納豆芽孢桿菌固態發酵小米糠產抗氧化肽工藝優化

韋 濤，周啟靜，陸兆新，呂鳳霞，別小妹，張 充，趙海珍

納豆芽孢桿菌固態發酵小米糠產抗氧化肽工藝優化

韋 濤，周啟靜，陸兆新，呂鳳霞，別小妹，張 充，趙海珍*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

為提高小米糠蛋白資源的利用率，為小 米糠的深加工提供參考，采用納豆芽孢桿菌對小米糠進行固態發酵以獲得小米糠抗氧化肽。在單因素試驗的基礎上以小米糠發酵后水提液的總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）為指標，使用Plackett-Burman試驗對發酵條件進行篩選，然后使用響應面法對發酵條件進行優化，并測定優化后小米糠水提液的多肽含量和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力。結果顯示最適發酵條件為：小米糠平均粒徑0.22 mm（60～80 目）、菌液接種量0.4 mL（約108CFU/mL）、初始pH 6.7、發酵時間26 h、發酵溫度35 ℃。此條件下小米糠固態發酵后提取液的T-AOC實際值為（344.51±8.02）U/g小米糠，多肽提取量為（68.37±0.92）mg/g小米糠，清除DPPH自由基IC50為0.12 mg/mL。該研究表明，小米糠固態發酵條件經過優化后能夠獲得具有較高抗氧化能力的生物活性肽。

小米糠是小米加工過程中的副產物，由谷殼、種皮、糊粉層和胚芽組成。我國有豐富的小米糠資源，據農業部統計，2012年全國小米的種植面積約140萬 hm2，小米糠年產量約為40萬 t。小米糠中蛋白質含量為13%左右，且小米糠蛋白質具有低過敏性和必需氨基酸種類多等特點，是一種營養價值較高的蛋白質[1]。

近年來，對大米糠的研究逐漸增多，但對小米糠的基礎研究還處于起步階段，主要集中在小米糠油脂[2-3]、膳食纖維[4]、植酸[5]、蛋白[6-7]和多肽[8-9]等方面，其中小米糠多肽的制備大多為酶法制備，對于固態發酵法制備小米糠多肽還十分罕見。固態發酵法是指利用自然底物做碳源及能源，在沒有或基本沒有游離水的固態基質上的發酵方式。此法具有占用空間小、用水量少、能耗低和不易染雜菌等優點[10]。目前，固態發酵法已成為生物活性肽制備的常用方法，如Coda[11]、He Rong[12]、彭惠惠[13]、Amadou[14]、Wu Wanxing[15]等分別通過固態發酵谷物粉、菜籽粕、芝麻粕、小米粉和核桃粕等得到了具有抗氧化能力的多肽。大量文獻[16-19]報道，大米糠生物活性肽具有較佳的抗氧化能力，主要表現在還原能力和自由基清除能力等方面。根據郭利娜等[8]研究發現，小米糠生物活性肽也具有較佳的抗氧化能力。鑒于固態發酵法的優點，將固態發酵法應用于小米糠抗氧化肽的制備，對提高小米糠蛋白資源的利用率十分有意義。

固態發酵培養基中添加一定的營養物質可以給菌體提供一個合適的生長環境，促進次級代謝產物的合成[10]。周建新等[20]研究了培養基組成對黑曲霉固態發酵陳化秈稻谷生產檸檬酸過程的影響，發現在培養基中添加適量麩皮、碳酸鈣和硝酸銨有助于檸檬酸的產生。本實驗所用固態發酵培養基中的組成成分均為預實驗所得最佳添加量，有利于提高小米糠提取液的抗氧化能力。除培養基組成外，在固態發酵過程中，還存在很多其他影響因素，其中pH值和發酵時間對發酵過程中微生物的生長和酶的活力具有顯著影響[21]。Schmidt等[22]研究了米糠平均粒徑和硫酸銨添加量對米糠固態發酵的影響，米糠平均粒徑為0.18 mm，鹽溶液中硫酸銨質量濃度為8 g/L時，與沒有發酵的米糠相比，蛋白和酚類物質的含量分別提高了53%和65%。Wu Wanxing等[15]研究發現發酵時間和接種量對核桃粕的固態發酵產抗氧化肽具有顯著影響，且兩因素之間交互作用非常顯著（P＜0.01）。

本研究擬以納豆芽孢桿菌NattoD-3為發酵菌株，利用廉價且營養豐富的小米糠作為基本基質進行固態發酵，重點考察菌液接種量、發酵時間、發酵溫度、初始pH值和發酵基質粒徑5 個因素對發酵后小米糠水提液的總抗氧化能力的影響規律。在單因素試驗的基礎上，以總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）為評價指標，設計了Plackett-Burman試驗和響應面試驗對固態發酵條件進行優化，并測定優化后多肽提取量和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力。提高小米糠蛋白資源的利用率，為小米糠深加工、保健食品或天然抗氧化劑的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆芽孢桿菌NattoD-3，由南京農業大學食品科技學院酶工程實驗室保存；新鮮米糠購于山西省，正己烷脫脂處理，－18 ℃保存；DPPH 美國Sigma公司；T-AOC測定試劑盒 南京建成生物技術公司；福林-酚試劑和培養基均為分析純由國藥集團提供。

1.2 儀器與設備

AY120電子天平、UV-2450紫外-可見分光光度計日本Shimadzu公司；SX-700高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DRP-9162型電熱恒溫培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SB-5200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基、菌種活化和抗氧化肽粗提液的制備

NA培養基：牛肉浸膏3.00 g/L、魚粉蛋白胨10.00 g/L、NaCl 5.00 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

固態發酵培養基：脫脂小米糠5.0 0 g、NH2CONH20.10 g、K2HPO4·3H2O 0.02 g、蒸餾水6.00 mL，自然pH值。115 ℃滅菌30 min。

將安瓿管中菌種接入裝有100 mL NA培養 基的錐形瓶中，八層紗布封口，置于空氣搖床中擴大培養，37 ℃、180 r/min培養20 h，使菌種活化。將在NA培養基中活化好的菌懸液接入已滅菌固態發酵培養基中，混合均勻，放入37 ℃電熱恒溫培養箱，每 隔12 h搖晃錐形瓶通氣，培養24 h后，將小米糠轉移至培養皿，放入60 ℃電熱鼓風干燥箱烘干至質量恒定，冷卻至室溫，精確稱取烘干后小米糠1.000 g置于25 mL試管中，加入10 mL蒸餾水，于30 ℃超聲波清洗儀中超聲提取30 min，然后轉移上清液至離心管中10 000×g離心10 min，取上清液，通過0.45 μm濾膜，即得到抗氧化肽粗提液，待測，各實驗重復3 次。

1.3.2 小米糠固態發酵條件的單因素試驗

分別研究接種量（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL）（約108CFU/mL）、初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）、發酵溫度（25、28、30、34、37、40 ℃）、發酵時間（0、12、24、36、48、60、72 h）、平均粒徑（0.17、0.22、0.34、0.64、1.43 mm）對小米糠固態發酵的影響。根據小米糠抗氧化肽粗提液的T-AOC確定較佳的發酵條件。各實驗重復3 次，取平均值。

1.3.3 Plackett-Burman試驗設計

使用Design-Expert v8.0.6軟件設計N12的Plackett-Burman試驗。以T-AOC為評價指標，對影響發酵的5 個因素進行篩選，即接種量（X1）、初始pH值（X3）、發酵溫度（X5）、發酵時間（X7）、平均粒徑（X9），另外添加6 個虛擬因素（X2、X4、X6、X8、X10、X11），每個因素分別設有高水平和低水平兩個水平，分別用1、－1表示，高水平為單因素試驗的最佳值，且高水平約為低水平的1.33 倍。試驗設計因素與水平見表1。

表 1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Coded and actural values of independent variables used in Plackett-Burman design

1.3.4 響應面優化試驗設計

根據Box-Behnken設計原理，綜合單因素試驗和Plackett-Burman試驗的結果，以T-AOC為響應值，選取對固態發酵產抗氧化物影響較為顯著的初始pH值、發酵溫度和發酵時間3 個因素設計三因素三水平的Box-Behnken響應面試驗，分別以1、0、－1代表自變量的高、中、低3 個水平，對自變量進行編碼。響應面分析試驗共17 個試驗點，其中析因部分試驗次數為12 次，中心點重復試驗5 次。固定其他條件：培養基中小米糠5.00 g（平均粒徑0.22 mm）、NH2CONH20.10 g、K2HPO4·3H2O 0.02 g、蒸餾水6.00 mL、菌液接種量0.4 mL。

1.3.5 多肽含量測定

取3 mL樣品溶液，加入3 mL 10 g/100 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，混合均勻，室溫靜置30 min，10 000×g離心10 min，取上清液備用。根據池寧娟等[23]報道的福林-酚法測定，取上清液1 mL，加入1 mL堿性銅溶液和4 mL福林-酚試劑，混合均勻后，于55 ℃水浴5 min，取出冷水浴10 min，然后測定650 nm波長處吸光度。各實驗重復3 次，取平均值。

精確配制0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL和0.5 mg/mL的牛血清白蛋白標準品溶液，按照福林-酚法測定反應后的吸光度。以牛血清白蛋白標準品的質量濃度為橫坐標，650 nm波長處的吸光度為縱坐標，以0 mg/mL樣品反應液調零，制作標準曲線，獲得回歸方程y=0.620 6x－0.003 9（R2=0.994 8）。

1.3.6 抗氧化活力測定

1.3.6.1 T-AOC測定

根據T-AOC試劑盒的方法測定。抗氧化物質能將Fe3+還原為Fe2+，而Fe2+能與菲啉類物質形成穩固的絡合物，在520 nm波長處通過比色測出其抗氧化能力的高低。定義37 ℃為每分鐘每毫升抗氧化物質使反應體系的吸光度（A）每增加0.01時，為一個總抗氧化活性單位（U）。各實驗重復3 次，取平均值。計算公式（1）如下：

式中：A1為樣品吸光度；A0為對照吸光度；V1為反應液總體積，3.7 mL；V0為取樣量，0.1 mL；m為稀釋倍數，本實驗中為10，表示每克小米糠加入10 mL蒸餾水提取。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力的測定

根據Torres-Fuentes等[24]的方法稍作修改測定，取樣品溶液2 mL，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液，混合搖勻，室溫避光反應30 min。用紫外分光光度計在517 nm波長處測定吸光度。各實驗重復3 次，取平均值。樣品對DPPH自由基清除能力計算公式（2）如下：

式中：Aa為樣品吸光度；Ab為空白組（用等量的95%乙醇溶液代替DPPH溶液）吸光度；Ac為對照組（用等量的95%乙醇溶液代替樣品）吸光度。

IC50表示DPPH自由基清除率為50%時抗氧化肽的質量濃度（mg/mL）。調整發酵液中小米糠多肽為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL和0.6 mg/mL，分別測定其DPPH自由基清除率，通過Microsoft Excel 2007軟件擬合得到小米糠抗氧化肽質量濃度和DPPH清除率關系的多項式，即可求得IC50值。

1.4 數據處理

全部數據采用Microsoft Excel 2007軟件進行統計，計算平均值和標準差，單因素試驗中Duncans多重差異顯著性分析使用SPSS Statistics 17.0軟件，作圖使用OriginPro 8.5軟件，Plackett-Burman試驗設計和響應面優化試驗設計、分析及作圖使用Design-Expert v8.0.6軟件。

2 結果與分析

2.1 小米糠固態發酵條件的單因素試驗結果

2.1.1 接種量對T-AOC的影響

圖 1 接種量對T-AOC的影響Fig. 1 Effect of inoculum size on T-AOC

自然pH值、發酵溫度37 ℃、發酵時間24 h條件下測定接種量的影響，從圖1可知，發酵后的小米糠提取液T-AOC顯著高于未發酵（接種量為0 mL）的小米糠提取液（P＜0.05）。隨著接種量的增加，T-AOC呈現出先增加，后降低的趨勢，接種量為0.4 mL時，T-AOC最大為（227.90±11.30）U/g小米糠。接種量的大小對發酵產物的生產效率具有顯著影響，接種量過大會導致供氧不足，影響產物合成；過小會延長培養時間，降低發酵的生產率。本研究中由于發酵時間較短，接種量小于

0.4 mL時，菌體數量較少，分泌的蛋白酶不足，對小米糠基質中蛋白質的分解不充分，產生的抗氧化肽較少，接種量大于0.4 mL時，隨著接種量的增加，抗氧化能力逐漸降低，可能是因為菌濃度過大，供氧不足，產酶量減少，故在本研究發酵時間較短的條件下，選擇接種量為0.4 mL比較合理。武萬興等[25]研究接種量對核桃粕固態發酵產抗氧化肽的影響時，發現隨著接種量的增高，多肽提取量先增加后降低，接種量為5.5%時有最大值，與本研究變化趨勢一致。

2.1.2 初始pH值對T-AOC的影響

圖 2 初始pH值對T-AOC的影響Fig. 2 Effect of initial pH on T-AOC

pH值主要通過影響菌體膜滲透性以及物質離子化程度，以至 于影響納豆芽孢桿菌對養分的吸收和蛋白酶的產生[26]。調節菌液接種量0.4 mL，其他條件同2.1.1節，發酵后測定T-AOC。從圖2可知，隨著鹽溶液pH值的逐漸升高，T-AOC呈現出先增加后降低的趨勢，pH 7.0時最大，此時，T-AOC為（230.37±20.5）U/g小米糠。發酵培養基的自然pH值約為9左右，而納豆芽孢桿菌的最適生長pH值為7.0左右，強酸強堿條件都不利于菌體的生長和代謝，影響酶的合成，從而影 響產物的抗氧化能力。本研究結果與祁紅兵等[26]以用納豆芽孢桿菌固態發酵麩皮產抗氧化物類似，最適初始pH值均為7.0。

2.1.3 發酵溫度對T-AOC的影響

圖 3 發酵溫度對T-AOC的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on T-AOC

溫度對納豆芽孢桿菌的生長代謝產生顯著影響，在適宜的發酵溫度條件下，微生物生長代謝活躍，產酶量高，從而有利于抗氧化肽的產生。調節初始pH 7.0，其他條件同2.1.2節，發酵后測定T-AOC。從圖3可知，隨著發酵溫度的逐漸升高，T-AOC呈先增加后下降的趨勢，34 ℃時最高，此時T-AOC為（228.58±16.79）U/g小米糠，34 ℃為較佳發酵溫度。根據納豆芽孢桿菌的生長特性可知，納豆芽孢桿菌的最適生長溫度為37 ℃左右。但有研究顯示菌體的最適生長溫度與最適發酵溫度不一定相同[10]。例如，Mahanama等[27]通過響應面法優化納豆芽孢桿菌固態發酵大豆粉后得到的最佳發酵溫度為35 ℃。溫度過低時，納豆芽孢桿菌生長和代謝均比較緩慢，短時間內分泌的蛋白酶少，導致抗氧化肽含量少，抗氧化能力低。隨著溫度的升高，菌體的生長代謝均逐漸增加，分泌的蛋白酶也逐漸增加，抗氧化肽含量也隨之增多，抗氧化能力上升。但溫度過高時，并不利于菌體的生長代謝，反而導致菌體衰老快，發酵產物抗氧化能力降低。本研究發酵時間較短，34 ℃表現為納豆芽孢桿菌在短時間內生長與發酵產生抗氧化肽的最適溫度，與吳永沛等[28]報道的枯草芽孢桿菌固態發酵大豆粕產抗氧化肽的最適溫度33.7 ℃相似。

2.1.4 發酵時間對T-AOC的影響

圖 4 發酵時間對T-AOC的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on T-AOC

發酵時間的長短對納豆芽孢桿菌的數量影響十分顯著，進而影響小米糠蛋白的分解。設置發酵溫度為34 ℃，其他條件同2.1.3節，發酵后測定T-AOC。從圖4可知，隨著發酵時間的延長，T-AOC呈現先增加后降低的趨勢，發酵24 h時T-AOC最大為（239.68±9.25）U/g小米糠。發酵開始時，隨著發酵時間的延長，菌體數量逐漸增多，分泌的蛋白酶也逐漸增多，小米糠蛋白被分解為抗氧化肽，故抗氧化能力逐漸增強，發酵時間超過24 h后，抗氧化能力出現降低的趨勢，可能是由于菌體數量過多，產生的蛋白酶也逐漸增多，抗氧化肽被進一步的分解為更小的肽或氨基酸[8]。其變化趨勢與武萬興等[25]研究核桃粕固態發酵產抗氧化肽類似，但最佳發酵時間24 h比核桃粕發酵所用時間短，這可能是由于小米糠中蛋白質含量比核桃粕低導致。

2.1.5 平均粒徑對T-AOC的影響

固態發酵基質的粒徑對菌體發酵有顯著影響，用于固態發酵的小米糠粒徑需要控制在一個合適的范圍。為了優化固態發酵所使用小米糠的平均粒徑，通過使用10、20、40、60、80、100 目的篩網分別篩分出平均粒徑為0.17、0.22、0.34、0.64、1.43 mm的小米糠用于發酵，篩網的孔徑和小米糠的平均粒徑如表2所示。固態發酵的時間為24 h，其他條件同2.1.4節，發酵后測定T-AOC。

表 2 篩網的孔徑和小米糠的平均粒徑Table 2 Mesh size and corresponding average particle size of millet bran

圖 5 平均粒徑對T-AOC的影響Fig. 5 Effect of average particle diameter on T-AOC

從圖5可以看出，隨著平均粒徑的逐漸增加，T-AOC先增加后降低，平均粒徑為0.22 mm時最大，T-AOC為（313.68±11.45） U/g小米糠，即60～80 目篩網之間的顆粒度最適宜。小的粒徑可以提供一個相對大的表面積，有助于發酵過程中熱量傳遞與氣體的流通，也有利于菌體對小米糠中營養物質的充分利用，但粒徑過小，容易導致小米糠結團，不利于發酵過程中熱量傳遞與氣體的流通；粒徑過大，導致相對表面積偏小，不利于納豆芽孢桿菌對小米糠中營養物質的充分利用[10]。國外學者Asadi等[29]闡述了影響霉菌固態發酵產單細胞油脂中脂肪酸組成的因素，包括培養基和培養條件兩個方面，其中發酵基質粒徑就是影響因素之一。Schmidt等[22]的研究報道，米糠粒徑的大小對菌體的生長有顯著影響，發現平均粒徑為0.28 mm的米糠用于發酵時，得到的生物量較大。

2.2 Plackett-Burman試驗結果及方差分析

表 3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Plackett-Burman design with experimental results

表 4 Plackett-Burman設計試驗結果方差分析Table 4 Analysis of variance of the experiment results from Plackett-Burman design

Plackett-Burman試驗設計及結果見表3，方差分析見表4，方差分析表明模型極顯著（P＜0.01），發酵溫度、發酵時間、初始pH值和平均粒徑在95%水平對T-AOC影響顯著（P＜0.05），接種量不顯著（P＞0.05）。各因素對響應值影響的重要性依次為：發酵溫度＞發酵時間＞平均粒徑＞初始pH值＞接種量。結合實際生產，由于受篩網規格的限制，平均粒徑難以做到精確控制，故而選擇發酵溫度、發酵時間和初始pH值作為建立響應面模型考察的因素，小米糠的平均粒徑仍然控制為0.22 mm（60～80 目）。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗優化結果及回歸方程方差分析

Box-Behnken試驗結果見表5，采用Design-Expertv8.0.6軟件對試驗數據進行響應面分析，回歸方程的方差分析結果如表6所示。

表 5 響應面優化試驗Box-Behnken設計及結果Table 5 Box-Behnken design with experimental and predicted T-AOC values

表 6 回歸方程各項方差分析Table 6 Analysis of variance for the response surface quadratic model

將所有數據進行多元回歸擬合，得到X1（初始pH值）、X2（發酵溫度）、X3（發酵時間）與T-AOC之間二次多項式模型方程為：

由表3可知，擬合的二次多項模型極顯著（P=0.000 1），失擬項不顯著（P=0.085 2＞0.05），復相關系數R20.973 6，表明預測值和實測值之間具有很高的相關性；調整性決定系數0.939 6，表明有93.96%的總抗氧化能力變化能由此模型進行解釋，軟件建立的模型能較好反映發酵條件對發酵提取液總抗氧化能力的影響。并且可以看出，X、X、X、XX、和

12313對小米糠固態發酵后提取液的總抗氧化能力有極顯著的影響，有顯著影響。

2.3.2 響應面分析

圖 6 各因素對T-AOC影響的響應面圖Fig. 6 Response surface plots showing the effect of the independent variables on T-AOC

圖6 a為發酵時間處于零水平時，發酵溫度與初始pH值之間的交互作用圖，當初始pH值為較低水平時，隨著發酵溫度的升高，T-AOC先增加后降低，當發酵溫度處于較低水平時，隨著pH值的增高，T-AOC先增加后降低，初始pH 6.5～7.5、發酵溫度34～37 ℃時，T-AOC有最大值。圖6b為發酵溫度處于零水平時，發酵時間與初始pH值之間的交互作用圖，可以看出隨著發酵時間和初始pH值水平的增加，T-AOC都是先增加后降低，與單因素試驗結果一致。由等高線圖呈橢圓形可看出發酵時間與初始pH值之間的交互作用極顯著。發酵時間18～30 h、初始pH 6.5～7.5時，T-AOC有最大值。圖6c為初始pH值處于零水平時，發酵時間與發酵溫度之間的交互作用圖，發酵時間處于較低水平時，隨著發酵溫度的升高，T-AOC先增加后趨于平緩，發酵溫度處于較低水平時，隨著發酵時間的延長，T-AOC先增加后降低，發酵溫度34～37 ℃、發酵時間24～36 h時，T-AOC有最大值。

響應面優化后通過Design-Expert v8.0.6軟件計算得到的最適條件為初始pH 6.71、發酵時間26.04 h、發酵溫度35.2 ℃，在此條件下，小米糠固態發酵后提取液的T-AOC預測值為354.995 U/g小米糠。為了檢驗響應面設計試驗的可靠性，根據實際的操作條件對小米糠固態發酵工藝的條件進行調整結果為初始pH 6.7、發酵時間26 h、發酵溫度35 ℃。在此條件下，小米糠固態發酵后提取液的T-AOC實際值為（344.51±8.02）U/g小米糠，與預測值相比，相對誤差約為2.95%，比未發酵小米糠提取液的T-AOC（（108.12±3.10）U/g小米糠）提高了約2.18 倍，此時多肽提取量為（68.37±0.92）mg/g小米糠。郭利娜等[8]通過納豆芽孢桿菌液態發酵小米糠，多肽提取量為71.33 mg/g小米糠，與本研究固態發酵法的結果基本一致。

2.3.3 多肽對DPPH自由基的清除能力

圖 7 生物活性肽的DPPH自由基清除率Fig. 7 DPPH radical scavenging capacity of the bioactive peptides

從圖7可以看出，隨著小米糠多肽質量濃度的增加，DPPH自由基的清除能力逐漸增強，當多肽濃度為0.2 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到了69.26%，隨后清除能力變化減緩。小米糠多肽質量濃度與DPPH自由基清除能力之間呈多項式關系（y=922.22x3－1268.7x2+ 563.24x+0.250 2，R2=0.999 8），通過擬合方程計算得到DPPH自由基IC50為0.12 mg/mL。He Rong等[12]利用枯草芽孢桿菌固態發酵菜籽粕制備了菜籽肽，肽含量為165 μg/mL時即可清除50%的DPPH自由基；武萬興等[25]通過固態發酵核桃粕制備了抗氧化肽，其DPPH自由基IC50為0.15 mg/mL；Jin Duxin等[30]采用復合酶水解玉米蛋白后分離到一種新的抗氧化肽，其氨基酸序列為Cys-Ser-Gln-Ala-Pro-Leu-Ala，DPPH自由基IC50為0.116 mg/mL。本實驗所得小米糠抗氧化肽的DPPH自由基IC50值略低于菜籽肽和核桃肽，與玉米肽相似，說明小米糠生物活性肽具有較高的研究價值。

3 結 論

以納豆芽孢桿菌為發酵菌株，采用固態發酵的方法，制備了小米糠抗氧化肽粗提物。對影響納豆芽孢桿菌固態發酵小米糠產抗氧化肽的菌液接種量、發酵時間、發酵溫度、初始pH值和發酵基質平均粒徑5 個因素進行了單因素試驗，在單因素試驗的基礎上設計了Plackett-Burman試驗，篩選出初始pH值、發酵時間和發酵溫度3 個影響顯著的因素進行響應面法優化，得到了最適的固態發酵條件。此條件下小米糠發酵后獲得的提取液總抗氧化能力比未發酵提取液提高了2.18 倍，且具有較高的多肽提取量和DPPH自由基清除能力。小米糠抗氧化肽是一種天然抗氧化劑，安全無毒副作用，有待于進一步分離純化，并對其抗氧化性質進行研究。

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Optimization of Solid State Fermentation Conditions for Production of Antioxidant Peptides from Millet Bran by Bacillus natto

WEI Tao, ZHOU Qijing, LU Zhaoxin, L? Fengxia, BIE Xiaomei, ZHANG Chong, ZHAO Haizhen*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to improve the utilization rate of millet bran as a protein source and to provide references for the intensive processing of millet bran, solid state fermentation of millet bran by Bacillus natto was optimized for increased production of antioxidant peptides. Firstly, one-factor-at-a-time experiments were carried out. Secondly, the fermentation conditions with a signi cant effect on the total antioxidant capacity (T-AOC) of aqueous extracts from fermented millet bran were selected using Plackett-Burman design for further optimization using response surface methodology (RSM). The polypeptide content and 1,1-diphenyl-2-trinitrobenzene hydrazine (DPPH) radical scavenging ability of the aqueous extract from millet bran fermented under optimized conditions were determined. Results showed that the optimum fermentation conditions were as follows: average particle diameter of millet bran, 0.22 mm (between 60 and 80 mesh); inoculum size, 0.4 mL; initial pH, 6.7; fermentation time, 26 h; and fermentation temperature, 35 ℃. Experiments conducted under these conditions yielded an extract with a T-AOC of (344.51 ± 8.02) U/g, and a polypeptide yield of (68.37 ± 0.92) mg/g millet bran. The results also showed that the bioactive peptides had strong DPPH free radical scavenging activity with an IC50value of 0.12 mg/mL. Therefore, this study proves that bioactive peptides obtained from fermented millet bran have a high antioxidant capacity.

millet bran; Bacillus natto; solid state fermentation; r esponse surface methodology; antioxidant peptides

10.7506/spkx1002-6630-201710012

TS209

A

1002-6630（2017）10-0066-08

韋濤, 周啟靜, 陸兆新, 等. 納豆芽孢桿菌固態發酵小米糠產抗氧化肽工藝優化[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 66-73.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710012. http://www.spkx.net.cn

WEI Tao, ZHOU Qijing, LU Zhaoxin, et al. Optimization of solid state fermentation conditions for production of antioxidant peptides from millet bran by Bacillus natto[J]. Food Science, 2017, 38(10): 66-73. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710012. http://www.spkx.net.cn

2016-06-19

中央高校基本科研業務費重點項目（kyz201118）

韋濤（1990—），男，碩士研究生，主要從事食品生物技術研究。E-mail：2014108076@njau.edu.cn

*通信作者：趙海珍（1975—），女，教授，博士，主要從事食品生物技術研究。E-mail：zhaohz@njau.edu.cn

小米糠；納豆芽孢桿菌；固態發酵；響應面法；抗氧化肽