鞘鞍醇激酶-1對胰腺癌SW1990細胞增殖和凋亡的影響

蔡篤雄，蘇穎潔，湯凈(海南醫學院第一附屬醫院消化內科，海南海口570102)

鞘鞍醇激酶-1對胰腺癌SW1990細胞增殖和凋亡的影響

蔡篤雄，蘇穎潔，湯凈(海南醫學院第一附屬醫院消化內科，海南海口570102)

目的探討鞘鞍醇激酶-1(SPK1)對胰腺癌SWl990細胞增殖和凋亡的影響。方法培養的胰腺癌SW1990細胞株，實驗分為DMS組、PMA組和對照組，各組細胞接種于孔板中，每組設3個復孔，每個實驗至少重復3次。DMS組加入N,N-二甲基鞘氨醇(DMS，50μmol/L)，PMA組加入佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA，100 nmol/L)，對照組按常規培養，采用MTT法和克隆形成實驗檢測細胞生長增殖的變化，流式細胞術檢測細胞凋亡，RT-PCR檢測SPK1 mRNA的表達，Western blot檢測SPK1蛋白的表達。結果PMA組細胞的增殖活力[OD值：(1.37±0.03)，細胞克隆數目：(292.45±10.68)]較對照組[OD:(1.00±0.01)，細胞克隆數目：(215.34±12.23)]顯著增加，DMS組細胞的增殖活力[OD值：(0.65±0.02)，細胞克隆數目：(130.56±15.6)]較對照組顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。PMA組細胞凋亡率[(9.7±0.62)%]較對照組[(16.71±1.53)%]明顯下降，DMS組細胞凋亡率[(31.7± 1.32)%]較對照組明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，PMA組SPK1 mRNA表達水平(0.202±0.013)及蛋白表達水平(0.258±0.015)較對照組[SPK1 mRNA：(0.148±0.006)，蛋白：(0.182±0.044)]顯著增加，而DMS組SPK1 mRNA表達水平(0.112±0.022)及SPK1蛋白表達水平(0.101±0.034)較對照組顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論SPK1與胰腺癌細胞的增殖和凋亡密切相關，SPK1的激活可促進胰腺癌細胞的增殖并抑制細胞的凋亡。

鞘鞍醇激酶-1；胰腺癌；增殖；凋亡

近年來，分子靶向治療成為胰腺癌治療研究中的熱點，目前國內外許多學者都在探求基因水平的調控方法和尋找治療的新靶點，以期在胰腺癌的治療上取得突破[1]。近年研究證明鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPK1)是細胞增殖及存活的重要調控因子，SPK1信號途徑與細胞的凋亡、增殖和遷移密切相關[2-3]。本研究旨在研究SPK1對胰腺癌細胞增殖和凋亡的影響，探討SPK1是否可能成為胰腺癌分子靶向治療的一個新型分子，為胰腺癌的基因治療尋找新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料人胰腺癌細胞株SWl990購自中國科學院上海生命科學研究院，佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)購自美國Sigma公司，N,N-二甲基鞘氨醇(DMS)購自美國Sigma公司，四氮唑藍(MTT)、DMEM完全培養基、1640培養液及胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖活力人胰腺癌SWl990細胞采用100 mL/L胎兒血清的DMEM完全培養基在5%CO2，37℃的培養箱培養，取對數生長期細胞，按實驗分組分別加入100 nmol/L的PMA(PMA組)及50μmol/L的DMS(DMS組)，對照組的細胞用含100 mmol/L胎牛血清的培養基培養，每組設3個復孔，采用MTT法檢測，所有步驟均參照試劑盒說明書進行,最后在酶聯免疫檢測儀570 nm處測量各孔的吸光值(OD值)，反映細胞增殖活力。

1.2.2 克隆形成實驗檢測細胞增殖活性將各組細胞分別培養，收集各組對數生長期細胞，調整細胞懸液濃度500個/mL，分于6個孔板，每組設3個復孔，培養10～14 d，最后觀察克隆出現日期及生長情況，大于50個細胞的集落算一個克隆，計數每個孔的克隆數并拍照。

1.2.3 AnnexinV-FITC/PI染色流式細胞技術檢測細胞凋亡率取生長狀態良好的對數生長期的細胞，接種于6個孔板，每組接種3孔，各組細胞經處理后采用0.25%胰酶消化單層細胞，800 r/min離心，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，離心棄上清，最后用1× annexin-binding buffer重懸細胞，將細胞密度調整為約1×106細胞/mL，取100μL體積為待測樣本，加5μL Alexa Fluor?488 annexin V樣本中。室溫卵育細胞15 min后，加400μL 1×annexin-binding buffer，及1μL 100 μg/mL PI到待測細胞樣本，混勻。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 PMA和DMS對SPK1 mRNA表達的影響各組細胞繼續培養24 h，提取細胞總RNA，采用RT-PCR法；引物序列如下：SPKl：正義：5'-CCGACGAGGACTITGTGCTAGT-3'，反義：5'-GCCTGTCCC CCCAAAGCAIAGC-3'；GAPDH：正義：5'-AATCCCA TCACCATCTTCCA-3'，反義：5'-CCTGCTrCACCAC CTTCTTG-3'。PCR產物電泳后用凝膠成相儀掃描分析。以目的條帶SPKl與GAPDH的灰度比值表示SPK1 mRNA的相對表達量。

1.2.5 PMA和DMS對SPK1蛋白表達的影響各組細胞培養24 h后提取總蛋白，采用Western blot檢測SPK1蛋白的表達，所有步驟均參照試劑盒說明書進行，用Kodak攝像系統拍照。Image J軟件分析蛋白的灰度值，以SPKl與β-actin的灰度比值表示SPKl蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 PMA和DMS對SWl990細胞增殖活力的影響對照組、PMA組及DMS組OD值分別為：(1.00± 0.01)、(1.37±0.03)和(0.65±0.02)，PMA組OD值明顯高于對照組(t=3.75，P<0.05)，DMS組OD值明顯低于對照組，差異均具有統計學意義(t=4.12，P<0.05)(表1，圖1)。對照組、PMA組及DMS組克隆形成數目分別為：(215.34±12.23)、(292.45±10.68)、(130.56±15.6)，PMA組的克隆形成數目明顯高于對照組(t=2.62，P< 0.05)，DMS組的克隆形成數目明顯低于對照組，差異均有統計學意義(t=2.84，P<0.05)，見表1、圖2。

2.2 PMA和DMS對SWl990細胞凋亡的影響對照組、PMA組、DMS組細胞凋亡率分別為(16.71± 1.53)%、(9.7±0.62)%和(31.7±1.32)%。PMA組細胞凋亡率明顯低于對照組，差異有統計學意義(t=13.04，P< 0.01)，DMS細胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統計學意義(t=14.12，P<0.01)，見表1、圖3。

2.3 各組SPK1 mRNA的表達對照組、PMA組及DMS組的SPK1 mRNA表達強度分別為(0.148± 0.006)，(0.202±0.013)，(0.112±0.022），PMA組SPK1 mRNA表達較對照組顯著增強，差異有統計學意義(t= 5.46，P<0.05)，而DMS組SPK1 mRNA表達較對照組明顯降低，差異有統計學意義(t=5.75，P<0.05)，見表1、圖4。

圖1 各組細胞的增殖活性與對照組比較，aP<0.05。

圖2 各組細胞的克隆形成數目與對照組比較，aP<0.05。

圖3 PMA和DMS對SWl990細胞凋亡的影響

表1 各組細胞OD值、細胞克隆形成數目、細胞凋亡率、SPK1/GADPH及SPK1/β-actin比較

表1 各組細胞OD值、細胞克隆形成數目、細胞凋亡率、SPK1/GADPH及SPK1/β-actin比較

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01。

組別對照組PMA組DMS組OD值1.00±0.01 1.37±0.03a0.65±0.02a細胞克隆形成數目215.34±12.23 292.45±10.68a130.56±15.6a細胞凋亡率(%) 16.71±1.53 9.70±0.62b31.74±1.32bSPK1/GADPH 0.148±0.006 0.202±0.013a0.112±0.022aSPK1/β-actin 0.182±0.044 0.258±0.015a0.101±0.034a

圖4 各組SPK1 mRNA的表達

2.4 各組SPK1蛋白的表達對照組、PMA組及DMS組SPK1蛋白表達強度分別為(0.182±0.044)、(0.258±0.015)、(0.101±0.034)，PMA組SPK1蛋白表達較對照組顯著增強，差異有統計學意義(t=6.16，P< 0.05)，而DMS組SPK1蛋白表達較對照組明顯降低，差異有統計學意義(t=-5.83，P<0.05)，見表1、圖5。

圖5 各組SPK1蛋白的表達

3 討論

近年研究證明細胞膜鞘磷脂的衍生物包括神經酰胺(Cer)、鞘氨醇(Sph)、1-磷酸鞘氨醇(S1P)等多種代謝產物,在腫瘤發生發展過程中發揮著極為重要的作用。研究證實Cer是一種細胞增殖負調控因子，抑制細胞生長、促進細胞凋亡，而其轉化生成的代謝物S1P則抑制細胞凋亡、促進細胞增殖[4]。鞘氨醇激酶(SPK)是細胞內合成S1P的主要限速酶，其中SPK1的作用最為關鍵。SPK1的活性受抑會導致細胞內Cer、Sph水平升高，S1P水平降低，導致細胞生長抑制或誘導凋亡的產生，Li等[5]研究發現應用SPK1抑制劑可抑制人胃癌細胞的生長并促進細胞的凋亡，因此，SPK1的表達及活性高低直接決定著細胞的命運，SPK1也是細胞增殖及存活的重要調控因子。

近年來，有關SPK1在腫瘤方面的研究越來越多，目前國內外研究主要集中在胃癌、結腸癌、鼻咽癌、肝癌、白血病等方面[6-9]，但有關SPK1與胰腺癌的研究較少，Aoki等[10]研究發現SPK1的激活可通過促進S1P的生成從而促進胰腺癌細胞的腹膜轉移。Gong等[11]研究發現應用SPK1抑制劑可通過促進神經酰胺的生成從而促進胰腺癌細胞的凋亡，Guillermet-Guibert等[12]研究發現，應用SPK1抑制劑可通過上調神經酰胺表達水平或降低SPK1活性而增加吉西他濱對胰腺癌細胞的化療敏感性，因而提示SPK1可能成為一種腫瘤靶向治療的新型分子。

本研究通過運用PMA和DMS來調節SPK1的活性和表達，研究SPK1對胰腺癌SWl990細胞增殖和凋亡的影響，發現PMA組細胞的增殖活力顯著增加，細胞凋亡率明顯下降，SPK1 mRNA及SPK1蛋白表達水平顯著增加，DMS組細胞的增殖活力顯著降低，細胞凋亡率明顯升高，SPK1 mRNA及SPK1蛋白表達水平顯著降低，表明激活SPK1能顯著促進胰腺癌細胞的增殖并抑制細胞的凋亡，抑制SPK1顯著抑制胰腺癌細胞的增殖并促進細胞的凋亡，SPK1可調控胰腺癌SWl990細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，SPK1與胰腺癌細胞的增殖和凋亡密切相關，SPK1的激活能顯著促進胰腺癌細胞的增殖并抑制細胞的凋亡，而抑制SPK1顯著抑制胰腺癌細胞的增殖并促進細胞的凋亡，通過調控SPK1活性可影響胰腺癌SWl990細胞的增殖和凋亡。因此，SPK1有可能成為胰腺癌分子靶向治療的一個新型分子。

[1]Wood LD,Hruban RH.Pathology and molecular genetics of pancreatic neoplasms[J].Cancer J,2012,18(6):492-501.

[2]Alshaker H,Sauer L,Monteil D,et al.Therapeutic potential of targeting SK1 in human cancers[J].Adv Cancer Res,2013,117:143-200.

[3]Chen K,Pan Q,Gao Y,et al.DMS triggers apoptosis associated with the inhibition of SPHK1/NF-κB activation and increase in intracellular Ca2+concentration in human cancer cells[J].Int J Mol Med,2014, 33(1):17-24.

[4]Saddoughi SA,Song P,Ogretmen B.Roles of bioactive sphingolipids in cancer biology and therapeutics[J].Subcell Biochem,2008,49: 413-440.

[5]Li PH,Wu JX,Zheng JN,et al.A sphingosine kinase-1 inhibitor, SKI-Ⅱ,induces growth inhibition and apoptosis in human gastric cancer cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(23):10381-10385.

[6]Li W,Li J,Wang Y,et al.Sphingosine kinase 1 is a potential therapeutic target for nasopharyngeal carcinoma[J].Oncotarget,2016,7(49): 80586-80598.

[7]Tian H,Yu Z.Resveratrol induces apoptosis of leukemia cell line K562 by modulation of sphingosine kinase-1 pathway[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(3):2755-2762.

[8]蘇穎潔,黃杰安,劉詩權,等.鞘氨醇激酶1和核因子κB在結腸癌中的表達及其臨床意義[J].中華內科雜志,2012,51(3):220-224.

[9]Liu H,Zhang CX,Ma Y,et al.SphK1 inhibitor SKIⅡinhibits the proliferation of human hepatoma HepG2 cells via the Wnt5A/ β-catenin signaling pathway[J].Life Sci,2016,151:23-29.

[10]Aoki H,Aoki M,Katsuta E,et al.Host sphingosine kinase 1 worsens pancreatic cancer peritoneal carcinomatosis[J].J Surg Res,2016,205 (2):510-517.

[11]Gong L,Yang B,Xu M,et al.Bortezomib-induced apoptosis in cultured pancreatic cancer cells is associated with ceramide production [J].Cancer Chemother Pharmacol,2014,73(1):69-77.

[12]Guillermet-Guibert J,Davenne L,Pchejetski D,et al.Targeting the sphingolipid metabolism to defeat pancreatic cancer cell resistance to the chemotherapeutic gemictabine drug[J].Mol Cancer Ther,2009,8 (4):809-820.

Effect of sphingosine kinase 1 on the proliferation and apoptosis in human pancreatic cancer cell line SW1990.

CAI Du-xiong,SU Ying-jie,TANG Jing.Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of sphingosine kinase 1(SPK1)on the proliferation and apoptosis of pancreatic cancer line SW1990.MethodsCultured SW1990 cell were divided into three groups:PMA group, DMS group and the control group.The cells of each group were seeded in the orifice plate,with 3 wells in each group,at least 3 replicates for each experiment.The cells of the PMA group were treated with 100 nmol/L of phorbol 12-myristate13-acetate(PMA);the DMS group was treated with 50μmol/L N,N-dimethylsphingosine(DMS);while the control group was cultured routinely.After the treatment,cell proliferation was determined by MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)assay and colony formation assay,cell apoptosis was detected by flow cytometry,and mRNA and protein expression of SPK1 were detected by RT-PCR and Western blot.ResultsThe cell viability in PMAgroup was the OD value of(1.37±0.03)and the number of cell clones of(292.45±10.68),which was significantly higher than the OD value of(1.00±0.01)and the number of cell clones of(215.34±12.23)in the control group(P< 0.05).The cell viability in DMS group was the OD value of(0.65±0.02)and the number of cell clones of(130.56±15.6), which was significantly higher than that in the control group(P<0.05).The apoptosis rate in PMA group was(9.7± 0.62)%,which was significantly lower than(16.71±1.53)%in the control group,and the apoptosis rate in DMS group was(31.7±1.32)%,which was significantly higher than that in the control group(P<0.01).The mRNA and protein expression of SPK1 in PMA group were respectively(0.202±0.013)and(0.258±0.015),which were significantly higher than(0.148±0.006)and(0.182±0.044)in the control group,and the mRNA and protein expression of SPK1 in DMS group were(0.112±0.022)and(0.101±0.034),which were significantly lower than those in the control group(P<0.05).ConclusionSPK1 is closely related to the proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells.The activation of SPK1 can promote the proliferation of pancreatic cancer cells and inhibit the apoptosis.

Sphingosine kinase 1(SPK1);Pancreatic cancer;Proliferation;Apoptosis

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.10.002

R735.9

A

1003—6350（2017）10—1552—04

2017-01-06)