香煙煙霧染毒對雄性大鼠睪丸組織一氧化氮水平的影響*

張 靜,鄧 晟,仲春雪,黃云飛,張 晨△,何麗娟,鄒 瑩

(1.新疆醫科大學公共衛生學院毒理學教研室,烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心，烏魯木齊 830001)

香煙煙霧染毒對雄性大鼠睪丸組織一氧化氮水平的影響*

張 靜1,鄧 晟2,仲春雪1,黃云飛1,張 晨1△,何麗娟1,鄒 瑩1

(1.新疆醫科大學公共衛生學院毒理學教研室,烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心，烏魯木齊 830001)

目的 探討香煙煙霧染毒對大鼠睪丸組織結構及睪丸組織一氧化氮(NO)水平的影響。方法 清潔級成年雄性SD大鼠160只，分為對照組和低、中、高劑量染毒組，各組大鼠分別染毒2、4、6、8、12周，每組10只。染毒組采用呼吸道靜式染毒，每天1次，每次0.5 h。觀察大鼠睪丸組織結構，檢測各組大鼠體質量及睪丸組織NO水平。結果 染毒4、6、8、12周時，中、高劑量染毒組大鼠體質量與對照組和低劑量組相比均明顯降低(P<0.05)，染毒8、12周時，高劑量染毒組大鼠體質量與中劑量組相比明顯降低(P<0.05)，并且隨著染毒劑量的增加，降低更加明顯。染毒2、4、6、8周時，高劑量組大鼠睪丸組織NO水平與對照組和低、中劑量組相比均明顯升高(P<0.05)；染毒8周時，中劑量組大鼠睪丸組織NO水平與對照組相比明顯升高(P<0.05)；染毒12周時，低、中、高劑量組大鼠睪丸組織NO水平與對照組相比均明顯升高 (P<0.05) ，中、高劑量組大鼠睪丸組織NO水平與低劑量組相比明顯升高 (P<0.05)。結論 香煙煙霧染毒可致雄性大鼠睪丸組織NO水平升高，導致雄性大鼠睪丸組織損傷。

睪丸；煙草；煙霧；毒物；雄性大鼠；一氧化氮

男性生殖健康問題是影響家庭和諧和社會穩定的重要醫學問題。目前，男性精液質量下降造成的不育問題已經引起了全世界的關注。香煙煙霧中含有多種致癌物質和細胞誘變劑，可能對男性生育產生不利影響[1]。WHO指出，煙草危害是現今全球最嚴峻的公共衛生問題之一[2]。據統計，全球15歲以上人群中吸煙者占22%，每年約有600萬人死于吸煙相關疾病，與吸煙相關的死亡已占全世界死因構成第1位[3]。有一些學者報道吸煙會對雄性生殖產生不利影響[4-7]，但至今毒性機理尚不明確。本研究建立大鼠吸煙模型，觀察香煙煙霧暴露對大鼠睪丸組織的損害特點，檢測香煙煙霧暴露對大鼠睪丸組織中一氧化氮(NO)水平的影響，為探討香煙煙霧暴露對雄性生殖毒性的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：清潔級成年雄性SD大鼠160只，由新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心提供，動物許可證號為SCXK(新)2011-0001，大鼠體質量為180～220 g。(2)受試物：新疆卷煙廠生產的某品牌過濾嘴香煙，煙氣煙堿量每支1.2 mg，焦油量每支12.0 mg。(3)主要試劑：NO檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 實驗動物分為對照組和及低(10根)、中(20根)、高(30根)染毒劑量組，各組大鼠分別染毒2、4、6、8、12周，每組10只。染毒組大鼠置于自制染毒箱內(80 cm×60 cm×80 cm)，采用呼吸道靜式染毒，香煙煙霧由真空泵抽入，1次/天， 0.5小時/次。對照組大鼠每天相同時間放置于染毒箱內，但未進行染毒。

1.2.2 標本采集 實驗結束后各組大鼠腹腔注射水合氯醛(按每100 g體質量0.3 mL計算)麻醉，迅速摘取睪丸和附睪，放入4 ℃生理鹽水中漂洗，濾紙吸干水分后，用電子天平稱其濕質量，右側睪丸制備組織勻漿，左側睪丸4%多聚甲醛固定，制作病理切片。

1.2.3 睪丸組織勻漿制備 稱取適量睪丸組織，按質量∶體積=1∶9的比例加入生理鹽水，機械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液，即為10%濃度睪丸組織勻漿；取生理鹽水10倍稀釋該組織勻漿，得1%濃度睪丸組織勻漿。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 考馬斯亮藍法測定睪丸組織勻漿中蛋白水平 取1%濃度睪丸組織勻漿按說明書步驟加樣，吹打混勻，靜置10 min，于波長595 nm處，測定各管樣品吸光度值。按公式計算各樣品蛋白濃度。

1.2.4.2 NO水平測定 取10%濃度睪丸組織勻漿，按說明書操作步驟加樣，吹打混勻，室溫靜置10 min后在波長550 nm處，測定各管樣品吸光度值，按公式計算各樣品NO水平。

2 結 果

2.1 一般情況觀察 對照組大鼠被毛潔凈有光澤，活動敏捷，精神狀態良好，飲水、飲食正常，試驗期內體質量增加明顯。染毒組大鼠被毛無光澤，倦怠懶動，行動活躍度降低，出現不同程度飲水、飲食量減少，體質量增長緩慢。其中高劑量染毒組大鼠在染毒后期進食差，體質量減輕，行動遲緩，精神萎靡。

2.2 大鼠體質量變化 染毒2周時，各劑量組大鼠體質量與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；染毒4、6、8、12周時，低劑量染毒組大鼠體質量與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，中、高劑量染毒組大鼠體質量與對照組和低劑量組相比均明顯降低(P<0.05)；染毒8、12周時，高劑量染毒組大鼠體質量與中劑量組相比明顯降低(P<0.05)，并且隨著染毒劑量的增加，體質量降低更加明顯，見表1。

2.3 睪丸及附睪重量、臟器系數比較 與對照組比較，各染毒組大鼠睪丸及附睪重量、臟器系數比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.4 大鼠睪丸組織病理變化 對照組大鼠睪丸精曲小管形態規則，生精上皮基膜完好無缺，各級生精細胞緊密排列，曲細精管管腔內還可見大量精子；染毒組大鼠生精小管和間質組織均可見明顯的變性改變，界膜局部剝脫，曲細精管內生精細胞層數明顯減少，細胞排列紊亂，各級生精細胞、精子數量降低，甚至未觀察到游離精子。隨著染毒劑量的增加和染毒時間的延長，大鼠睪丸組織損傷加重，見圖1。

2.5 大鼠睪丸組織NO水平比較 隨著染毒劑量和染毒時間的增加，大鼠睪丸組織NO水平逐漸升高。方差分析結果顯示：染毒2～12周時，各劑量組大鼠睪丸組織NO水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)；進一步兩兩比較顯示：染毒2、4、6、8周時，高劑量組大鼠睪丸組織NO水平與對照組和低、中劑量組比較均明顯升高(P<0.05)；染毒8周時，中劑量組大鼠睪丸組織NO水平與對照組比較明顯升高(P<0.05)；染毒12周時，低、中、高劑量組大鼠睪丸組織NO水平與對照組比較均明顯升高 (P<0.05) ，中、高劑量組大鼠睪丸組織NO水平與低劑量組比較明顯升高 (P<0.05)，見表3。

表1 各組大鼠不同時間體質量比較

a：P<0.05，與對照組比較;b：P<0.05，與低劑量組比較;c：P<0.05，與中劑量組比較。

表2 各組大鼠睪丸及附睪重量、臟器系數比較

續表2 各組大鼠睪丸及附睪重量、臟器系數比較

A：對照組；B：2周低劑量組；C：2周中劑量組；D：2周高劑量組；E：4周低劑量組；F：4周中劑量組；G：4周高劑量組；H：6周低劑量組；I：6周中劑量組；J：6周高劑量組；K：8周低劑量組；L：8周中劑量組；M：8周高劑量組；N：12周低劑量組；O：12周中劑量組；P：12周高劑量組。

圖1 各組大鼠睪丸組織病理圖片(×400)

a：P<0.05，與對照組比較;b：P<0.05，與低劑量組比較;c：P<0.05，與中劑量組比較。

3 討 論

吸煙是與人類生活環境最密切相關的行為之一，并給全世界公共衛生領域帶來巨大的財政和醫療負擔[8]。吸煙對人體健康的危害是眾所周知的，吸煙也被認為是男性不育的高危因素之一[9]。長期吸煙對男性生殖系統的負面影響已在臨床研究中得到證實[10]。

本研究觀察發現，染毒組大鼠體質量增長較對照組減緩。各組大鼠睪丸、附睪重量及臟器系數差異無統計學意義，推測其原因可能是由于低劑量組大鼠染毒劑量較小，而尼古丁(香煙中主要有害物質)代謝較快，尚未能引起實驗大鼠體質量、睪丸臟器系數及附睪臟器系數的改變。此外，中、高劑量染毒組，尤其是高劑量組大鼠染毒后期，體質量增長緩慢，甚至出現負增長，也可能是染毒組大鼠睪丸、附睪臟器系數未出現顯著變化的原因之一。

NO在哺乳動物生殖系統中廣泛存在，不僅與精子發生、成熟密切相關，還可調節雄激素分泌[11]。NO具有雙重調節作用，低濃度NO可以通過捕捉氧自由基等作用使膜脂質過氧化減少，從而幫助精子免于氧自由基的損害，保障精子發生及睪酮分泌[12]；高濃度NO則會損傷脂膜，引起組織損害，也可通過cGMP作用影響精子發生及睪酮分泌[13]。Nobunaga等[14]報道生育組精漿中NO水平顯著低于不育組，而精子活力顯著高于不育組，提示高濃度NO可致精子活力降低。林霖等[15]研究發現鉬染毒組小鼠睪丸NO水平升高，且呈劑量-反應關系，隨著染毒劑量的增加，睪丸組織損傷加重。喬彥等[16]報道尼古丁染毒組小鼠睪丸組織中NO水平顯著升高，睪酮水平顯著下降，誘導型NOS蛋白表達增加，精子活力降低。本研究顯示，隨著香煙煙霧染毒劑量的增加和染毒時間的延長，大鼠睪丸組織中NO水平逐漸升高，睪丸組織損傷加重。這與前述研究[14-16]結果相似。本課題組前期研究結果發現，吸煙可造成雄性小鼠睪丸組織勻漿中NOS水平升高，而NOS能催化L-精氨酸分解成胍氨酸產生NO，使小鼠睪丸組織中NO水平升高[17]。這也與本研究結果相吻合。

綜上所述，在本實驗條件下，香煙煙霧染毒可致雄性大鼠睪丸組織NO水平升高，并導致雄性大鼠睪丸組織損傷。

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The effect of cigarette smoke exposure on nitric oxide level in testis of male rats*

ZhangJing1,DengSheng2,ZhongChunxue1,HuangYunfei1,ZhangChen1△,HeLijuan1,ZouYing1

(1.DepartmentofToxicology,CollegeofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi,theXinjiangUygurAutonomousRegion830011,China；2.XinjiangCenterforDiseaseControlandPrevention,Urumqi,theXinjiangUygurAutonomousRegion830001,China)

Objective To explore the effect of cigarette smoke exposure on testis structure and nitric oxide (NO) level in testis of rats.Methods A total of 160 adult male SD rats were divided into control group and low,medium,high dose groups.The smoke-exposed rats were respectively exposed to the smog for the periods of 2,4,6,8 and 12 weeks,10 rats in each group.The smoke-exposed rats were exposed to cigarette smoke for 0.5 h per day.The testicular tissue structure was observed and the body mass and the NO level of testis were measured.Results Compared with the control group and low dose group,the body mass of the rats was significantly lower in the medium and high dose groups exposed for 4,6,8,12 weeks (P<0.05).Compared with the medium dose groups,the body mass of the rats was significantly lower in the high dose group exposed for 8 weeks and 12 weeks (P<0.05).And with the increase of exposure dose,the reducing was even more obvious.Compared with the control group and low and medium dose groups,NO level in testis of rats was significantly increased in the high dose groups exposed for 2,4,6,8 weeks (P<0.05).Compared with the control group,NO level in testis of rats was significantly increased in the medium dose groups exposed for 8 weeks (P<0.05).Compared with the control group,NO level in testis of rats was significantly increased in the low,medium and high dose groups exposed for 12 weeks (P<0.05);and compared with the low dose group,NO level in testis of rats was significantly increased in the medium and high dose groups(P<0.05).Conclusion Cigarette smoke exposure may have impacts on testis tissue and lead to the increase of NO level in testis of male rats.

testis;tobacco;smog;poisons;male rats;nitric oxide

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.005

國家自然科學基金資助項目(81260433)；新疆維吾爾自治區自然科學基金項目(2014211C015)。 作者簡介：張靜(1979-)，副教授，博士，主要從事生殖發育毒理方面研究?！?/p>

，E-mail:zhangchendr@163.com。

R114

A

1671-8348(2017)14-1885-04

2016-11-18

2017-01-06)