巨噬細胞在急性重癥胰腺炎繼發感染中的機制研究

張明剛， 段 軍， 陶永康， 楊華元， 杜時雨

中日友好醫院 1.消化內科; 2.重癥醫學科; 3.急診科, 北京 100029

巨噬細胞在急性重癥胰腺炎繼發感染中的機制研究

張明剛1， 段 軍2， 陶永康3， 楊華元1， 杜時雨1

中日友好醫院 1.消化內科; 2.重癥醫學科; 3.急診科, 北京 100029

目的分析受試者外周血中巨噬細胞的活化狀態與急性重癥胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)患者繼發感染的相關性。方法132例SAP患者入選，根據是否繼發感染分為感染組和未感染組，并以健康對照者作為對照組。在繼發感染初期，用酶聯免疫檢測方法檢測血清中促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的濃度；用流式細胞術檢測外周血中巨噬細胞百分率和刺激分子的表達及分泌上述促炎因子的變化。結果感染組和未感染組的血清中促炎因子TNF-α、IL-1β，較健康對照組均升高；巨噬細胞的比例及數量較健康對照組也明顯增多；MHC-Ⅱ、CD86、TNF-α+細胞、IL-1β+細胞的比例也較健康對照組均升高，且感染組的各項指標均明顯高于未感染組(P<0.05)。結論SAP的發生和繼發感染與巨噬細胞的活化密切相關，繼發感染后巨噬細胞的活化增強。

急性重癥胰腺炎;巨噬細胞;繼發感染;固有免疫

急性重癥胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是一種臨床常見的急性腹部疾病。盡管醫療條件不斷提高，該疾病的死亡率為10%～30%，導致死亡的主要原因是其繼發感染引起的多器官功能衰竭[1]。固有免疫是機體對抗炎癥等“危險信號”的第一道防線，巨噬細胞和中性粒細胞是介導炎癥的重要成員，也是誘發獲得性免疫的“使者”。近年來，免疫失調被認為是急性胰腺炎的重要發病機制之一，因此，如何通過調節免疫系統有效降低SAP繼發感染的發生率和有效控制感染是目前研究的熱點。現有研究[2-5]表明，胰腺炎患者血液中炎性因子濃度明顯增加，黏附分子和趨化因子的濃度也升高，從而引起巨噬細胞和中性粒細胞等免疫細胞向胰腺組織聚集，加重炎癥和繼發感染。但是對于巨噬細胞在SAP合并繼發性感染過程中發揮所用的研究甚少[6-7]。因此，本研究擬探討外周血中的巨噬細胞的免疫狀態及與SAP繼發感染的關系，為今后通過調整機體免疫狀態來治療SAP及其繼發感染提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集中日友好醫院2003年1月-2015年8月住院的SAP患者132例，男73例，女59例，年齡42～78歲，平均年齡63歲。所有SAP患者分為2組：感染組和未感染組。其中感染組68例，男38例，女30例，年齡(62.8±11.2)歲；未感染組64例，男38例，女26例，年齡(59.2±9.3)歲。感染組及未感染組年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)。同時，選同期我院體檢中心體檢的健康志愿者45名，男28名，女17名，年齡43～78歲，年齡(61.0±9.8)歲，經體檢后未發現胰腺和心肺功能異常。三組患者性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準所有患者符合2014年中華醫學會外科學分會胰腺外科學組《重癥急性胰腺炎診治指南》的診斷標準，均排除嚴重心腦血管疾病、肝腎功能不全、免疫系統疾病、血液系統疾病等嚴重疾病。感染組患者符合以下繼發感染的判斷標準[1]：患者體溫≥38 ℃且白細胞計數≥20×109個/L，行增強CT檢查 或在B 超引導下行細針穿刺術，判斷胰腺壞死范圍及胰外滲出液是否已有感染。如合并下述情況之一者均可判定為壞死感染：(1)腹膜刺激征范圍≥2個象限；(2)CT 檢查于胰腺內發現氣泡征；(3)細針穿刺術抽吸物涂片找到細菌[2]。

1.3 試劑和方法淋巴細胞分離液，購自北京索萊寶科技有限公司。流式抗體: anti-F4/80(pEcy5.5)、anti-CD11b(FITC)、anti-MHC-Ⅱ(PE)、anti-CD86(APC)均購自eBioscience公司。ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.4 外周血單個核細胞(PBMC)的分離抽取各組受試者外周血10 ml左右，無菌條件下加入肝素鈉抗凝，混勻后加入等量的PBS稀釋，Ficoll密度梯度離心法分離PBMC：將稀釋后的外周血沿管壁輕輕疊加于等體積的分離液上，使之界線清晰；配平后2 400 r/min離心25 min；離心后，小心取出分離管，可見管內液體分成清晰的4層，暗紅色血漿下存在白色云霧狀的淋巴細胞層；用平口吸管洗去白色云霧狀細胞層，置于含PBS的離心管中，離心后沉淀即為PBMC。

1.5 流式細胞術檢測細胞表面標志和產生細胞因子水平將新鮮分離得到的PBMC加入到流式管中，分組標記F4/80、CD11b、MHC-Ⅱ、CD86等抗體，輕輕振蕩混勻后4 ℃避光孵育1 h。細胞因子的胞內染色需在完成上述步驟標記表面標記后，加PBS洗去未結合的抗體，用1%多聚甲醛懸起沉淀，4 ℃避光孵育30 min。PBS沖洗后，用0.01%皂素溶液懸起沉淀，4 ℃避光孵育30 min。標記抗細胞因子抗體，4 ℃避光孵育2 h。PBS沖洗2～3次后，上機檢測。

1.6 ELISA檢測細胞因子的變化抽取各組受試者空腹靜脈血3 ml，靜置30 min 后，離心1 000 r/min(離心半徑為15 min)后取上層血清，置于-80 ℃ 冰箱保存，待測各項指標。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-4(IL-4)和白介素-10(IL-10)等的濃度采用酶聯免疫吸附實驗測定，嚴格按照說明書操作進行檢測，具體如下：測試前將試劑盒從冰箱中拿出，平衡至室溫；取出板條，每孔加入100 μl Assay Dliuent RD1W；每孔加入100 μl標準品、樣品和對照，密封后室溫孵育2 h；加入洗滌液充分洗滌；每孔加入200 μl Conjugate，密封后室溫孵育2 h；洗板；每孔加入200 μl Substrate Solution，室溫避光孵育20 min；每孔加入50 μl Stop Solution, 輕輕敲勻后使用酶標儀在450 nm測定每孔的吸光度。

1.7 統計學處理所有數據使用軟件GraphPad Prism 5進行圖表的繪制和統計分析，采用方差分析檢驗各組均數間差異，不同組別間的比較用F檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清中促炎因子水平比較與健康對照組比較，未感染組和感染組血清中的各種促炎因子水平均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)；感染組均高于未感染組，差異具有統計學意義(P<0.05，見表1)。

TNF-αIL-6IL-1β健康對照組14.26±1.5013.17±2.3119.00±2.07未感染組52.96±3.78△67.16±3.70△62.95±4.18△感染組81.68±5.56△*118.50±7.99△*139.60±14.00△*

注：與健康對照組比較，△P<0.05;與未感染組比較，*P<0.05。

2.2 PBMC中巨噬細胞比例和絕對數的變化與健康對照組比較，感染組和未感染組巨噬細胞的比例和絕對數量均明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；且感染組高于未感染組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

巨噬細胞比例(%)數量(×106個/L)健康對照組5.43±0.231.08±0.046未感染組11.96±0.19△4.78±0.079△感染組19.61±0.26△*13.72±0.180△*

注：與健康對照組比較，△P<0.05;與未感染組比較，*P<0.05。

2.3 巨噬細胞的活化狀態和產生促炎因子水平的比較感染組和未感染組巨噬細胞的活化和產生細胞因子的水平較健康對照組均有明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)；感染組的各項指標均高于未感染組，差異具有統計學意義(P<0.05，見表3)。

3 討論

SAP屬于急性胰腺炎的特殊類型，是一種病情險惡、并發癥多、病死率較高的急腹癥。約有20%的患者死于繼發感染引起的胰腺壞死、膿腫或系統性多器官功能衰竭[8]。根據機體的免疫狀態，通常胰腺炎被劃分為3個類型：系統性免疫反應(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)、補償性抗炎反應(compensatory anti-inflammatory response syndrome, CARS)和混合型抗炎反應(mixed anti-inflammatory response syndrome, MARS)。鑒于免疫系統在不同病程發揮的重要作用，免疫調節的治療方法逐漸受到各國專家的重視[1]。

MHC-ⅡCD86TNF-α+IL-1β+健康對照組44.60±3.0134.20±3.8342.10±3.3933.10±3.92未感染組77.80±2.19△70.50±4.46△74.20±3.76△61.20±4.94△感染組85.40±2.03△*89.40±1.52△*91.80±1.14△*79.80±4.14△*

注：與健康對照組比較，△P<0.05;與未感染組比較，*P<0.05。

SAP起始于細胞內胰腺酶原和核轉錄因子-κB信號通路的激活，繼而活化的細胞因子浸潤胰腺組織，該步驟決定了胰腺炎的嚴重程度。初始階段的炎癥反應通過釋放大量趨化因子和黏附分子將大量巨噬細胞募集到炎癥部位而導致炎癥放大，引起系統性大量炎癥介質的產生，從而導致早期的器官損傷[9]。本研究也得到類似的結果，與健康對照組比較，感染組和未感染組患者的血清TNF-α、IL-1β和IL-6的水平均明顯升高，且感染組高于未感染組，提示胰腺炎患者的免疫系統處于活化狀態，并發繼發性感染患者免疫系統得到了進一步的激活。

有資料顯示，機體在產生大量促炎因子的同時，還會產生多種相關黏附分子，導致單核巨噬細胞向胰腺或其他炎癥部位趨化。單核巨噬細胞在炎癥性疾病的病理過程中發揮關鍵的促炎作用，巨噬細胞的活化水平可能是胰腺炎嚴重程度的重要決定因素之一。浸潤后的巨噬細胞能產生諸如TNF-α、IL-1β、IL-6和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等多種促炎因子，致炎的同時趨化更多的單核巨噬細胞和中性粒細胞到炎癥部位[10]。除此之外，活化的巨噬細胞還可以促進T、B淋巴細胞的活化，激活機體的獲得性免疫。因此，本研究中我們檢測了受試者PBMC中巨噬細胞的數量和活化狀態。結果證明，與健康對照組相比，感染組和未感染組的患者PBMC中存在更多的活化巨噬細胞，這些細胞共刺激分子MHC-Ⅱ和CD86的表達水平和促炎因子TNF-α、IL-1β的分泌水平更高；且感染組的各項指標高于未感染組，說明SAP繼發感染患者體內的巨噬細胞處于更高的活化狀態，提示SAP繼發感染的發生與機體內巨噬細胞的活化密切相關。

綜上所述，本研究證實了SAP患者發生繼發感染早期，外周血中存在大量促炎因子，體內的巨噬細胞處于高度活化狀態。在胰腺炎后期，機體的免疫系統處于抑制狀態[11-12]，所以今后還需進一步研究巨噬細胞及其不同亞型在繼發性感染的整個病理學過程中免疫系統的動態變化機制，為將免疫調節作為臨床治療SAP的重要手段建立良好的理論基礎。

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(責任編輯：李 健)

The mechanism of macrophages in prognosis of severe acute pancreatitis with secondary infection

ZHANG Minggang1, DUAN Jun2, TAO Yongkang3, YANG Huayuan1, DU Shiyu1

1.Department of Gastroenterology; 2.Intensive Care Unit; 3.Department of Emergency, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

Objective To investigate the relationship between macrophages activation state in the blood and secondary infection from severe acute pancreatitis (SAP). Methods One hundred and thirty-two patients with SAP were divided into infection group and uninfection group, compared with healthy control group. Serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β) were determined by ELISA. The frequency and activation of macrophages in the blood and the production of cytokines such as TNF-α, IL-6 and IL-1β were detected by FCM. Results Compared with healthy control group, the inflammatory indicators, such as density of TNF-α, IL-6, IL-1β in the serum and the number, ratio of macrophages were increased in infection group and uninfection group. The activation of macrophages which was represented as expression of MHC-Ⅱ, CD86, ratio of TNF-α+cells and IL-1β+were also increased sequentially (P<0.05). Conclusion The pathogenesis of SAP and secondary infection are closely related to the activation of macrophages. Macrophages emerges an enhanced activation after secondary infection.

Severe acute pancreatitis; Macrophages; Secondary infection; Innate immunity

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.02.025

張明剛，副主任醫師，研究方向：消化疾病內科及內鏡診治。E-mail：13621159166@163.com

杜時雨，博士，主任醫師。研究方向：胰膽疾病的內科治療及相關內鏡診斷與治療。E-mail：dushiyu1975@126.com

R576

A 文章編號：1006-5709(2017)02-0207-03

2016-04-11