氣相色譜-質(zhì)譜法分析冷鮮灘羊肉微生物差異代謝物

張同剛，蘇春霞，李俊麗，張麗文，羅瑞明

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

氣相色譜-質(zhì)譜法分析冷鮮灘羊肉微生物差異代謝物

張同剛，蘇春霞，李俊麗，張麗文，羅瑞明*

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

以托盤密封包裝的冷鮮灘羊肉為研究對象，基于氣相色譜-質(zhì)譜平臺對其中微生物的代謝物組進行檢測，區(qū)分不同貯藏時間生物樣本之間的差異，尋找出造成上述差異的變量或分子，并將該差異物映射到灘羊肉主要腐敗菌假單胞菌屬（Pseudomonas）相應(yīng)的代謝途徑中，分析其代謝的相對強度。采用模式識別方式正交偏最小二乘法判別分析將不同貯藏時間組完全區(qū)分。結(jié)果表明：該差異代謝物所映射的代謝途徑中三羧酸循環(huán)、精氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸及谷氨酸代謝及磷酸戊糖途徑的代謝強度相對較高。說明基于氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對微生物的代謝物組進行檢測，尋找并鑒定差異代謝物是可行的。

灘羊；微生物；差異代謝物；氣相色譜-質(zhì)譜

寧夏鹽池灘羊是經(jīng)長期自然選擇和人工選育而成的裘肉兼用型品種，被農(nóng)業(yè)部列為國家二級保護品種。其肉脂肪分布均勻，膻味較輕，肉質(zhì)細嫩鮮美，營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特，深受廣大消費者的喜愛[1-3]。冷鮮灘羊肉是指對嚴格執(zhí)行檢疫制度屠宰后的胴體迅速進行冷卻處理，使胴體溫度（以后腿為測量點）在24 h內(nèi)降為0～4 ℃，并在后續(xù)的流通過程中始終保持在0～4 ℃范圍內(nèi)的鮮羊肉[4-8]。

隨著我國人民生活水平的提高，冷鮮肉正逐漸成為我國肉類消費的主流，在冷鮮肉推廣的過程中微生物對于貨架期的影響是面臨的最大問題之一，只有保證食品質(zhì)量安全，冷鮮肉才能快速穩(wěn)定的進一步發(fā)展[9-12]。而微生物代謝物作為生物信息傳遞的終端層次，在基因功能詮釋和代謝狀態(tài)分析等方面顯現(xiàn)出了很大的潛力。代謝組學(xué)技術(shù)能對代謝物的集合進行分析，使代謝物變化規(guī)律的研究系統(tǒng)化[12-16]。現(xiàn)有的主要檢測手段包括：核磁共振技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[16-24]。Cevallos-cevallos等[25]利用毛細管電泳二極管陣列、液相色譜-質(zhì)譜和氣相色譜-質(zhì)譜3種檢測方法，結(jié)合主成分分析和偏最小二乘法，對雞肉和牛肉中的大腸桿菌O157:H7和沙門氏菌進行了檢測。目前，對于灘羊肉微生物的研究大多為抑菌，而對于其微生物代謝行為及代謝過程的報道較少。

本研究以托盤密封包裝的冷鮮灘羊肉為研究對象，基于氣相色譜-質(zhì)譜平臺對其中優(yōu)勢微生物的代謝物組進行系統(tǒng)性檢測，而后采用模式識別方式，區(qū)分冷鮮灘羊肉不同貯藏時間生物樣本之間的差異，既而找尋出造成上述異同的變量或分子，即差異代謝物。差異代謝物的尋找有助于深入探究微生物代謝行為及代謝過程，為進一步揭示微生物代謝途徑的相對強度、延長冷鮮灘羊肉貨架期及開發(fā)保鮮新技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊后腿肉，采自寧夏吳忠市澇河橋牛羊肉產(chǎn)業(yè)有限公司；灘羊飼養(yǎng)期間不做任何生物性防疫工作，且定期進行清糞、消毒處理，密封托盤包裝。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀 美國Agilent公司；LECOChroma TOF PEGASUS HT質(zhì)譜儀 美國LECO公司；JXFST PRP-24研磨儀 上海凈信科技有限公司；TGL-16M型高速冷凍臺式離心機 湘儀離心機儀器有限公司；240分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采集貯藏溫度為0 ℃，相對濕度為85%的灘羊肉表面刮擦物100 mg（含微生物、血液、肉汁液等），封裝于滅菌冷凍管中待用。采樣周期為4 d，即采樣時間點為0、4、8、12 d，每組樣本做5 個平行。

1.3.2 樣品預(yù)處理

將冷鮮貯藏的灘羊后腿肉表面刮擦物100 mg（含菌落、血液、肉汁液等），快速投入液氮中進行1 min淬滅，解凍后在－9 ℃，12 000×g離心3 min，去除上清液得到菌體。收集50 mg菌體于2 mL EP管中，加入液氮、0.4 mL甲醇-氯仿（3∶1，V/V）溶液，提取胞內(nèi)代謝物，后加入20 μL L-2-氯苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)，加入鋼珠，用研磨儀（65 Hz）勻漿研磨處理3 min，勻漿后在4 ℃，12 000×g離心15 min，小心取出350 μL上清液于2 mL樣品瓶中。將提取的代謝物置于37 ℃真空濃縮器中干燥約3.5 h后，加入80 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽溶于吡啶20 mg/mL），輕輕混勻后，放入80 ℃烘箱中孵育20 min，之后向每個樣品中迅速加入100 μL衍生化試劑雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（含有1%三甲基氯硅烷，V/V），將混樣在70 ℃烘箱中孵育1 h，待混樣冷卻至室溫，加入5 μL脂肪酸甲酯（飽和脂肪酸甲酯標(biāo)準混合液，溶于氯仿，C8～C16：1 mg/mL；C18～C24：0.5 mg/mL）混勻，得到分析樣品，待上機檢測。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件

Restek Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升溫程序：前進樣口吹掃流速3 mL/min，起始柱溫60 ℃，保持1 min后，以10 ℃/min速率升至330 ℃，保持10 min；進樣口溫度280 ℃；載氣為高純度He，流速1 mL/min；進樣量1.0 μL，不分流。接口溫度280 ℃，傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度220 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 85～600；掃描速率20 spectra/s；溶劑延遲時間6 min；電子電壓70 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SIMCA軟件（V14, Umetrics AB，Umea，Sweden）對歸一化后的數(shù)據(jù)進行多元變量模式識別分析。采用監(jiān)督模式識別方法正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），以便將不同生物樣本之間的差異歸類區(qū)分。模型的質(zhì)量用7折交叉驗證進行檢驗，并用交叉驗證后得到的R2Y（代表Y變量的可解釋性）和Q2（代表模型的可預(yù)測性）對模型有效性進行評判[26-30]。進一步結(jié)合差異代謝物引起兩組之間差異所占的權(quán)重識別差異化合物及KEGG數(shù)據(jù)庫劃分代謝物所屬途徑并分析其代謝強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

為了去除噪音數(shù)據(jù)，采用四分位數(shù)極差或四分位間距法對數(shù)據(jù)進行過濾，以便更好對下游數(shù)據(jù)進行分析；而后采用最小值二分之一法對原始數(shù)據(jù)中缺失值進行模擬、填補；最后對填補完以后的數(shù)據(jù)進行標(biāo)準化處理，方法是內(nèi)標(biāo)歸一法，過濾后，還有325 個有效峰，如圖1所示。

圖 1 20 例灘羊后腿肉表面刮擦物的總離子流圖Fig. 1 GC-MS total ion current chromatogram for intracellular metabolites from bacterial cells scrapped from the surface of 20 samples of Tan sheep hind leg muscle

2.2 多元變量分析

應(yīng)用主成分分析對冷鮮灘羊后腿肉貯藏0 d組與4 d組，4 d組與8 d組和8 d組與12 d組表面刮擦物氣相色譜-質(zhì)譜進行數(shù)據(jù)分析。

圖 2 冷鮮灘羊肉貯藏4 d組和0 d組（A）、8 d組和4 d組（B）、12 d組和8 d組（C）的OPLS-DA得分圖Fig. 2 Score plots of OPLS-DA model obtained for Tan sheep meat stored for 4 days versus 0 days, for 8 days versus 4 days, for 12 days versus 8 days

為將各個灘羊肉冷鮮貯藏組區(qū)分開來，找到潛在的差異化合物，本實驗采用OPLS-DA法對樣本進行分析。由圖2可知，灘羊肉冷鮮貯藏0 d組與4 d組，4 d組與8 d組和8 d組與12 d組能夠完全區(qū)分，但冷鮮灘羊肉貯藏4 d組、8 d組與12 d組內(nèi)呈一定的散發(fā)分布，這反映了灘羊肉冷鮮貯藏4 d組、8 d組與12 d組組內(nèi)存在明顯差異。

表 1 多元變量分析Table 1 Multivariate analysis

由表1可知，該模型的可解釋變量（R2X）分別為0.393、0.350與0.406；監(jiān)督模型的解釋率（R2Y）分別為0.992、0.989與0.987；模型的可預(yù)測度（Q2）分別為0.759、0.660與0.804，說明該模型有很好的預(yù)測性。為了對模型的有效性做進一步檢驗，通過排列實驗隨機多次（n=200）改變分類變量y的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機Q2值，進而驗證模型的穩(wěn)健性，見圖3。置換檢驗截距分別為R2為0.966、0.964和0.959，Q2為－0.100、0.010和－0.111，很好地體現(xiàn)了模型的穩(wěn)健性。表明基于氣相色譜-質(zhì)譜法建立的OPLS-DA模型能很好地解釋冷鮮貯藏0 d組與4 d組、4 d組與8 d組和8 d組與12 d組，兩兩樣本之間的差異。如圖4所示，通過載荷圖可獲得一些潛在的差異化合物，即生物標(biāo)記物，圖中左右兩端物質(zhì)為潛在的差異化合物。選擇OPLS-DA法處理數(shù)據(jù)，進行后續(xù)的差異代謝物的篩選與鑒定可以獲得較好的效果。

圖 3 冷鮮灘羊肉貯藏4 d組和0 d組（A）、8 d組和4 d組（B）、12 d組和8 d組（C）的置換檢驗Fig. 3 Permutation test of Tan sheep meat stored for 4 days versus 0 days, for 8 days versus 4 days, and for 8 days versus 12 days

2.3 差異化合物篩選與鑒定

表 2 灘羊肉冷鮮貯藏4 d組和0 d組的差異代謝物Table 2 Differences in metabolites from microorganisms in Tan sheep meat stored for 4 days versus 8 days

表 3 灘羊肉冷鮮貯藏8 d組和4 d組的差異代謝物Table 3 Differences in metabolites from microorganisms in Tan sheep meat stored for 8 days versus 4 days

表 4 灘羊肉冷鮮貯藏12 d組和8 d組的差異代謝物Table 4 Differences in metabolites from microorganisms in Tan sheep meat stored for 12 days versus 8 days

OPLS-DA既能過濾掉數(shù)據(jù)集中不相關(guān)的干擾信號，又能將樣品分類屬性識別作用發(fā)揮到極致，因而通過OPLS-DA獲得的差異性代謝物更加可靠。當(dāng)相似值介于200和700之間時，鑒定得到的代謝物是推斷而來的；當(dāng)相似值大于700，說明所得物質(zhì)匹配度高，準確可信。

從表2～4可得，4 組冷鮮灘羊肉微生物代謝物的樣本中鑒定出的30 種差異代謝物主要集中在糖類、糖醇和氨基酸及其衍生物等物質(zhì)上。其中D-甘油酸、天冬酰胺在貯藏4 d時上調(diào)，而在8 d時下調(diào)；而1-磷酸葡萄糖、磷酸-5'-肌苷酸相對含量在4 d和8 d兩個貯藏階段內(nèi)始終呈現(xiàn)遞減趨勢。在8 d和12 d兩個貯藏時間段內(nèi)，核糖峰面積平均值逐漸降低；1,5-脫水葡萄糖醇的相對含量隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢。對于乙酰苯胺而言，與0 d相比，在4 d時相對含量降低，而隨著貯藏時間延長到12 d時其相對含量有所增長。其余差異化合物為各組內(nèi)獨有，其相對含量也呈現(xiàn)出升高或降低現(xiàn)象。

2.4 差異化合物代謝路徑的分析

將上述所得差異化合物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中，獲得各差異化合物相應(yīng)的代謝路徑，并分析假單胞菌的代謝強度，見表5。

表 5 差異化合物代謝路徑分析Table 5 Analysis of metabolic pathways for variable metabolites

30 種差異代謝物中，能與代謝途徑精確匹配的代謝物有22 種。其余8 種差異物中，磷酸-5’-肌苷酸、異麥芽糖及羥脯氨酸3 種化合物的代謝途徑是參考相關(guān)文獻得出的；而乙酰苯胺、2-羥基戊酸、反-4-羥基-L-脯氨酸、牛磺酸及1,5-脫水葡萄糖醇5 種化合物未能將其映射到KEGG數(shù)據(jù)庫相關(guān)的代謝通路中，可能是由于這幾種化合物的信息未被收錄到細菌代謝途徑數(shù)據(jù)庫中造成的。假單胞菌在所匹配的代謝路徑中三羧酸循環(huán)、精氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸及谷氨酸代謝及磷酸戊糖途徑的代謝強度相對較高。

3 結(jié) 論

本實驗對灘羊肉冷鮮貯藏過程中微生物代謝物組進行整體性檢測，OPLS-DA法能將冷鮮灘羊肉4 個貯藏時間組完全區(qū)分，但冷鮮灘羊肉貯藏4 d組和8 d組組內(nèi)呈一定的散發(fā)分布，表明灘羊肉冷鮮貯藏4 d組及8 d組組內(nèi)存在明顯差異，可能是由于2 個組內(nèi)5 個平行樣本其微生物生長繁殖的速度及生長階段不處于同一個水平。說明選擇OPLS-DA法處理數(shù)據(jù)進行后續(xù)的差異代謝物的篩選與鑒定可以獲得較好的效果。

本實驗共鑒定出30 種能夠精確匹配的差異代謝物。其所映射的代謝途徑中三羧酸循環(huán)、精氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝及磷酸戊糖途徑的代謝強度相對較高。在不同貯藏時間段，由于優(yōu)勢微生物群落的演替變化，其產(chǎn)生的差異代謝物相對含量呈現(xiàn)出不同變化趨勢。說明基于氣相色譜-質(zhì)譜平臺對微生物的代謝物組進行檢測，尋找并鑒定差異代謝物是可行的。下一步實驗將要結(jié)合差異代謝物分析主要腐敗菌的代謝強度，探究微生物營養(yǎng)代謝組分變化與群落演替關(guān)聯(lián)性。為深入探究微生物代謝行為及代謝過程、延長冷鮮灘羊肉貨架期及開發(fā)保鮮新技術(shù)提供理論參考。

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GC-MS Analysis of Variation of Microbial Metabolites in Fresh Tan Sheep Meat during Chilled Storage

ZHANG Tonggang, SU Chunxia, LI Junli, ZHANG Liwen, LUO Ruiming*
(School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

The quality of fresh Tan sheep meat is closely related to the metabolites produced by microbes during chilled storage. Metabolomics can systematically determine the pro les of intracellular and extracellular metabolites systematically and therefore contribute to qualitative and quantitative analysis. This study focused on the metabolomic analysis of microorganisms in tray-packaged Tan sheep meat during chilled storage by gas chromatography-mass spectrometry (GCMS) and on the discrimination of the differences among biological samples with different storage times in order tond out the variables or molecules contributing to these differences. The variable metabolites were mapped to the corresponding metabolic pathways in the major spoilage bacteria Pseudomonas for analyzing the relative intensity of metabolism. The use of pattern recognition mode of orthogonal partial least squares analysis could complete distinguish different storage time groups. The results showed that the metabolism intensity of citric acid cycle, arginine metabolism, alanine, aspartic acid and glutamic acid metabolism and pentose phosphate pathway were relatively high. It is feasible tond out and determine the variable metabolites of microorganisms using GC-MS.

Tan sheep; microorganism; variable metabolites; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

10.7506/spkx1002-6630-201710047

TS251

A

1002-6630（2017）10-0291-06

張同剛, 蘇春霞, 李俊麗, 等. 氣相色譜-質(zhì)譜法分析冷鮮灘羊肉微生物差異代謝物[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 291-296.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710047. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Tonggang, SU Chunxia, LI Junli, et al. GC-MS analysis of variation of microbial metabolites in fresh Tan sheep meat during chilled storage[J]. Food Science, 2017, 38(10): 291-296. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201710047.http://www.spkx.net.cn

2016-08-02

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31460431）

張同剛（1987—），男，博士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品加工。E-mail：372998013@qq.com

*通信作者：羅瑞明（1964—），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：ruimingluo.nx@163.com