熒光-磁共振雙功能納米探針標記乳腺癌細胞

章娉 唐焱 周佳 蔣迪 劉紅雨

南華大學附屬第一醫院超聲科 衡陽 421001

熒光-磁共振雙功能納米探針標記乳腺癌細胞

章娉 唐焱 周佳 蔣迪 劉紅雨

南華大學附屬第一醫院超聲科 衡陽 421001

目的 探討載Herceptin靶向聚乳酸-羥基乙酸[poly(1actic-co-glycolic acid)，PLGA]-超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)分子探針的構建方法及對乳腺癌體外靶向結合的可行性。方法 以 PEG 化端羧基 PLGA 作為成膜材料，采用雙乳化法及碳二亞胺化學連接法，制備裝載超順磁性氧化鐵的 Herceptin-SPIO-PLGA探針，并對其粒徑、表面形態等進行檢測，體外培養高表達 HER2 的乳腺癌細胞株SK-BR-3，評價其體外尋靶能力及MTT法檢測所制備探針對細胞活性的影響。結果 光鏡及掃描電鏡觀察所制備探針形態規則，呈球形，表面光滑，分散性好，大小較均勻，粒徑為(281.5±81.2)nm。透射電鏡結果顯示探針為殼核結構，USPIO分布于殼膜中，且其分布具有隨機性。Herceptin-SPIO-PLGA即使在Fe 濃度達到400 μg/mL，細胞存活率仍保持在90%以上，具有較低細胞毒性。在激光掃描共聚焦顯微鏡下，被SK-BR-3細胞吞噬的發出紅色熒光。結論 雙靶點磁性、熒光雙模態分子探針多肽Herceptin-SPIO-PLGA具有優良的理化性質及穩定性，生物安全性好，腫瘤靶向結合能力強。

分子探針；磁共振成像；乳腺腫瘤

隨著醫學分子顯像技術的迅猛發展，單一成像模式與診斷功能的顯影劑已遠遠不能滿足日益增長的醫學多樣化和個性化需求。多功能顯像劑集合超聲、磁共振、光學等兩種或多種成像技術優勢，能在解剖、功能及分子水平對病變細胞發生、發展與凋亡進行多種模式顯示，為臨床提供更加完整而準確的生物信息[1]。我們通過制備腫瘤雙靶點磁性、熒光雙模態分子探針，評價其理化性質，并以乳腺癌細胞為模型，初步探討該探針對乳腺癌行 MRI、光學雙模態分子成像的可行性。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器 (1)有機溶劑(上海化工廠)，MTT試劑盒(美國Sigma公司)，胎牛血清和DAPI(美國Invitrogen)，細胞培養基(美國Gibco)，DiI 細胞膜紅色熒光探針及DiO 細胞膜綠色熒光探針(武漢博士德生物有限公司)，乳腺癌細胞株(SK-BR-3)由上海中科院細胞庫提供。(2)主要儀器 CO2培養箱，離心機(上海儀器設備廠)，倒置顯微鏡，透射顯微鏡，掃描電鏡(日本Olympus)，流式細胞儀(美國BD公司)，3.0 T MR儀(美國GE公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 分析方法 (1) 熒光-磁共振雙功能分子探針的構建及表征分析：采用雙乳化法制備：將一定比例的 PLGA-COOH 與 SPIO溶于三氯甲烷中至充分溶解；向上述溶液中加入適量 PFP，冰浴條件下應用聲振儀振蕩。取適量 5% PVA 液加入上述乳化液中，高速分散均質機均質。加入 2%異丙醇，冰浴條件下旋轉蒸發 1～2 h。雙蒸水洗滌、離心、收集，即得到多功能顯像劑。(2) DiI 標記的攜 Herceptin 的多功能分子探針的制備。采用碳二亞胺法將制得的載 SPIO 多功能顯像劑復溶于10 mL MES 緩沖液(0.1 mol/L,pH=5)中。先后向其中加入過量的 EDC及 NHS(物質的量比為 1.5∶1)，置于搖床上，4 ℃下活化 2 h 后用雙蒸水洗滌離心 3 次。將活化的顯像劑復溶于 10 mL MES 緩沖液(0.1 mol/L，pH=8)中，向其中加入適量 DiI 熒光標記的 Herceptin，4 ℃下反應 1 h 后，用雙蒸水洗滌離心 3 次以去除未反應的Herceptin，收集得到攜 Herceptin 的多功能分子探針(Herceptin-PLGA-SPIO)。采用光學顯微鏡及掃描電鏡觀察多功能分子探針表面形態。(3) 細胞尋靶實驗：人乳腺癌SK-BR-3細胞用含10%胎牛血清的 PRMI-1640培養液，于 37 ℃、5% CO2條件下常規培養。將SK-BR-3隨機分為3組：靶向顯像劑(多功能分子探針)組、非靶向組和空白對照組，分別加入靶向顯影劑、非靶向顯影劑以及 PBS 液。37℃ 孵育 2 h 后，用 PBS 洗滌 3 次，再用 Hoechst 藍色熒光染料標記細胞核，在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組試劑與細胞的結合情況。(4) 細胞毒性實驗：多功能探針取9個濃度梯度，分別是400、200、100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6 μg/mL，孵育24 h后，加入MTT(5 mg/mL)。4h后除去培養基和材料混合物，加入DMSO，選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。

2 結果

2.1 雙模態分子探針的構建及表征 本實驗所制備的多功能分子探針呈棕褐色粉末狀，以去離子水復溶后，溶解性好，呈棕黃色乳液，樣品隨鐵含量的增加顏色逐漸加深。掃描電鏡下觀察見顆粒形態規則呈球形，大小均勻一致，粒徑為(281.5±81.2)nm，分散度好，球面欠光滑。透射電鏡見顆粒呈球形，可見外殼中USPIO 分布于其中(見圖1)。

A顆粒形態規則呈球形，大小均勻一致，分散度好 B掃描電鏡觀察見球面欠光滑 C透射電鏡見顆粒呈球形，外殼中USPIO 分布于其中

圖1 掃描電鏡及透射電鏡下觀察

2.2 細胞毒性實驗情況 多功能分子探針對SK-BR-3細胞的毒性 SK-BR-3 細胞與不同濃度分子探針孵育24 h后，細胞的活性分別為 (99.83±15.37)、(99.51±10.17)、(99.35±9.84)、(95.91±10.25)、(95.66±8.61)、(92.65±3.05)、(90.08±1.96)、(90.10±1.35)，這表明分子探針對SK-BR-3 細胞毒性很小。

2.3 細胞尋靶實驗情況 細胞膜綠色熒光探針DiO可將乳腺癌細胞膜標記為綠色熒光，且 DiO 不會影響細胞的生存活性，DiI 標記的探針呈紅色熒光。不同處理組的細胞周圍所結合的熒光探針有很大的差異。空白對照組的細胞周圍幾乎無紅色的熒光，非靶向組的細胞周圍可見少量紅色熒光，而靶向探針組可觀察到細胞膜周圍大量的紅色熒光。說明該靶向探針具有獨特主動靶向 HER-2 受體陽性表達乳腺癌細胞的能力。見圖2。

圖2 細胞尋靶結合實驗

3 討論

乳腺癌(breast cancer)是女性最常見的惡性腫瘤之一，通常發生在乳腺上皮組織，發病率占全身各種惡性腫瘤的 7%～10%，已成為威脅婦女健康的主要病因，嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命。臨床發現，大約40%的乳腺癌患者表達人表皮生長因子受體-2(HER2)，HER2 陽性的腫瘤惡性程度高，進展快，更容易復發和轉移，且預后不佳，是“最兇險的乳腺癌”[2-3]。

近年來納米技術靶向藥物傳遞技術成為當前研究的熱點。納米粒經表面修飾可連接抗體、多肽、適配子等而具有靶向性，再裝載攜帶對比顯像劑及藥物或基因后，不但可實現腫瘤分子顯像，從分子及細胞水平顯示腫瘤發生、發展與轉歸過程，并可定向傳遞藥物，發揮靶向治療作用，實現影像學方法實時監控下的靶向治療與療效評估，形成一種集腫瘤早期診斷、可視化靶向治療與療效評估為一體的全新生物醫學模式和醫學基礎研究平臺技術[4]。近年來，國外、國內很多學者致力于多功能顯影劑的制備與應用研究，取得了一定成果。Xu H[5]等融合納米金殼與 PFOB 材料制備了可同時增強體外及體內超聲、CT 成像，并對裸鼠移植瘤具有光熱治療作用的多功能納米囊。國內學者已經完成制備了載氧化鐵納米顆粒的多功能顯像劑，該多功能顯像劑能同時增強超聲及磁共振成像，對高強度聚焦超聲消融兔乳腺移植瘤亦有增強作用[6]。對多功能顯像劑中包載抗腫瘤藥物，還能進一步發揮抗腫瘤效應，是一種優良的多功能顯像劑，為腫瘤的診斷與治療研究提供了新思路與新途徑。但目前多功能顯像劑的研究中也存在一些問題，如制備多功能顯像劑的功能性核心材料選擇與多種影像技術的匹配，體內高效分子成像與治療功能的有機結合等。

超順磁性氧化鐵(superparamagnetici ron oxide, SPIO)納米顆粒是一種備受關注的新型磁性納米生物材料。其粒徑小、表面可修飾性強，超順磁性強、靈敏度高、靶向性好，毒性低、生物安全性好、體內半衰期較長，在生物檢測、疾病診斷及治療等方面均展現了巨大的應用價值[7-9]。SPIO在磁共振成像方面的應用，已得到全世界范圍的廣泛關注。乳腺癌分子靶向治療藥物Herceptin能與HER2受體的膜外段高效、特異性結合，最后用高分子復合物[10]。Herceptin-PLGA-SPIO可以實現對HER2高表達人乳腺癌SK-BR-3細胞靶向標記與成像。

隨著醫學的發展以及人們對生活質量和形體美容需求的增強，腫瘤的無創治療已成為發展趨勢，尤其是乳腺腫瘤的保乳治療越來越受到重視。結合功能顆粒 SPIO 及溫敏材料 PFP 的多功能分子探針，充分發揮了磁熱療、磁致相變及生物分子治療作用，能有效殺滅乳腺癌，同時還能在體內實時動態地監測治療效果。我們采用雙乳化法及碳二亞胺共價連接法，成功制備了Herceptin-PLGA-SPIO，其粒徑只有10 nm，在透射電鏡下觀察，SPIO 呈顆粒狀，隨機鑲嵌于高分子殼結構中。同時我們還觀察了Herceptin-PLGA-SPIO在體外與SK-BR-3細胞的靶向結合能力。結果非靶向組的細胞周圍可見少量紅色熒光，而靶向探針組可觀察到細胞膜周圍大量的紅色熒光，說明該靶向探針具有獨特主動靶向 HER2 受體陽性表達乳腺癌細胞的能力，與其他文獻的結果一致[11-13]。不同濃度的分子探針與 SK-BR-3 細胞共孵育后，細胞的增值活性均在90%以上，對其無明顯影響。進一步說明分子探針的生物安全性。本實驗存在不足之處為：未在裸鼠乳腺癌模型上進一步評價多功能分子探針磁共振、光聲學效果，需在后續實驗中進一步深入研究。

總之，我們制備的熒光-磁共振雙功能納米探針具有良好的生物學特性，針對乳腺癌HER2良好的靶向成像效果，為下一步進行體內成像研究奠定了基礎。

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[7] Arya G, Vandana M, Acharya S, et al. Enhanced antiproliferative activity of herceptin (her2)-conjugated gemcitabine-loaded chitosan nanoparticle in pancreatic cancer therapy[J].Nanomedicine: Nanotechnology,Biology,and Medicine,2011,7:859-870.

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(收稿 2016-12-09)

Synthesis of a novel long-circulating dual-receptor targeting and dual-modal molecular probe: an in-vitro study

ZhangPing，TangYan,ZhouJia,JiangDi,LiuHongyu.
DepartmentofultrasoundDiagnosisoftheFirstAffiliatedHospitalofUniversityofNanhua，HengyangHunan, 421001,China

Objective To explore a novel long-circulating dual-receptor targeting and dual-modal molecular probe and investigate its physicochemical properties and targeting effect on breast cancer cells in vitro. Methods Herceptin-SPIO-PLGA was prepared by double emulsion and a carbodiimide technique, with different concentration of SPIO input in the oil phase to synthesize with various SPIO-loaded.The morphology of the Herceptin-SPIO-PLGA was observed by the light microscope (LM), scanning electron microscope(SEM) and transmission electron microscope (TEM). The mean size and size distribution were measured by a laser instrument.The cytotoxicity of Herceptin-SPIO-PLGA on the SK-BR-3 cells was detected by MTT assay. Results The prepared Herceptin-SPIO-PLGA was well dispersed, uniform and spherical. The size of the Herceptin-SPIO-PLGA was(281.5±81.2)nm.There was low cytotoxity of the molecular probe on human umbilical vein endothelical cells(SK-BR-3) by MTS study.Herceptin-SPIO-PLGA internalized by SK-BR-3 cells exhibited red fluorescence under confocal laser scanning microscope. Conclusion Herceptin-SPIO-PLGA is a novel long-circulating dual-receptor targeting and dual-modal molecular probe and has excellent physicochemical properties and stability and strong targeting effect on cancer cells and has laid a solid foundation for early diagnosis of breast cancer.

Molecular probes；Magnetic resonance imaging；Breast neoplasms

R737.9

B

1077-8991(2017)03-0002-04