γ-干擾素釋放試驗在結核診斷中的價值

田瑞雪，馬麗萍，武紅莉，侯洪艷，張麗萍

(1.北京大學第三醫院海淀院區北京海淀醫院 呼吸科，北京 100086; 2.首都醫科大學附屬北京胸科醫院 結核二病區，北京 101149)

·論著·

γ-干擾素釋放試驗在結核診斷中的價值

田瑞雪1，馬麗萍2，武紅莉1，侯洪艷1，張麗萍1

(1.北京大學第三醫院海淀院區北京海淀醫院 呼吸科，北京 100086; 2.首都醫科大學附屬北京胸科醫院 結核二病區，北京 101149)

目的 評價γ-干擾素釋放試驗的酶聯免疫斑點技術法(T-SPOT.TB)在結核病輔助診斷中的價值。方法 選擇活動性結核病患者130例(包括肺結核112例，肺外結核8例)，陳舊肺結核患者89例，非結核呼吸系統疾病患者137例。所有患者在抗結核之前均進行痰液抗酸桿菌涂片及T-SPOT.TB檢測。按照痰液抗酸桿菌涂片結果，將肺結核患者分為涂片陽性組和陰性組。按照年齡分為中青年組和老年組。比較T-SPOT.TB對活動性結核病、陳舊肺結核診斷效能。結果T-SPOT.TB診斷結核病的敏感度為82.307%，特異度為75.182%;T-SPOT.TB對活動性結核病，陳舊肺結核，非結核的診斷比較差異有統計學意義(χ2=7.580，P=0.032)；陳舊肺結核組陽性率比非結核組明顯升高。肺結核T-SPOT.TB敏感度為86.60%，特異度75.00%，痰涂片檢測的敏感度為65.17%，特異度98.33%。二者敏感度和特異度比較差異有統計學意義(P<0.001)。中青年T-SPOT.TB診斷的敏感度高于老年(χ2=4.782，P=0.029)。結論T-SPOT.TB檢測快速便捷，有著較高的敏感度和特異度，可用于結核病尤其是涂陰性肺結核。對陳舊結核陽性率高，不適合鑒別陳舊肺結核和活動性結核。

結核，肺；干擾素γ；酶聯免疫斑點測定

近年來建立和發展起來的γ-干擾素釋放試驗(interferongammareleaseassays，IGRAs)為結核病的早期快速診斷提供了新途徑。IGRAs可彌補結核菌素純蛋白衍化物(PPD)試驗的不足，目前多個國家已將其用于診斷結核分枝桿菌(MTB)潛伏感染(LTBI)[1]。國內外研究結果表明IGRAs診斷活動性結核病，具有一定的輔助診斷價值，尤其在發達國家[2]。本研究回顧性分析經IGRAs的酶聯免疫斑點技術法(T-SPOT.TB)方法檢測的130例活動結核病及89例陳舊性肺結核臨床資料，旨在評價T-SPOT.TB在活動性結核病診斷中的臨床應用價值。探討IGRA在陳舊性肺結核、痰涂片陽性、陰性和不同年齡結核病輔助診斷中的價值，結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 回顧性分析2015年6月至2016年6月首都醫科大學附屬北京胸科醫院、北京海淀醫院收治的確診結核患者130例，男77例，女53例，平均年齡(49.0±17.54)歲，其中肺結核112例(痰涂片菌陽性肺結核73例，痰涂片菌陰肺結核39例)，肺外結核18例；入選標準：所有病例均無結核病史，在抗結核治療前行T-SPOT.TB檢測；涂片抗酸桿菌陽性，MTB培養陽性，病理結果提示肉芽腫性炎伴凝固性壞死。符合典型結核病臨床及影像學表現，但未獲得病原學及病理學證實，疑似結核病患者經診斷經抗結核治療治愈隨訪觀察，臨床可排除其他非結核性疾病。陳舊肺結核組89例，男51例，女38例，平均年齡(53.0±18.52)歲，患者X線或CT表現為陳舊肺結核表現纖維化病變和鈣化。疾病對照為非結核組137例，來自北京市海淀醫院，男82例，女55例，平均年齡(57.0±14.37)歲: 病理結果明確為腫瘤、炎癥或其他疾病，且排除結核感染、陳舊肺結核、艾滋病毒感染等臨床診斷為其他疾病的患者，經相應治療或隨訪排除MTB感染，患者隨訪1年。

1.2T-SPOT.TB檢測 使用結核感染T細胞檢測試劑盒(免疫斑點法，英國OxfordImmunotec公司，批號：TEC009156)進行檢測，結果判定標準：①空白對照孔斑點數為0～5個時，任何1個檢測孔斑點數減去空白對照孔斑點數>6判定為陽性；②空白對照孔斑點數≥6時，任何1個檢測孔斑點數≥2倍空白對照孔斑點數判定為陽性。

1.3 痰涂片抗酸染色方法 痰標本采集：痰液留取參照中國防癆協會《結核病診斷細菌學檢驗規程》，無痰患者可采取霧化引痰或通過纖維支氣管鏡取痰，痰液不合格者，需進一步指導后重新留取標本送檢。痰涂片鏡檢：痰涂片按照《痰涂鏡檢標準化操作及質量保證手冊》的要求處理，采用萋-尼染色法鏡檢。

1.4 統計學方法 應用SPSS20.0進行統計學分析。組間率的比較采用χ2檢驗，采用診斷性試驗四格表計算敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1T-SPOT.TB對結核病的檢測 130例確診結核及137例非結核病例進行T-SPOT.TB檢測，結果顯示T-SPOT.TB對結核診斷的敏感度為82.307%，特異度為75.182%。見表1 。

表1 T-SPOT.TB對結核診斷結果(%)

2.2T-SPOT.TB對活動性結核病例、陳舊肺結核檢測 各組陽性率比較差異有統計學意義，與非結核組比較，活動性結核組及陳舊肺結核組陽性率明顯增高。見表2。

表2 T-SPOT.TB 在活動性結核和陳舊肺結核結果比較[例(%)]

注：χ2=7.580，P=0.032；與非結核組比較，P<0.05

2.3 活動性肺結核痰涂片和T-SPOT診斷比較 在診斷(包括確診和臨床診斷)為活動性肺結核病的112例患者中，73例經病原學證實為痰涂片菌陽性結核病，T-SPOT.TB檢測敏感度高于痰涂片，特異度低于痰涂片。見表3。

表3 痰涂片和T-SPOT.TB對肺結核診斷比較(%)

2.4 不同年齡T-SPOT.TB檢測 中青組(18～59歲)確診肺結核病例88例，非結核組病例86例，老年組(60～89歲)確診肺結核病例42例，非結核組51例，中青年組T-SPOT.TB檢測敏感度高于老年組。見表4。

表4 不同年齡結核感染T-SPOT.TB檢測結果比較(%)

2.5T-SPOT.TB診斷活動性肺結核 在診斷(包括確診和臨床診斷)為活動性肺結核的112例中，73例經病原學證實為痰涂片菌陽性結核病，其余39例為菌陰性結核病。T-SPOT.TB對菌陽和菌陰結核病檢測的敏感度及特異度比較差異無統計學意義。見表5。

表5 T-SPOT.TB診斷活動性肺結核比較(%)

3 討 論

結核病被列為我國重大傳染病之一，是嚴重危害人民群眾健康的呼吸道傳染病，僅活動性結核病患病率就高達459/10萬，且無癥狀肺結核患者比例明顯增加[3]。IGRAs作為一種快速、無創的診斷方法，是否可作為活動性結核的輔助診斷方法。尤其在我國這樣結核高感染、高發病率的國家，是否有對活動性結核病的輔助診斷意義尚不清楚[4]。目前國內需要更加廣泛的應用和評價。

IGRAs采用MTB的RDl區基因編碼抗原多肽作為特異性抗原，抗原成分主要有相對分子質量為6 000的早期分泌抗原靶(ESAT-6)和相對分子質量為10 000的培養濾液蛋白(CFP-10)抗原或抗原多肽，ESAT-6、CFP-l0抗原的蛋白編碼來源于MTB基因中的一個菌種特異性基因片段RD-1，而所有的BCG菌株和絕大多數非MTB(堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌和蘇爾加分枝桿菌除外)不含RD-1，因此該試驗有著較高的特異度，且不受是否接種卡介苗的影響。國外文獻報道，T-SPOT.TB在中/低收入國家診斷肺結核的綜合敏感度為82%～91%，特異度為61%～74%[5-6]。國內多數研究結果提示，T-SPOT.TB檢測對疑似肺結核的診斷敏感度為77%～95%，特異度為65.5%～85%[7-9]。本研究選擇了130例活動性結核患者，另選擇137例非結核患者作為對照。結果表明T-SPOT.TB檢測活動性結核病的敏感度和特異度為82.307%和75.182%，與文獻報道結果相似。本研究顯示在結核病高負擔，卡介苗廣泛接種的國家，IGRAs有較好的敏感度和特異度可以作為結核病輔助診斷手段。

IGRAs在陳舊肺結核患者中具體陽性率并不十分清楚，本研究探討IGRAs能否區別陳舊性肺結核和活動性結核，結果顯示IGRAs在陳舊肺結核陽性率51.69%，明顯高于非結核組，IGRAs在陳舊肺結核高陽性率與相關研究一致[10]。IGRAs在陳舊肺結核診斷的陽性率及假陽性率升高，導致陳舊肺結核誤診為活動性肺結核比例升高，故T-SPOT.TB不能很好區分陳舊肺結核和活動性肺結核。楊新婷等[11]應用ESAT-6和ESAT-6/CFP-10抗原刺激后，分泌IFN-γ量在菌陰性肺結核組和陳舊性肺結核組之間比較差異無統計學意義。只有ESAT-6/CFP-10抗原刺激后，分泌IFN-γ的量在菌陽性肺結核組和陳舊性肺結核組之間差異有統計學意義。說明在陳舊肺結核因感染過MTB，體內MTB特異的記憶T淋巴細胞，在體外再次受到MTB特異抗原的刺激時，會釋放分泌IFN-γ。在結核病高發國家，T-SPOT.TB在陳舊肺結核和結核潛伏感染陽性率是一致的[12]。故T-SPOT.TB無法區分陳舊肺結核與LTBI。陳舊肺結核陽性率較活動性結核病減低，主要因為參與結核細胞免疫應答的因子IFN-γ、TNF-p及IL4隨著病情的好轉顯著降低，隨著人體大量MTB被清除或者進入休眠狀態后，人體免疫應答水平可能相應降低。因此，32%～46%活動性肺結核患者在抗結核治療后檢測IGRAs轉陰性，陽性率下降[13-14]。所以在結核高發國家，應用IGRAs輔助診斷活動性肺結核，注意排除陳舊肺結核假陽性干擾。

本研究中以臨床診斷結核病為標準，T-SPOT.TB對肺結核檢測的敏感度高于痰涂片；T-SPOT.TB檢測的特異度低于痰涂片。由此可見，在肺結核診斷上，T-SPOT.TB檢測較痰涂片有著更高的敏感度。由于結核病是乙類傳染性疾病，應早期發現，早期隔離，減少疾病的傳播。與有癥狀的結核患者接觸及接觸時間是LTBI的危險因素，及時治療和隔離有癥狀的結核病患者可有效降低密切接觸者LTBI風險[15]。Anderson等[16]研究發現對結核患者及時治療與隔離是減少結核病播散的最好手段。T-SPOT.TB作為高敏感度的診斷輔助實驗避免臨床工作漏診結核病，減少結核病傳播有重大的意義。

與痰涂片比較T-SPOT.TB特異度降低主要原因可能為：IGRAs是基于檢測以MTB特異性抗原在體外刺激T細胞產生IFN-γ的原理為基礎的體外免疫診斷技術，判斷的是受檢宿主T細胞是否對MTB特異性抗原有記憶，因此其臨床意義為檢測機體是否感染過MTB。機體的免疫系統啟動了對MTB蛋白的免疫應答反應，對MTB產生了相應的記憶T細胞，當再次接觸相同蛋白(抗原)時，即會產生和釋放IFN-γ，IGRAs檢測呈現陽性結果。我國是結核病高負擔國家，2010年第五次全國結核病流行病學抽樣調查結果顯示，我國結核病患病率為459/10萬[17]，但我國感染MTB的人數卻超過5億，占總人口的44.5%，其中絕大多數是LTBI者[18]。當患者機體隱性感染時，免疫系統啟動了對MTB蛋白的免疫應答反應，故此我國特異度降低。痰涂片的高特異度，可以彌補T-SPOT.TB的低特異度，避免誤診。所以肺結核作為傳染性疾病，T-SPOT.TB高敏感度的診斷技術可以提高疾病診斷效率，減低漏診率。結核患者選擇全血IGRA輔助診斷結核病有著更高的價值，建議臨床推廣。

我國肺結核患者中老年患者比例高，且隨著年齡增加逐步增高，75～79歲達到高峰[17]。本研究中，T-SPOT.TB對老年肺結核病例的診斷敏感度78.57%，顯著低于中青年。提示在中青年人群中T-SPOT.TB具有較好的輔助診斷價值，在老年人群中診斷性能相對降低。Bae等[19]采用QuantiFERON-TBGoldIT試驗(QFT-GIT)和T-SPOT.TB兩種IGRA試驗方法檢測結核患者，研究發現低于29歲的患者QFT-GITT和SPOT.TB敏感度為93.3%和96.7%，70歲患者敏感度降為68.3%和86%。進行多因素分析發現，GFT-GIT敏感度與年齡有相關性，T-SPOT.TB與年齡并無明顯的相關性。可見隨著年齡增加，IGRA檢測敏感度下降，診斷效能降低。老年結核患者發病無典型癥狀，無癥狀者占28.7%。細菌學診斷結核病面臨諸多問題，老年肺結核患者痰涂片陽性率僅占31.9%～68.1%，而且不耐受創傷性檢測，確診率低。胸片輔助檢查不特異，PPD多呈一般陽性或陰性，強陽性僅占19.3%[20]。而吳研等[21]研究408例老年肺結核患者T-SPOT.TB檢測陽性檢出率高于痰涂片、痰培養和結核抗體檢測的陽性率，T-SPOT.TB診斷敏感度較其他檢查方法高，對于老年IGRAs的檢測結果應該謹慎解讀，需結合臨床癥狀和其他檢測結果綜合診斷。老年患者IGRAs檢測敏感度下降，可能與老年病例的免疫力下降、營養不良、合并癥增多等有關。隨著年齡的增長，機體免疫力逐漸下降，對結核抗原的應答能力也趨于下降，因此表現為結核抗原刺激后釋放IFN-γ的斑點數降低，甚至不反應[22-23]。

在涂陽肺結核患者中，全血IGRA檢測陽性率為94.52%；而在涂陰患者中，全血IGRA檢測陽性率為74.35%，而差異無統計學意義。與相關研究一致[24]。提示全血IGRA檢測可以將有助病原學陰性肺結核的診斷。

綜上所述，T-SPOT.TB檢測在臨床上可以作為結核病輔助診斷手段，敏感度提高有利于結核病診斷，避免漏診傳染源，不能區分陳舊肺結核與活動性結核病。對中青年疑似結核病病例具有更加突出的輔助診斷能力。對病原學陰性結核病提高診斷率。

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DiagnosticvalueofT-SPOT.TBinterferon-γreleaseassayfortuberculosis

TianRuixue1，MaLiping2，WuHongli1，HouHongyan1，ZhangLiping1

1.DepartmentofRespiratoryMedicine，BeijingHaidianHospital，BeijngHaidianSectionofPekingUniversityThirdHospital，Beijing10080，China; 2.SecondWardofTuberculosis，BeijingChestHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing101149，China

TianRuixue，Email：tianruixue2009@163.com

ObjectiveToevaluatethevalueofinterferon-gammareleaseassay(IGRA)indiagnosisoftuberculosis.MethodsThestudyrecruited130casesofactivetuberculosisclinicallyprovedfromBeijingChestHospital，and89casesofoldhealedtuberculosisand137casesofnon-TBpatientsfromBeijingHaidianHospital.T-SPOT.TBtestandfluorescencestainingbeforeanti-tuberculosistherapywereperformedinallpatients．Accordingtotheresultofthefluorescencestaining，thepatientswithtuberculosisweredividedintopositivegroupandnegativegroup.Accordingtotheage，thepatientsweredividedintoyoungergroupandelderlygroup.ThediagnosticperformanceofT-SPOT.TBwascompared.ResultsThesensitivityofthetuberculosisfromT-SPOT.TBdiagnosiswas82.307%，thespecificitywas75.182%.ThepositiveratesofT-SPOT.TBamongpulmonarytuberculosis，oldhealedtuberculosisandnon-TBpatientsweresignificantlydifferent(χ2=7.580，P=0.032).ThepositiverateofT-SPOT.TBinoldhealedtuberculosiswassignificantlyhigherthanthatofnon-TBpatients.Thesensitivityofpulmonarytuberculosiswas86.60%，thespecificityofT-SPOT.TBwas75.0%，thesensitivityofthefluorescencestainingwas65.17%，thespecificityofthefluorescencestainingwas98.33%.Thecomparisonbetweenthetworesultshadremarkablestatisticalsignificance(P<0.001).Thesensitivityoftheyoungergroupwasobviouslyhigherthanthatoftheeldergroup(χ2=4.782，P=0.029).ConclusionT-SPOT.TBismorequickandconvenient.Italsohasahighersensitivityandnegativepredictedvalue.T-SPOT.TBisamorevaluableauxiliarydiagnosistoyoungerpatients.Itcanbeusedinthediagnosisofsmearnegativepulmonarytuberculosispatientsandisnotrecommendedinidentifyingoldhealedtuberculosisandactivetuberculosis.

tuberculosis，pulmonary；interferon-gamma；enzyme-linkedimmunospotassay

田瑞雪，Email:tianruixue2009@163.com

R

A

1004-583X(2017)06-0507-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.06.014

2017-03-08 編輯:王秋紅