雙熒光素酶報告基因系統檢測其對靶基因活性的影響。結果 HCC組織中miR-21表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)；HCC細胞中miR-21的表達水平顯著高于肝細胞(P<0.01)。抑制miR-21后，HCC細胞的活力和侵襲能力降低(P<0.01)。抑癌基因程序性死亡因子4(programmed cell death 4, PDCD4)在HCC組織中的表達顯著低于癌旁組織(P<0.01)，在肝癌細胞中的表達水平顯著低于肝細胞(P<0.01)。干擾PDCD4后，肝癌細胞的活力和侵襲能力提高(P<0.05)。雙熒光素酶報告基因檢測顯示，使用miR-21抑制劑后，PDCD4表達上調(P<0.01)，肝癌細胞的侵襲和增殖能力降低(P<0.01)。干擾PDCD4后，肝癌細胞的侵襲和增殖能力升高(P<0.001)。結論 miR-21可通過PDCD4調控肝癌細胞的生長和侵襲。

肝腫瘤；miR-21；PDCD4

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的病死率在全球惡性腫瘤中位居第3位，國內位居第2位。由于其侵襲性高，易肝內轉移和復發，HCC患者預后一般較差，術后5年生存率通常不超過40%[1]。微小RNA(miRNA)是近年來發現的一類內源性單鏈非編碼RNA，長17～25個核苷酸，以互補配對方式與靶基因的堿基結合。其與腫瘤的發生密切相關，在腫瘤發生過程中既可以扮演癌基因也可扮演抑癌基因的角色[2-3]。miR-21是miRNA中具有代表性的基因，通過多種途徑抑制基因轉錄，發揮類似癌基因的作用，影響細胞的增殖、分化和凋亡等過程[4]。miR-21在外周血中可以穩定地存在，血清中高水平的miR-21往往提示預后不良[5]。目前已明確抑癌基因程序性死亡因子4(programmed cell death 4, PDCD4)是miR-21的靶基因之一。本文探討miR-21在HCC組織和細胞中的表達，及其對PDCD4的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2015年6月～2016年6月南通市第一人民醫院病理科存檔的16例HCC組織，另取相應癌旁組織(距腫瘤病變5 cm以上，經HE染色證實無癌細胞浸潤)作為對照組，術前患者均未接受肝動脈化療栓塞治療等治療。16例患者年齡38～71歲，平均(45±3.3)歲；其中男性12例，女性4例。本實驗標本采集經我院倫理委員會同意，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人肝細胞系THLE2和人肝癌細胞系HepG2、Huh7均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。細胞培養于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DEDM(Gibco公司)培養基，于37 ℃ 5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染 細胞轉染前一天6孔培養板中接種適當數量的細胞，每孔加入2 mL不含抗生素的培養基，轉染時的細胞密度達50%～60%。次日棄去6孔板中的舊培養基，用不含血清的Opti-MEMI培養基洗滌2次，每孔加入Opti-MEMI 1.5 mL。共同轉染分為miR-21 inhibitor陰性對照+siRNA陰性對照組、miR-21 inhibitor+siRNA陰性對照組、miR-21 inhibitor+PDCD4 siRNA組。用250 μL不含血清培養基Opti-MEMI稀釋10 μL siRNA、miR-21 inhibitor及其相應的陰性對照物，輕輕混勻，室溫孵育5 min；用250 μL不含血清培養基Opti-MEMI稀釋Lipofectamine 2000，輕輕混勻并室溫孵育5 min，將稀釋過的Lipofectamine 2000與上述稀釋好的siRNA和miR-21 inhibitor輕輕混勻，室溫孵育20 min使其充分混合。將制備好的轉染試劑混合液加入含有HepG2細胞以及培養基的6孔培養板各孔中，輕輕混勻；將培養板置于37 ℃ 5%CO2培養箱中孵育，6～8 h后換液，72 h后檢測PDCD4蛋白水平、細胞增殖和侵襲能力改變。

1.2.3 qRT-PCR 組織標本經液氮研磨，提取肝癌組織和癌旁組織中的總RNA，逆轉錄后得到cDNA，qRT-PCR使用7500實時定量PCR系統，PDCD4以β-actin作為內參。使用miR-21檢測試劑盒(美國Applied Biosystems，ABI公司)，按試劑盒說明書測定miR-21。引物序列為miR-21 F：5′-CTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-21 R：5′-GCCGCTAGCTTACAGACTGATGT-3′。U6snRNA作為內參，引物序列為U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6 R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PDCD4引物由上海生工公司合成，引物序列為PDCD4 F：5′-CCTGAATTAGCACTGGATACTCCT-3′，PDCD4 R：5′-CTAGCCTGCACACAATCTACAGTT-3′。

1.2.4 Western blot檢測 轉染后72 h，裂解HepG2、Huh7細胞，收集蛋白，樣品使用10%SDS-PAGE分離，而后轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加PDCD4一抗，4 ℃過夜，次日加二抗，histone 3作為內參，ECL法顯色。

1.2.5 細胞活力檢測 采用CCK-8法檢測細胞活力，操作步驟按試劑盒說明書進行。細胞接種于96孔板，加入HepG2細胞。分別加入inhibitor陰性對照+siRNA陰性對照、miR-21 inhibitor+siRNA陰性對照、miR-21 inhibitor+siRNA PDCD4，48 h后，檢測細胞活力。PDCD4干擾片段由上海拓然公司合成 。

1.2.6 細胞侵襲能力 細胞侵襲能力用Transwell試驗檢測。HepG2細胞以5×104/mL密度種植在24孔板上。下室加入400 μL 10%FBS。未穿過的細胞用棉球從膜的上方小心拭去。下方細胞用多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，倒置顯微鏡計數。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因試驗 根據生物信息學軟件多種靶基因在線分析，預測miR-21可能的靶基因，并獲取含有作用位點的片段序列。預測設計引物，擴增出包含有保守性結合位點的3′-UTR-WT和3′-UTR-MT，擴增產物行凝膠電泳，將目的基因切膠回收，再連接目的基因和載體，構建pGL3-PDCD4-3′-UTR和PDCD4-3′-UTR-MT載體，依次進行轉化感受態菌、目的基因測序、質粒抽提，重組質粒轉染HepG2、Huh7細胞，行雙熒光素酶報告基因分析。

2 結果

2.1 miR-21在HCC組織和細胞系中的表達 qRT-PCR實驗結果表明，miR-21在HCC組織中的表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。miR-21在人肝癌細胞系HepG2、Huh7中的表達水平顯著高于肝細胞系THLE2(P<0.01，圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測miR-21在肝組織和細胞系中的表達

A.HCC與癌旁組織中miR-21的表達，*P<0.05；B. miR-21在不同細胞系中的表達，**P<0.01

2.2 miR-21對HCC細胞活力和侵襲能力的影響 與對照組相比，使用miR-21抑制劑后，HepG2細胞的侵襲能力下降，Transwell穿過的細胞數目分別為120±5和46±8(P<0.01)。與對照組相比，miR-21抑制劑組HepG2細胞活力下降，CCK-8檢測細胞的相對活力分別為1±0.02和 0.48±0.15(P<0.01，圖2)。

圖2 miR-21抑制劑處理對HepG2細胞活力和侵襲能力的影響

A.Transwell檢測miR-21抑制劑處理對HepG2細胞侵襲功能的影響，**P<0.01；B.CCK-8檢測miR-21抑制劑處理48 h對HepG2細胞活力的影響，**P<0.01

2.3 PDCD4在HCC組織和細胞系中的表達 Western blot檢測結果顯示，HCC組織中PDCD4表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.01)。HepG2、Huh7細胞中的PDCD4表達水平顯著低于THLE2(P<0.01，圖3)。

2.4 miR-21抑制劑對PDCD4表達的影響 使用miR-21抑制劑后，HepG2、Huh7中的PDCD4蛋白表達量明顯升高(圖4)。

2.5 熒光素酶報告基因檢測 PDCD4-3′-UTR-WT共轉染組，轉染miR-21抑制劑后熒光素酶相對活性明顯增加，與對照組及PDCD4-3′-UTR-MT組相比差異有統計學意義(P<0.01)。PDCD4-3′-UTR-MT組轉染miR-21抑制劑后，熒光素酶活性與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，表明PDCD4是miR-21的靶基因之一(圖5)。

圖3 miR-21對PDCD4的調控作用

A.Western blot檢測PDCD4在組織中的表達，**P<0.01；B.Western blot檢測PDCD4在細胞系中的表達，**P<0.01

圖4 miR-21抑制劑對HepG2和Huh7細胞中PDCD4表達的影響1.anti-miR-N；2.anti-miR-21

圖5 雙熒光素酶報告基因檢測 **P<0.01

2.6 PDCD4介導miR-21對細胞活力和侵襲性的影響 使用miR-21抑制劑和siRNA-PDCD4處理HepG2細胞后，Transwell檢測的miR-21抑制劑對照+siRNA對照組、miR-21抑制劑+siRNA對照組、miR-21抑制劑+siRNA-PDCD4 組穿過的細胞數目分別為183±2、76±5、231±3(P<0.01，P<0.001)；CCK-8檢測的三組細胞相對活力分別為1.0±0.1、0.48±0.08、1.47±0.23(P<0.01，P<0.001，圖6)。這提示PDCD4介導了miR-21對細胞活力和侵襲能力的調控。

圖6 Transwell和CCK-8檢測miR-21抑制劑和siRNA PDCD4處理后對HepG2細胞侵襲能力和活力的影響

**P<0.01，***P<0.001

3 討論

miRNAs通過與目標基因的mRNAs 3′UTR互補配對來抑制其蛋白表達，因此miRNAs介導調控腫瘤的發生、發展的途徑可能有以下幾種：與抑癌基因結合的miRNAs過表達或信號放大，與癌基因結合的miRNAs內源性丟失。盡管原發性肝癌的診治技術近年來有所改善，但由于其易發生肝內外轉移，肝癌的預后仍較差。因此，了解肝癌的發生和轉移機制在惡性腫瘤的治療中顯得尤為重要。Medina等[6]的研究證實：miR-21是一種癌基因性質的RNA，一些腫瘤的生長對其有明顯的依賴性。研究表明，miR-21在非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中過表達，可抑制靶基因的表達，與腫瘤細胞生長、增殖、侵襲轉移等生物學行為密切相關。有研究表明miR-21高表達亦預示著乳腺癌、結腸癌患者預后不良。其在HCC組織中的水平是癌旁組織的近3倍，與HCC患者術后預后密切相關(HR=1.684 7)[7]。本實驗亦證明miR-21在HCC組織中的表達水平比癌旁組織高，在肝癌細胞系中的表達水平比肝細胞系高，這與文獻報道相一致。在肝癌細胞系HepG2中，通過轉染化學合成的miR-21抑制劑，使miR-21低表達可抑制HepG2細胞的活力和侵襲能力，促進細胞凋亡。

PDCD4是AKT/PI3K/mTOR通路下游重要的靶點之一，研究發現其是一種新的抑癌基因。人的PDCD4基因定位于10q24，編碼的蛋白約含469個氨基酸。大量研究發現PDCD4通過影響癌細胞的增殖、轉移和抗凋亡能力發揮其抗腫瘤效應。Matsuhashi等[8]報道PDCD4是轉化生長因子TGF-βl誘導HCC凋亡所必需的分子。Wei等[9]研究卵巢癌發現，PDCD4表達與腫瘤惡性程度和預后相關。Zhu等[10]研究124例肺癌組織中PDCD4的表達，發現有84例PDCD4表達下降或缺失。Zhang等[11]研究證實PDCD4抑制侵襲相關蛋白AKT和MAP4K1的表達和基因活性，增加轉移抑制蛋白如E-cadherin和TIMP2的釋放。

Sun等[12]研究證實PDCD4在轉錄后水平被miR-21負性調節，上調的miR-21和下調的PDCD4能促進頭頸部鱗癌細胞的增殖；而轉染miR-21抑制劑后能上調PDCD4的表達，減慢細胞的分化速率。miR-21通過其靶基因PTEN、PDCD4和RECK調控肝癌細胞轉移。有研究證實，miR-21與PDCD4表達呈負相關。PDCD4低表達者腫瘤較大，易發生遠處和淋巴結遠轉移[13]。提示miR-21可能通過抑制PDCD4的表達促進腫瘤生長和轉移。miR-21可通過miR21-PDCD4-AP-1反饋環路促進HCC的侵襲和轉移。

PDCD4基因3′端非翻譯區有高保守的miR-21結合位點，研究發現在結直腸癌細胞中miR-21可下調PDCD4基因的表達，促進腫瘤細胞的侵襲及轉移。本實驗Western blot檢測結果顯示，肝癌組織中PDCD4表達水平顯著低于癌旁組織。肝癌細胞HepG2、Huh7中的PDCD4表達水平顯著低于肝細胞THLE2；抑制miR-21后，PDCD4 mRNA變化無差異，但PDCD4蛋白表達水平則明顯增高，證明miR-21在轉錄后在蛋白水平調控PDCD4表達。本研究通過Target Scan軟件分析得知miR-21強結合PDCD4的3′UTR，熒光素酶報告基因實驗亦證實了肝癌中miR-21通過結合PDCD4 mRNA的3′UTR抑制其翻譯表達。使用miR-21抑制劑處理HepG2細胞后，細胞活力和侵襲能力明顯降低；干擾PDCD4基因后，能恢復miR-21對HepG2細胞活力和侵襲的促進作用，這一結果與其他腫瘤中的研究結果相一致。

綜上所述，在肝癌中，miR-21和PDCD4表達呈負相關，miR-21通過抑制PDCD4表達，促進肝癌細胞的生長和侵襲。

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MiR-21 regulates the growth and invasion of liver cancer cells through PDCD4

YIN Dian, YANG Li, ZHANG Liang, MIU Ya-jun, FENG Xiu, WANG Yi-lang
(DepartmentofOncology,theFirstPeople’sHospitalofNantong,Nantong226001,China)

Purpose To evaluate the expression of miR-21 in the tissues and cell lines of hepatocellular carcinoma, and to try to find its possible target genes. Methods The expression profile of miR-21 was detected in hepatocellular carcinoma tissues and cell lines. After miR-21 inhibitor was used, the alterations in the vitality and invasion of hepatocellular carcinoma cells were observed. The possible target gene of miR-21 was predicted by bioinformatics analysis. The influence of miR-21 inhibitors on the target gene activity was evaluated by dual luciferase reporting gene system. Results The expression level of miR-21 was significantly higher in hepatocellular carcinoma tissues than that in the adjacent ones (P<0.05). The expression level of miR-21 in hepatocellular carcinoma cells was significantly higher than that in the hepatic cells (P<0.01). After inhibiting miR-21, the viability and invasion ability of hepatocellular carcinoma cells were decreased (P<0.01). The expression level of programmed cell death 4 (PDCD4) in hepatocellular carcinoma tissues was significantly lower than that in the adjacent tissues (P<0.01). Its expression level in hepatocellular carcinoma cells was significantly lower than that in the hepatic cells (P<0.01). After interfering with PDCD4, the vitality and invasion ability of liver cancer cells were increased (P<0.05). Dual luciferase reporter gene assay indicated that by inhibiting miR-21, the expression level of PDCD4 was up-regulated (P<0.01). The vitality and invasion ability of liver cancer cells were reduced (P<0.001). Conclusion MiR-21 can regulate the growth and invasion of liver cancer cells through targeting PDCD4.

hepatocellular neoplasms; miR-21; PDCD4

南通市衛計委青年基金(WQ2015018)

江蘇省南通市第一人民醫院腫瘤科，南通 226001

印 滇，男，碩士，主治醫師。E-mail: 6820648@qq.com 王以浪，男，碩士，主治醫師，通訊作者。E-mail: 895325173@qq.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.013.html

R 735.7

A

1001-7399(2017)04-0412-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.013

接受日期：2016-12-23